Summary

Визуализация Номера для литическую экзоцитоза<em> Cryptococcus neoformans</em> От макрофагов с помощью цифровых световой микроскопии

Published: October 21, 2014
doi:

Summary

Мы опишем, как визуализировать macrophage- C. neoformans (Сп) взаимодействия в режиме реального времени, при этом особое внимание на процесс не-литической экзоцитоза с использованием цифровой световой микроскопии. Используя эту технику индивидуально зараженные макрофаги могут быть изучены, чтобы установить различные аспекты этого явления.

Abstract

Многие аспекты инфекции макрофагов по Cryptococcus neoformans были широко изучены и определены. Тем не менее, один частности взаимодействие, что не ясно понимать, не является литическую экзоцитоз. В этом процессе, дрожжевые клетки высвобождаются во внеклеточное пространство с помощью механизма плохо понимаемой, что оставляет как макрофаг и Сп жизнеспособным. Здесь мы опишем, как следовать большое количество индивидуально инфицированных макрофагов для 24 часами инфекции периода по времени истек микроскопии. Зараженные макрофаги расположены в нагревательной камере с CO 2 атмосферы, прикрепленной к микроскопом, который обеспечивает те же условия, как и культивирования клеток инкубатора. Онлайн цифровая микроскопия может предоставить информацию о динамических взаимодействий между организмом хозяина и возбудителем, недоступной из статических изображений. Будучи в состоянии визуализировать каждый инфицированной клетки могут дать ключи, чтобы, как макрофаги справиться с грибковыми инфекциями, и наоборот. Эта техника яса мощным инструментом в изучении динамики, которые находятся за сложного явления.

Introduction

Этапы грибковой инфекции между криптококковых клеток и макрофагов, хорошо документированы 1-3. После дрожжевые клетки поглощаются макрофагами, различные взаимодействия может произойти: макрофагов может лизировать выпуская его грибковой нагрузки во внеклеточное пространство, или он может контролировать инфекцию, сохраняя дрожжевых клеток в пределах своей клеточной мембраны 4. Тем не менее, несколько лет назад новый результат был описан независимо друг от друга две группы: не-литическую экзоцитоза, процесс, в котором макрофагов исключены некоторые или все из криптококковых клеток в окружающую среду или соседней соте, и оба хоста и возбудитель остаются жизнеспособными 5 -8. Несколько исследований пытались понять молекулярные механизмы, лежащие в этом взаимодействии, но мы до сих пор не имеют полное представление о том, что движет этим явлением.

Возможность захвата изображения в режиме реального времени, а затем впоследствии проанализировать несколько инфицироватьред макрофаги позволяет ответить на многие вопросы о физических свойствах окружающих не-литическую экзоцитоз в отношении сроков, пространственного потенциала, изменения в морфологии и даже стресс макрофагов во грибковой инфекции. По позволяя клеткам быть размещены в среде, которая сравнима с инкубатора, мы можем увидеть динамическую природу макрофагов-грибковые взаимодействий клеток. Исследователи использовали эту технику для изучения различных компонентов этого процесса. Роль фагосомы в этом процессе было сделано очевидным использованием флуоресцентного окрашивания и актин блокаторов 9, в то время как другая группа использовал этот метод, чтобы показать, что не-литический экзоцитоз был заблокирован в клетках, которые имели WASH нуклеирующий белковых доменов удален 10. Эффект цитокинов сигнализации также было установлено при помощи в режиме реального времени микроскопии 11. Этот процесс не ограничивается C. neoformans, как это наблюдалось также с Candida Albicans, соседнийг грибкового патогена, который имеет возможность инфицировать макрофаги 12. Эти данные приведены примеры, как этот метод может обеспечить большой объем информации в области, которую мы так мало знаем о.

Protocol

Все животное работа была сделана в соответствии с правилами и руководящими принципами Института исследования животных на колледже Альберта Эйнштейна медицины. 1. Условия рост C. neoformans H99 (Серотип) Вырастить индивидуальный C. neoformans (Сп) колонии на агаре Сабу…

Representative Results

Изображения что этот метод производит могут быть проанализированы в различных способов сбора информации, окружающий то, что происходит после того, как клетки фагоцитоза С. neoformans. Как видно на рисунке 1, существует примерно 100 макрофаги, которые либо зараженного или неинфи?…

Discussion

Здесь мы описали метод, посредством которого грибковые-макрофагов взаимодействия могут быть записаны и проанализированы в реальном времени в течение 24 час. Наша лаборатория использует этот протокол для изучения многих временных аспектов не-литической экзоцитоза и будет продолжать и…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было частично поддержана NIH наград 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733.

Materials

Sabouraud Dextrose Agar BD DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth BD DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) Corning Cellgro 10-013-CV
Fetal Calf Serum ( FCS)  Atlanta Biologicals S12450
NCTC 109 Invitrogen 21340-039
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
HEPES Buffer Corning Cellgro 25-060-Cl
Glutamax Invitrogen 35050-061
Non-essential Amino Acids Corning Cellgro 25-025-Cl
2-Mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes  Fisher Scientific  08772E
CellStripper Corning Cellgro 25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes MatTek P35GC-1.5-14-C
LPS Sigma L3137
Mouse IFN-g Roche NC 9222016
mAb 18B7        Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber Zeiss

References

  1. Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
  2. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
  3. Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
  4. Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
  5. Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
  6. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
  7. Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
  8. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
  9. Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
  10. Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
  11. Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
  12. Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).

Play Video

Cite This Article
Stukes, S., Casadevall, A. Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e52084, doi:10.3791/52084 (2014).

View Video