Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.
Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate che sono derivati dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo. La loro capacità unica di riassorbire sia le matrici organiche e inorganiche di osso significa che essi svolgono un ruolo chiave nella regolazione del rimodellamento scheletrico. Insieme, osteoblasti ed osteoclasti sono responsabili del processo di accoppiamento dinamico che coinvolge sia il riassorbimento osseo e la formazione ossea agendo insieme per mantenere lo scheletro normale durante salute e di malattia.
Poiché la cella di ossa riassorbimento principale del corpo, cambiamenti nella differenziazione o funzione osteoclasti possono provocare effetti profondi nel corpo. Malattie associate con la funzione degli osteoclasti alterata può variare in gravità da malattia neonatale letale a causa di fallimento per formare uno spazio osseo per emopoiesi, per osservare più comunemente patologie come l'osteoporosi, in cui un eccessivo riassorbimento osseo degli osteoclasti predispone alle fratture formazione.
ent "> La capacità di isolare osteoclasti in quantità elevata in vitro ha permesso significativi progressi nella comprensione del ciclo di rimodellamento osseo e ha aperto la strada per la scoperta di nuove strategie terapeutiche che combattere tali malattie.Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare osteoclasti da midollo osseo di topo che consentiranno di ottenere un gran numero di osteoclasti.
Il rimodellamento osseo è dinamico e prevede l'accoppiamento della formazione ossea con riassorbimento osseo 1. Questo processo strettamente regolato è responsabile del mantenimento dello scheletro durante omeostasi normale, e in risposta a lesioni e malattie.
Gli osteoclasti sono cellule multinucleate, unici che sono in grado di riassorbimento sia le matrici organiche e inorganiche di osso. Gli osteoclasti sono derivati dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo 2-5. Anomalie nella funzione o formazione di osteoclasti può provocare una varietà di patologie cliniche, incluse condizioni comuni come l'osteoporosi.
La capacità di generare osteoclasti in vitro ha permesso significativi progressi nella nostra comprensione della biologia dell'osso 6. Di conseguenza, i nuovi agenti terapeutici stanno emergendo per curare le malattie degli osteoclasti correlate che sono responsabili di morbilità e mortalità significative 7 </sup>. Manutenzione omeostatico della massa ossea e la forza richiede l'azione concertata degli osteoblasti che formano l'osso e osteoclasti che riassorbono l'osso 8,9. Osso omeostasi è alterata in un certo numero di malattie, compreso postmenopausale, in cui l'aumento dell'attività degli osteoclasti porta alla perdita patogenicità di massa ossea e densità 10. Con l'aumento della disponibilità di transgenici modelli murini di malattie umane, non vi è più possibilità di decifrare il ruolo degli osteoclasti nelle malattie delle ossa umane 11-13.
Numerosi protocolli per tecniche di coltura degli osteoclasti appaiono in letteratura, con molte varianti descritte 9,12,14. Xing e colleghi descrivono la metodologia simile al protocollo descritto di seguito, nella loro descrizione di saggi osteoclastogenico da cellule del midollo osseo di topo. Tuttavia, per liberare le cellule del midollo osseo seguenti raccolta delle ossa lunghe, Xing et al. Lavare la cavità midollare con α-MEM multimediale completo14. Catalfamo esamina l'effetto dell'iperglicemia sulla funzione degli osteoclasti e descrive un metodo in cui tutte le cellule mobilizzano midollo osseo lavaggio sono coltivate per 24 ore, a questo punto le cellule non aderenti sono scartati 12, una tecnica usata anche da Boyle et al . 9 Questi protocolli precedentemente pubblicati richiedono la pratica di lavaggio del midollo osseo, una pratica noiosa, che introduce anche il rischio di ferirsi e la perdita di preziose midollo osseo, come si deve tagliare entrambe le estremità dell'osso. Il protocollo, che descriveremo, implementa l'utilizzo di un mortaio e pestello per isolare osteoclasti, che è simile al metodo di isolamento macrofagi descritto da Weischenfeldt et al. 15
La nostra esperienza, tuttavia, è che l'isolamento degli osteoclasti e la coltura in vitro utilizzando tecniche precedentemente pubblicati dà risultati variabili in termini di produzione di osteoclasti, che spesso portain una incapacità di coltivare osteoclasti. Pertanto, abbiamo ideato un protocollo che consente l'isolamento uniforme del midollo osseo di topo per produrre un gran numero di osteoclasti multinucleate in vitro, con una resa approssimativa del 70-80% delle cellule inizialmente placcati formando macrofagi e successivamente osteoclasti, in presenza di mezzi di induzione degli osteoclasti.
La capacità di isolare facilmente e coltivare un gran numero di osteoclasti in vitro è stato responsabile per aver contribuito a promuovere la comprensione della biologia dell'osso e delle malattie degli osteoclasti-mediata. Era l'identificazione di RANKL che portano a questo, quando è stato recentemente identificato come il principale regolatore della formazione degli osteoclasti, differenziamento e la sopravvivenza 16-18.
E 'stata la nostra esperienza che…
The authors have nothing to disclose.
Riconosciamo il sostegno di borse di studio NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, della Fondazione Oak e il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |