In vivo og in vitro oppdrett av Entomopathogenic nematoder (Steinernematidae og Heterorhabditidae)
Summary
Målet med denne presentasjonen er å vise in vivo og in vitro teknikker for oppdrett av entomopathogenic nematoder. In vivo metoder vurdere oppdrett av disse nematoder med et insekt vert, mens in vitro metoder utnytte rik agar medier.
Abstract
Entomopathogenic nematoder (UPN) (Steinernematidae og Heterorhabditidae) har en mutualistic samarbeid med Gram-negative Gamma-Proteobacteria i familien Enterobacteriaceae. Xenorhabdus bakteriene er assosiert med steinernematids nematoder mens Photorhabdus er symbionter av heterorhabditids. Sammen nematoder og bakterier danner en potent insekticid kompleks som dreper et bredt spekter av insektarter i en intim og spesifikk samarbeid. Heri viser vi in vivo og in vitro-teknikker som vanligvis anvendes ved oppdrett av disse nematoder under laboratorieforhold. Videre disse teknikkene representerer viktige skritt for vellykket etablering av EPN kulturer og også danne grunnlag for andre biologiske tester som utnytter disse organismene for forskning. Produksjonen av aposymbiotic (symbiont-free) nematoder er ofte avgjørende for en grundig og mangefasettert tilnærming til studiet av symbiose. Detteprotokollen krever ikke tilsetning av antibiotika, og kan oppnås i løpet av kort tid med standard laboratorieutstyr. Nematoder som produseres på denne måte er forholdsvis robuste, selv om deres overlevelse i lagring, kan variere avhengig av arten som brukes. Teknikkene er beskrevet i denne presentasjonen tilsvarer de som er beskrevet av ulike forfattere og raffinert av P. Stock Laboratory, University of Arizona (Tucson, Arizona, USA). Disse teknikkene er adskilt fra hoveddelen av teknikker som benyttes i masseproduksjon av disse organismene for skadedyrstyringsformål.
Introduction
Entomopathogenic nematoder (UPN) Steinernema og Heterorhabditis spp. (Steinernematidae, Heterorhabditidae) og deres bakterielle symbionter, Xenorhabdus og Photorhabdus spp (Enterobacteriaceae) er ansett som et emergent modell av terrestriske dyre mikrobe symbiotiske forhold 2-4,6,10,19. Xenorhabdus og Photorhabdus SPP. er næret som symbionter i tarmen av det eneste frittlevende stadium av nematoder, også kjent som den infeksiøs juvenile (IJ) eller 3. etappe infeksiøs juvenile 8,10,13. Bakterien-nematode paret er patogene for et bredt spekter av insekter og har med hell blitt implementert i biologisk bekjempelse og integrert plantevern ledelse programmer over hele verden 6,8.
Heri vi viser et utvalg av in vivo og in vitro-teknikker som er vanlige utøves for oppdrett av EPN under laboratorieforhold. In vivo metoder tenke et insekt vert for oppdrett av nematoder. Vanligvis er umodne stadier av ulike insekt bestillinger (dvs. Lepidoptera, Coleoptera, tovinger, etc.) Anses egnede verter. In vivo metoder er vanligvis betraktet for vedlikehold av nematode kulturer i laboratoriet. Denne metoden kan ikke være egnet når de vurderer masseproduksjon av nematoder. Store mengder insekt verter kan være nødvendig for dette formålet krever mer tid og ekstra kostnader knyttet til insekt oppdragelse.
Entomopathogenic nematoder kan også dyrkes in vitro ved flere medier. Avhengig av målet med studien, in vitro metoder kan eller vurdere inkorporering av det symbiotiske bakterier i media. I denne presentasjonen, beskriver vi to vanlige metoder for forplantning av EPN. Ingrediensene i media gi en kilde til næringsstoffer for det symbiotiske bakterien ennd en sterol kilde for nematoder. In vitro-metoder tilbyr fordelen oppdrett av EPN uten et insekt vert.
Opprinnelig ble mange av in vitro media utviklet brukes for multiplikasjon av EPN når egnede insekt verter er ikke tilgjengelig. Men de siste årene har in vitro oppdrettsmetodene blitt mye brukt i forskning som mål å forstå mutualistic forholdet mellom EPN og deres symbiotiske bakterier 17,19.
Teknikkene er beskrevet i denne presentasjonen tilsvarer de som er beskrevet av ulike forfattere og raffinert av Stock Laboratory, University of Arizona (Tucson, Arizona, USA). Disse teknikkene er adskilt fra hoveddelen av teknikker som benyttes i masseproduksjon av disse organismene for skadedyrstyringsformål.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med en egnet vert er en nøkkelfaktor for en vellykket in vivo oppdrett av EPN. Vanligvis kan både steinernematids og heterorhabditids reprodusere og fullføre sin livssyklus i larver av større voks møll, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Imidlertid kan andre insektarter fra forskjellige familier og / eller ordrer vurderes. Et par av de for tiden beskrevne nematode arter er kjent for å ha spesifisitet for et spesielt insekt-verten. For eksempel, S. kushidai og S. scarabaei<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke tidligere medlemmer av Stock lab: Ming-Min Lee, Kathryn Plichta, Victoria Miranda-Thompson og Sam-Kyu Kim for deres bidrag til forbedring av mange av disse protokollene. Dette arbeidet ble finansiert delvis av National Science Foundation Grant IOS-0840932 og IOS-0724978 til SP Stock
Materials
| Material | Company | Catalog Number | Comments |
| For in vivo Infections | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Filter Paper, 9 cm Grade 1 Cellulose | Whatman/VWR | 28450-081 | Grade 1 filter paper recommended |
| Insect hosts | Timberline | http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG | Galleria mellonella are recommended |
| For Liver-Kidney Agar (for 500 ml) | |||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | VWR | 25384-092 | |
| Beef Liver, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Beef Kidney, 50 g | Locally sourced; butcher or supermarket | Remaining may be stored frozen and thawed for future use | |
| Sodium Chloride 2.5g ( 0.5% final concentration ) | Acros/VWR | 200002-434 | any research grade NaCl can be used |
| Agar, 7.5 g (1.5% agar, final concentration) | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| 500 ml distilled H20 | |||
| For Lipid Agar (for 1 L) | |||
| 100 x 15 Petri Dishes | VWR | 25384-088 | |
| Nutrient Broth, 8 g | BD/VWR | 90002-660 | |
| Yeast Extract, 5g | EMD/VWR | EM1.03753.0500 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate, 10 ml (0.2g/ml) | EMD/VWR | EM-MX0045-1 | |
| Corn Oil, 4 ml | Any brand | Locally source; supermarket | Any brand of corn oil can be used |
| Corn Syrup, 96 ml combine 7 ml corn syrup in 89 ml heated H20 and swirl for homogeneity | Karo | Locally sourced; supermarket | |
| Agar, 15 g | HiMedia/VWR | 95026-642 | any media grade agar can be used |
| Distilled H20,890 ml |
References
- Akhurst, R. J. Morphological and functional dimorphism in Xenorhabdus spp., bacteria symbiotically associated with the insect pathogenic nematodes, Neoaplectana and Heterorhabditis. J. Gen. Microbiol. 121, 303-309 (1980).
- Dunphy, G. B., Webster, J. M. The monoxenic culture of Neoaplectana carpocapsae DD 136 and Heterorhabditis heliothidis. Revue Nematol. 12, 113-123 (1989).
- Boemare, N., Gaugler, R. Biology, taxonomy and systematics of Photorhabdus and Xenorhabdus. Entomopathogenic Nematology. , (2002).
- Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. The Prokaryotes. , 473-488 (2002).
- Ehlers, R. U., Wulff, A., Peters, A. Pathogenicity of axenic Steinernema feltiae. Xenorhabdus bovienii. and the bacto-helminthic complex to larvae of Tipula oleracea (Diptera) and Galleria mellonella (Lepidoptera). Journal Invertebrate Pathology. 69, 212-217 (1997).
- Gaugler, R., Kaya, H. K. . Entomopathogenic Nematodes in Biological Control. Boca. , (1990).
- Heungens, K., Cowles, C. E., Goodrich-Blair, H. Identification of Xenorhabdus nematophila genes required for mutualistic colonization of Steinernema carpocapsae nematodes. Molecular Microbiology. 45, 1337-1353 (2002).
- Kaya, H. K., Gaugler, R. Entomopathogenic nematodes. Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).
- Kaya, H. K., Stock, S. P., Lackey, L. A. Techniques in insect nematology. Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).
- Koppenhöfer, H., Nguyen, K. B., Hunt, D. J. Bacterial Symbionts of Steinernema and Heterorhabditis. Entomopathogenic Nematodes: Systematics, Phylogeny and Bacterial Symbionts. , 735-759 (2007).
- Lunau, S., Stoessel, S., Schmidt Peisker, A. J., Ehlers, R. U. Establishment of monoxenic inocula for scaling up in vitro cultures of the entomopathogenic nematodes Steinernema spp and Heterorhabditis spp. Nematologica. 39, 385-399 (1993).
- Orozco, R. A., Lee, M., Stock, S. P. Soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae). J. Vis. Exp. (89), (2014).
- Poinar, G. O. The presence of Achromobacter nematophilus in the infective stage of a Neoaplectana sp (Steinernematidae: Nematoda). Nematologica. 12, 105-108 (1966).
- Poinar, G. O., Thomas, G. M. Significance of Achromobacter nematophilus sp. nov. (Achromobacteriaceae: Eubacteriales) associated with a nematode. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 15, 249-252 (1966).
- Sicard, M., Brugirard-Ricaud, K., Pagès, S., Lanois, A., Boemare, N. E., Brehéli, M., Givaudan, A. Stages of infection during the tripartite interaction between Xenorhabdus nematophila, its nematode vector, and insect hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6473-6480 (2004).
- Sicard, M., Hinsinger, J., LeBrun, N., Pagès, S., Boemare, N., Moulia, C. Interspecific competition between entomopathogenic nematodes (Steinernema) is modified by their bacterial symbionts (Xenorhabdus). BMC Evolutionary Biology. 6, 68-78 (2006).
- Snyder, H., Stock, S. P., Kim, S. K., Flores-Lara, Y., Forst, S. New insights into the colonization and release processes of Xenorhabdus nematophila and the morphology and ultrastructure of the bacterial receptacle of its nematode host, Steinernema carpocapsae. Applied and environmental microbiology. 73, 5338-5346 (2007).
- Stiernagle, T., ed, C. .. e. l. e. g. a. n. s. .. W. o. r. m. B. o. o. k. .. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Stock, S. P., Goodrich-Blair, H., Lacey, L. A. Nematode parasites, pathogens and associated of insects and invertebrates of economic importance. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 373-426 (2012).
