Abstract
Apoplasten er et særskilt ekstracellulære rum i plantevæv, der ligger uden for plasmamembranen og omfatter cellevæggen. Den apoplastisk rum i planternes blade er stedet for flere vigtige biologiske processer, herunder cellevæg dannelse, cellulær næringsstoffer og vandoptagelse og eksport, plante-endofyt interaktioner og forsvar reaktioner på patogener. Den infiltration centrifugering metode er veletableret som en robust teknik til analyse af den opløselige apoplasten sammensætning af forskellige plantearter. Den ved denne metode fluid er almindeligt kendt som apoplast vaskefluid (AWF). Den følgende protokol beskriver en optimeret vakuum infiltration og centrifugering fremgangsmåde til AWF ekstraktion fra Phaseolus vulgaris (fransk bønne) cv. Tendergreen blade. Begrænsningerne i denne metode, og optimering af protokollen for andre plantearter diskuteres. Genvundne AWF kan anvendes i en bred vifte af downstream eksperimenterendets, der søger at karakterisere sammensætningen af apoplasten og hvordan det varierer som reaktion på plantearter og genotype, plante udvikling og miljømæssige forhold, eller at bestemme, hvordan mikroorganismer vokser i apoplast væske og reagere på ændringer i deres sammensætning.
Introduction
Anlægget apoplast er det intercellulære rum, der omgiver planteceller. Det er et dynamisk miljø, hvor mange metaboliske og transport processer foregår. Den største strukturelle komponent i apoplasten er cellevæggen, der er samlet og modificeret af enzymer, strukturelle proteiner og metabolitter placeret inden apoplasten. Hos raske planteceller apoplasten generelt holdes i en sur tilstand tillader aminosyrer, sukker og andre næringsstoffer, der skal importeres fra apoplasten til cytoplasmaet af H + symport 1. Under saccharose transport, saccharose bevæger sig fra fotosyntetiske kilder gennem apoplasten og ind phloem vaskulatur; saccharose derefter transporteres af en osmotisk potentiale vedligeholdes af apoplastiske invertaser spalter saccharose i vasken organer 2. Sukker og andre næringsstoffer kan også transporteres opad og akkumuleres i stomatale hulrum gennem transpiration strøm 3.
"> Apoplasten repræsenterer også en miljømæssig niche, hvor mange patogener etablere deres parasitiske livsstil. Bakterielle plantepatogener har evnen til at formere sig til høje densiteter i apoplasten, som de har adgang gennem naturlige åbninger såsom stomata eller gennem sår 4. Koncentrationen af amino syrer og andre kvælstofforbindelser i tomat apoplast har vist sig at være tilstrækkeligt til at understøtte de ernæringsmæssige krav, bakterie- og svampepatogener 5,6. Primære forsvar reaktioner overfor mikrobielle patogener også forekomme i apoplasten, nemlig produktion af reaktive ilt arter af ekstracellulære peroxidaser . og oxidaser og en styrkelse af cellevæggen gennem krydsbinding og callose deposition 7 Anlægget cellevæg er rig på sekundære metabolitter med antimikrobielle aktiviteter den biokemiske karakter af disse sekundære metabolitter varierer mellem arter 8.Som et resultat af den ovenfor omtaleed og andre processer, blad apoplastisk væske indeholder en række proteiner, sukkerarter, organiske syrer, aminosyrer, sekundære metabolitter, metaller og andre kationer (fx Mg2 +, K +, Na +, Ca2 +, Fe 2/3 +). Solut koncentrationer i apoplasten af skud styres i høj grad af den resterende del af transportprocesser forekommer mellem apoplasten og veddet, phloem og cytoplasma 9. Imidlertid metaboliske reaktioner og mikrobiel vækst også forbruge eller producerer apoplastiske opløste. Sammensætningen af apoplasten er kendt for at variere mellem plantearter og genotyper og som svar på ændrede miljøforhold, herunder lys, ernæring og biotisk og abiotisk stress 9. Ved at studere sammensætning apoplasten og hvordan det ændrer, herunder egenskaber, såsom redox og osmotisk potentiale, pH, næringsstoffer / metabolit tilgængelighed og enzymatiske aktiviteter, kan man få nye indsigt i, hvordan planter reoverens med deres miljø. Forståelse eller karakterisere de molekylære ændringer, der sker i apoplasten opløsningen er kompliceret, fordi det er en rumligt struktureret og dynamisk rum, hvor metabolitter og / eller ioner kan være flygtige, forbigående eller associeret med cellevæggen og plasmamembranen. Desuden er forskellige analytiske teknikker, der kræves for at dække de mange forskellige kemiske typer.
For at undersøge sammensætningen af det opløselige apoplasten, fluid skal normalt ekstraheres fra vævet. Der findes flere metoder til at udvinde apoplast fluid fra forskellige væv, herunder en nyligt foreslået filter strimmel fremgangsmåden 10, men mest etablerede ekstraktion metode til blade er infiltration-centrifugering. Denne teknik er blevet evalueret tidligere 11-13 og Lohaus et al., 2001 14 giver en grundig undersøgelse af mange af metodens tekniske parametre. Som det fremgår af navnet, infiltrationen-centrifugelse teknik er en to-trins metode, som omfatter i det væsentlige udskiftning af apoplastisk luftrum med en vandig infiltration væske, som blander sig med den native apoplastisk væske, efterfulgt af udvinding af infiltration / apoplastisk flydende blanding ved forsigtig centrifugering af bladene. Som den genvundne væske fortyndet og indeholder ikke alle forbindelser til stede i apoplasten (se nedenfor), er denne væske almindeligt kendt som apoplast vaskefluid (AWF) eller undertiden intercellulær vaskevæske, snarere end apoplastisk fluid. Den infiltration centrifugering teknik er let skalerbar tillader enkelt eller fælles analysedatabaser prøver af tilstrækkelig volumen, der skal frembringes og underkastes en bred vifte af downstream biokemiske og analytiske teknikker (fx protein elektroforese, måling enzymaktivitet, NMR, mange typer kromatografi og masse spektrometri). Leaf AWF er også nyttig som en apoplast efterligne vækstmedium for at studere interaktionen af anlægget koloniserer mikrober with deres miljø 5.
I de følgende protokoller beskriver vi, hvordan man udfører infiltrationen centrifugering teknik under anvendelse af Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen blade og give nogle eksempler på downstream analyser med fokus på metabolomics. Det er vigtigt, at metoder vurdere kvaliteten af AWF leveres sammen med rådgivning til at optimere proceduren for forskellige blade typer.
Protocol
BEMÆRK: Valget af udgangsmateriale bladmateriale og standardisering af plante vækstbetingelser er kritisk, da disse faktorer i høj grad kan påvirke kvaliteten, variation og udbytte af AWF (figur 1). Parametre at overveje, er vist i tabel 1 og er diskuteret mere detaljeret i diskussionen.
| Parameter | Eksempel standardiseringer | ||
| Phaseolus vulgaris | Solanum lycopersicum | Arabidopsis thaliana | |
| Leaf typen | Første løvblade, fuldt udbygget, sund | 2. og 3. blade startende fra bunden, 4 største foldere taget apikale folder ikke til apoplast udvinding | Fuldt ekspanderede roset blade |
| Plant alder | 21 dage | 7-9 weeks 7 uger | |
| Klokkeslæt | Midt i lys periode (12:00) | Midt i lys periode (12:00) | Midt i lys periode (12:00) |
| Hydration | Alle planter godt vandes 1 time før høst | Alle planter godt vandes 1 time før høst | Alle planter godt vandes 1 time før høst |
| Lys | 16 timers lys, 400 pmol m -2 sek -1 | 16 timers lys, 400 pmol m -2 sek -1 | 10 timers lys (kort dag) fra uge 2, 400 pmol m -2 sek -1 |
| Fugtighed | 70% | 70% | 70% |
| Temperatur | 22 ° C lys, 18 ° C mørke | 22 ° C lys, 18 ° C mørke | 21 ° C |
Tabel 1. Eksempler på standardiserede ParameTERS for blade, der anvendes i analysedatabaser ekstraktioner.
1. Generering apoplast vaskefluid
BEMÆRK: Under denne protokol farligt materila inculding mikrobielle patogener fra inficerede blade bør ikke vaskes ned drænet; bør anvendes temmelig korrekte procedurer bortskaffelse.
- Vælg apparat baseret på blad størrelse:
- Infiltrere mindre blade (f.eks Arabidopsis, bønne) under anvendelse af en nåleløs sprøjte. Brug en termokande at infiltrere blade, der er for stor til at passe i en sprøjte. Brug termokande metode til at infiltrere flere blade samtidigt.
- Opdel blade, der er for store til rådighed infiltration metode i mindre sektioner ved hjælp af et barberblad. Skyl skåret blad sektioner i destilleret vand før infiltration at fjerne cytoplasmatiske forureninger, der udstråler fra beskadigede celler.
- Leaf infiltration ved anvendelse af en 60 ml sprøjte:
- Tag bladet fraanlægget på stilk hjælp af et barberblad. For sammensatte blade såsom tomat, frigøre foldere på petiolule.
- Skyl frisk udskåret blad ved nedsænkning i destilleret vand for at fjerne blade overfladeforureninger. Tør bladet ved forsigtigt at duppe med absorberende væv eller papir.
- Mål blad vægt før infiltration.
- Rul forsigtigt og / eller folde bladet ind i en 60 ml sprøjte og fyld sprøjten med destilleret vand (andre infiltration væsker kan anvendes, se diskussionen). Skub nogen luft i sprøjten samtidig sænke stemplet til omtrent 40 ml mærket.
- Dæk sprøjtespidsen med enten en behandsket finger eller et stykke parafilm og derefter skabe undertryk inden i sprøjten ved at trække stemplet udad til 60 ml mærket. Slip langsomt stemplet.
BEMÆRK: Hurtigt frigive trykket kan resultere i cellelyse og cytoplasmatisk forurening. - Tag sprøjten og skubbe eventuel luft, Adskil derefter spidsen, og tryk påyderligere nedad i stemplet for at skabe et beskedent beløb af positivt tryk.
- Gentag trin 1.2.5 - 1.2.6, indtil bladet er fuldt infiltreret, set fra formørket farve infiltrerede områder.
- Fjern blad fra sprøjten. Forsigtigt, men grundigt skamplet bladet med absorberende papir for at fjerne overflade væske.
- Måle vægten af infiltreret blade. Beregn forskellen i vægt før og efter infiltration, som nærmest infiltration volumen.
- Leaf infiltration af termokande:
- Tag bladet fra anlægget på stilk hjælp et barberblad.
- Skyl frisk udskåret blad ved nedsænkning i destilleret vand for at fjerne blade overfladeforureninger. Tør bladet ved forsigtigt at duppe med absorberende papir.
- Mål blad vægt før infiltration.
- Placer bladet (eller blade hvis infiltrere flere blade) i en 250 ml eller større side arm kolbe containing destilleret vand (andre infiltration væsker kan anvendes, se diskussion). Fuldt ud dækker bladene med væsken.
- Påfør vakuum til kolben. Ryst forsigtigt for at frigøre luftbobler fra bladene. Forsigtigt og langsomt frigive vakuum.
BEMÆRK: Hurtigt frigive vakuumet kan resultere i cellelyse og cytoplasmatisk forurening. - Gentag trin 1.3.5, indtil bladet er fuldt infiltreret, set fra formørket farve infiltrerede områder.
- Fjern blad fra kolben. Forsigtigt, men grundigt skamplet bladet med absorberende papir for at fjerne overflade væske.
- Måle vægten af infiltreret blade. Beregn forskellen i vægt før og efter infiltration, som nærmest infiltration volumen.
- Inddrivelse af AWF ved centrifugering:
- Placer bladet på et stykke 4 tommer (10 cm) bred Parafilm. Anvendelse af en 5 ml pipette tip (eller en tilsvarende størrelse objekt),rulle bladet i Parafilm.
- Sæt oprullet blade med pipettespidsen i et 20 ml sprøjte. Placer Overskårne blad kanter opad. Sæt sprøjten i en ren 50 ml polyethylen eller polycarbonat rør.
- Centrifugeres sprøjten inden i røret i 10 minutter ved 1000 xg i en svingende spand rotor ved 4 ° C.
BEMÆRK: Visuel undersøgelse af bladene Efter centrifugering skulle afsløre, at størstedelen af infiltration væske er blevet udsendt. Mørkere grønne pletter viser, at der kræves yderligere centrifugering tid. - Pipette den genvundne AWF i frisk 1,5 ml rør.
BEMÆRK: Mængden af AWF bør tilnærmelsesvis matche infiltration volumen for at blade; hvis lydstyrken er mindre end ekstra centrifugering tid eller centrifugering hastighed er påkrævet. - Centrifuger analysedatabaser prøverne ved 15.000 xg i 5 min for at fjerne eventuelle celler eller partikler. Alternativt passere AWF gennem et 0,22 um filter til Remove celler og partikler.
- Pipette supernatanten til et frisk rør. Hold prøver på is indtil opbevaring.
- Opbevar analysedatabaser prøver ved -80 ° C.
2. Assays for Cytoplasmatisk Forurening
- Hold analysedatabaser prøverne på is for at minimere enzymatiske reaktioner (f.eks proteolyse) og udfører analyserne umiddelbart efter centrifugeringstrin er komplette.
BEMÆRK: metabolit analyser, kan prøverne straks nedfryses efter ekstraktion og opbevaret ved -80 ° C indtil brug. - For en standard malat-dehydrogenase (MDH) assayprotokol se 15; på anden måde bruge et kommercielt tilgængeligt MDH assay kit.
- For en standard glucose-6-phosphat-dehydrogenase (G6PDH) assayprotokol se 16; på anden måde bruge et kommercielt tilgængeligt G6PDH assay kit.
- Til kvantificering af cytoplasmatiske metabolitter, såsom glucose-6-phosphat (G-6-P) anvender GC-MS som beskrevet i trin 5
3. Beregning af apoplasten Dilution Factor
- Forbered to bind af infiltration væske anvendt ovenfor i trin 1.2.4 eller 1.3.4 (f.eks destilleret vand). Tilføj indigotin pulver til en opløsning til en endelig koncentration på 50 uM, føjer noget til den anden.
- Mål absorbans ved 610 nm (OD 610) på 200 pi af indigotin infiltration opløsning med en pladelæser. Ret denne værdi ved at fratrække OD 610 af 200 pi infiltration løsning uden indigokarmin. Stedfortræder dette korrigerede værdi som OD 610infiltrate i ligningen nedenfor.
- Udfør mindst tre gentagne blad infiltrationer som ovenfor (trin 1.2 eller 1.3) med både infiltration løsninger (med og uden indigo karminrød).
- Efter infiltration, rInse bladene i destilleret vand for at fjerne eventuelt resterende indigotin stede på de ydre overflader.
- Fortsæt med centrifugering som ovenfor (trin 1.4).
- Bestem den gennemsnitlige OD 610 af 200 pi af indigo carmine analysedatabaser ekstraktioner. Ret denne værdi ved at trække den gennemsnitlige OD 610 værdi på 200 pi indigokarmin gratis AWF. Stedfortræder dette korrigerede værdi som OD 610AWF i ligningen nedenfor.
- Beregn fortyndingsfaktoren (dvs. fold fortynding) fra de korrigerede absorbansværdier som:
Apoplast fortyndingsfaktor = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) - Multiplicer koncentrations- eller aktivitetsværdier fra AWF med fortyndingsfaktoren for at bedømme koncentrationen / aktivitet i apoplastisk væske i planta.
4. Koncentration af AWF til fuld styrke ved frysetørring
- Tænd frysetørrer ogllow det at stabilisere sig på arbejdsmiljøet temperatur og tryk.
- Pool den ønskede mængde friske eller lagrede analysedatabaser prøver.
- Fordel prøverne ligeligt mellem 2 ml centrifugerør.
- Bestem rekonstituering volumen:
Opløsning volumen = volumen før frysetørring / apoplast fortyndingsfaktor - Med lukket låg, fryse rørene i flydende nitrogen.
- Overfør frosne rør til en eller flere kølede frysetørringsmetoder fartøjer. Mens overføre rørene, låget med en, der er blevet stukket med en skarp genstand til at tillade gasudveksling.
- Fastgør fartøjerne til fryse-tørrere og lyofilisere prøverne helt.
- Fjern prøverne fra maskinen og rekonstituere analysedatabase ved tilsætning af den beregnede mængde destilleret vand.
- Sæt ikke-gennembrudte låg og opbevare prøverne ved -80 ° C.
5. metabolitanalyse ved gaskromatografi-massespektrometri 17
<ol>Representative Results
Typiske resultater for analysedatabaser ekstraktioner udført på sunde tre uger gamle P. vulgaris cv. Tendergreen blade, ved hjælp af destilleret vand som infiltration væske er vist i tabel 2. Young P. vulgaris blade er modtagelig for infiltration, og ved centrifugering hastighed anvendes her (1.000 xg) fjernelse af størstedelen af infiltration væske ved centrifugering kan ses direkte som bladene tilbage til deres oprindelige grønne farve. P. vulgaris blad frisk vægt var gennemsnitligt 1,1 xg før infiltration og gav 0,5 ml AWF per gram frisk vægt. Proteinkoncentrationen af AWF blev bestemt til at være 0,18 ± 0,08 mg / ml ved anvendelse af en standard Bradford protein assay. Fortyndingsfaktoren for disse blade, beregnet ved at måle indigocarmin fortynding, var 2,3 ± 0,3 gange. Ovenstående værdier kan variere betydeligt mellem arter og pilotforsøg er nødvendige for at bestemme udbyttet af AWF per gram blad frisk viight, samt AWF proteinkoncentration og fortyndingsfaktoren, som kan forventes for en given blade type.
Skader på integriteten af cellerne kan forekomme både under infiltration trin, hvis ændringer i trykket er for hurtig, og under centrifugeringen hvis centrifugalkraften er for høj. Det er derfor nødvendigt at analysere analysedatabaser prøver til markører for cytoplasmatisk forurening; Ideelt flere uafhængige assays. Her er resultaterne fra tre mulige analyser rapporteret i tabel 2. I veludførte ekstraktioner af P. vulgaris AWF, G6PDH var påvises ved en standard enzymassay. Dette er i overensstemmelse med andre rapporter, hvor G6PDH aktivitet bliver påviseligt kun over en tærskel centrifugalkraft 12. I modsætning hertil en baseline niveau af malatdehydrogenase aktivitet (2,5 U / ml) kunne påvises i alle P. vulgaris analysedatabaser prøver ved hjælp af en standard metabolisk assay. Forøgelse af centrifugalkraften force over en tærskel på 1.000 xg resulterede i øgede MDH aktiviteter (resultater ikke vist). Som apoplasten fra andre arter er kendt for at indeholde endogen MDH aktivitet 18, er det opdages her beløb betragtes som reel apoplastisk aktivitet og betydelige stigninger over denne baseline niveau er tegn på forurening. Metabolitter, der menes at være overvejende cytoplasmatisk, såsom hexose-6-phosphater kan også anvendes til at vurdere forurening af AWF. Her GC-MS analyse påvist nul eller spor af G-6-P i analysedatabaser ekstraktioner. Derimod i snit majs rod sektioner, G-6-P blev påvist efter AWF udvinding på alle centrifugering hastigheder og øget koncentration ved højere hastigheder, hvilket indikerer cytoplasmatisk forurening 10.
Metabolit analyse ved GC-MS af P. vulgaris blad AWF giver typisk 40-60 identificerbare metabolitter og en tilnærmelsesvis tilsvarende antal uidentificerbare forbindelser (figur 2). Ellerniske syrer, simple sukkerarter og aminosyrer udgør hovedparten af de identificerbare metabolitter har dog også fundet sekundære plantemetabolitter og kvantificeret fra AWF 11. Adskillige eksempel toppe fra disse forskellige molekyler klasser er mærket i figur 2 Længere nedstrøms analytiske teknikker for disse analysedatabaser prøver at kvantificere forskellige molekyler, for eksempel:. ICP-MS, NMR, HPLC, atomabsorptionsspektroskopi, protein massespektrometri.
Proteinet komponent i apoplasten er også repræsenteret i analysedatabase som vist i Coomassie Brilliant Blue farvede SDS-PAGE-gel i figur 3. Blandt andre roller, de apoplastiske enzymer er ansvarlige for syntesen af cellevæggen og oprettelsen af ekstracellulær reaktiv oxygenarter. Proteomiske undersøgelser af AWF fra forskellige arter har identificeret dusinvis af individuelle proteiner og vist, at proteinet komponent apoplasten reagerer på environmental stress 13,19. Ideelt AWF ekstrakt skal være fri for forurening med cytoplasmatiske proteiner såsom Rubisco; men i praksis er det vanskeligt at opnå. Tilstedeværelsen af en Rubisco proteinbånd på ~ 53 kDa efter SDS-PAGE giver en yderligere kvalitativ analyse for integriteten af analysedatabaser prøver. For eksempel prøven fyldt i bane 2 i figur 3 indeholder en større mængde af Rubisco forurening, af bane 1.
| Phaseolus vulgaris AWF | |
| Volumen af AWF (ml g -1 blad FW) | 0,49 ± 0,09 |
| Protein konc. (Mg ml -1) | 0,18 ± 0,08 |
| Fortyndingsfaktor | 2,3 ± 0,3 |
| G6PDH aktivitet (U ml-1) | |
| Glc-6-P (mg ml -1) | ingen opdaget |
| MDH aktivitet (U ml-1) | 2,5 ± 0,9 |
Tabel 2. Typiske resultater for analysedatabaser udtræk fra P. vulgaris cv. Tendergreen blade.
Figur 1. Standard apoplast udvinding workflow. Tallene henviser til trin i protokollen.
Figur 2. Et eksempel GC-MS kromatogram af P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF De nummererede eksempel metabolit toppe er: 1-malonat, 2-phosphat, 3-succinat, 4-ukendt, 5-malat, 6-asparagin, 7-ribitol (intern stAndard), 8-citrat, 9-glucose, 10-inositol, 11-kaffesyre, 12-saccharose.
Figur 3. Et eksempel SDS-PAGE Coomassie farvet gel af P. Vulgaris analysedatabaser bladekstrakter. Denne gel giver en sammenligning mellem de protein komponenter i to analysedatabaser ekstraktioner, der er forskellige i mængden af cytoplasmatiske forurening med den rigelige plastidial enzym Rubisco. Efter AWF ekstraktion begge prøver blev underkastet acetone proteinudfældning i en 4 ganges overskud (v / v) af kold acetone og resolubiliseres i vand ved en tiendedel af det oprindelige volumen. Bane 1 og 2 indeholder 40 ug protein. Båndet svarende til Rubisco stor kæde (~ 53 kDa) er angivet med en pil. M r: protein molekylvægtmarkører.
Discussion
Optimering plantevævet kilde
Biologiske og tekniske variation kan være store, når der udføres apoplast ekstraktioner, således en meget standardiseret arbejdsgang er nyttigt at øge kontinuitet på tværs eksperimenter (figur 1). Vigtigt er det, skal kilden til plantevæv standardiseres, herunder blad type blad alder, vækst / miljøforhold og tidspunkt på dagen (tabel 1). Der er store forskelle i den lethed, hvormed forskellige blade er infiltreret og AWF efterfølgende udvindes ved centrifugering; disse forskelle er korreleret med stomata nummer, blænde størrelse og mesophyll modstand 12,14. Selv blandt de forskellige sorter af P. vulgaris der er store forskelle i den lethed og udbyttet af AWF ekstraktionsprocedure; for eksempel blade af Tendergreen sorten her anvendte er mere modtagelig for AWF ekstraktion ved hjælp af denne metode, end den canadiske Wonder sort. IndenP. vulgaris de første løvblade er den største og den nemmeste at infiltrere, hvilket gør dem til det oplagte valg for apoplastiske ekstraktioner. Den apoplastisk luft og vandmængde har vist sig at variere med blade alder hos flere arter fører til forskelle i AWF ekstraherbarhed 12,14. I P. vulgaris, ældre blade bliver betydeligt vanskeligere at infiltrere og giver mindre AWF ved centrifugering; Derfor blade blev høstet, når de nåede fuld ekspansion. Blade, som er vanskelige at infiltrere efterfølgende kræve højere centrifugering hastigheder for at inddrive AWF. Man bør derfor nøje screene flere forskellige blade typer og sorter, før der træffes afgørelse om et væv kilde til stor skala analysedatabaser ekstraktioner.
Plant vækstbetingelser skal også standardiseres så meget som muligt inden for rammerne af eksperimentet. Brugen af vækstkabiner er at foretrække, da de tillader konsekvent fugtighed, temperatur og light intensitet regimenter skal opretholdes. Den høst af blade bør altid ske på samme tidspunkt af dagen, fordi koncentrationen af metabolitter, enzymer mv varierer i løbet af døgnets cyklus 14. Endelig, for at sikre, at anlægget efterlader alle har lignende saftspændingen bør planterne vandes snart før (~ 1 time) høsten.
Optimering af blad infiltration og centrifugering
Uønsket cytoplasmatisk forurening af AWF grund af delvis cellelysis vil resultere hvis den mekaniske belastning stødt af cellerne er for høj under gennemsivningsblokkene eller centrifugeringstrin. Derfor bør proceduren for en given blad typen være en optimeret afvejning mellem maksimering afkast og minimere cytoplasmatisk forurening af AWF. I alle tilfælde bør man bruge den laveste centrifugering hastighed, hvormed AWF kan udvindes for at undgå eventuel mekanisk afbrydelse af bladet celler. Optimering af centrifugelse hastighed skal bestemmes empirisk for hvert blad type ved overvågning af opsamlede rumfang og apoplasten forurening over et område af centrifugering hastigheder. Det er blevet observeret, at markør enzymaktiviteter, såsom MDH, G6PDH og glucose-phosphat-isomerase, forbliver lav, indtil en tærskel centrifugalkraft er overgået, over hvilken disse aktiviteter stige hurtigt, formodentlig på grund af cytoplasmisk lækage 9,12,14. Brugen af Parafilm for støtte under centrifugeringen, som påpeget af Baker et al. 2012 11, kan forbedre effektiviteten af AWF udvinding og kan minimere mekanisk beskadigelse af bladpladen forårsaget af overdreven foldning og kompression. Desuden er brugen af Parafilm forbedrer visualisering af bladet efter centrifugering, når man skal undersøge bladet for skader og fuldstændighed AWF ekstraktion.
Nouchi 12 beskriver optimeringen af AWF genrejsning skære ris blad sektioner, som er difficult at infiltrere og kræve højere centrifugering hastigheder at indsamle AWF grund af deres små stomatale åbninger. Forbedret befugtning af ris bladoverfladen, enten ved iblødsætning bladene i destilleret vand eller tilsætning af et overfladeaktivt middel til infiltration væske, lettet infiltration proces. En højere centrifugeringshastighed (6.000 xg) blev også anvendt under overvågning for apoplastisk forurening 12. Ved anvendelse cut blad sektioner er der altid risiko for, at cytoplasmiske forurening bliver mere udbredt, selv med omfattende vask af sårsteder; bør derfor kun bruges når det er nødvendigt afskårne blade.
For mange undersøgelser destilleret vand anvendes som infiltration fluid 11. Imidlertid kan forbindelser sættes til infiltration væske, såsom salte eller puffere for at forbedre udvindingen af visse apoplastiske forbindelser, især proteiner 13. Lohaus 14 evaluerede effekten af ioniske og osmotisk styrke on sammensætningen af genvundne AWF og fandt dem at være ubetydelig. Ændringer i pH af infiltration medium, dog kan påvirke AWF sammensætning 14.
Korrekt håndtering og opbevaring af den ekstraherede apoplastisk fluid er vigtig. AWF har vist sig at indeholde en overflod af proteaser og andre enzymer 13,20 samt flygtige organiske forbindelser. Derfor, for at reducere ændringer i sammensætningen af AWF efter genvinding anbefales det at opbevare prøver på is eller på anden måde opbevaret ved -80 ° C. Endvidere bør enzymatiske assays af AWF udføres så hurtigt som muligt efter ekstraktion at begrænse enzyminaktivering grund proteolyse langvarig fortynding eller fryse-optøning.
Processen med infiltration fortynder apoplastisk væske, og det er ofte nødvendigt at bestemme omfanget af denne fortynding. Centrifugeringen kan også fortynde AWF med vand fra intracellulære rum. En fortyndingsfaktor er behoved at vurdere in vivo apoplast kemiske koncentrationer, når der foretages målinger på AWF. En fortyndingsfaktor er også nødvendigt at koncentrere AWF tilbage til fuld styrke, når det bliver brugt som en apoplast efterligne vækstmedium for mikrober - hvilket svarer in vivo metabolitkoncentrationer så præcist som muligt. Der findes flere varianter af fremgangsmåden beskrevet i trin 4 for at bestemme AWF fortyndingsfaktor ved at måle fortyndingen af en markør forbindelse tilsættes til infiltration fluid metode. For alle metoder fortynding beregning af AWF ud fra, at infiltration væske ikke er mærkbart absorberes eller fortyndes med bladcellerne under AWF retableringen. Denne antagelse er tidligere blevet verificeret for infiltration trin 14, men er ubekræftet for centrifugering. Markøren Forbindelsen må heller ikke absorberes, transporteres eller modificeret, mens i apoplasten. Indigo carmin er den mest udbredte og gennemprøvet af farvestofferfor analysedatabaser fortynding beregninger. Indigocarminoploesningen viser en lav absorbans til kationbytterharpiks og isolerede cellevægge og blev vist at være egnet til analysedatabaser beregninger i Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum og Glycine max 11,21,22. Men i nogle blade typer, fx ris og agurk, indigo karminrød optrådte ikke fuldt tilbagebetalt efter infiltration, hvilket ville føre til en undervurdering af AWF fortyndingsfaktor 12,21. Den manglende genvinding af indigotin kan skyldes dens modtagelighed for spaltning i isatin sulfonat af superoxid 23, som er kendt for at blive produceret i apoplasten, især under stress 24. Spaltning af indigotin i isatin sulfonat vil resultere i et tab af absorbans ved 610 nm og en stigning på 245 nm. Hvorvidt denne reaktion forekommer mærkbart i apoplasten, eller om denne reaktion kan inhiberes ved tilsætning af superoxid scavengers at infiltration væske er ikke blevet undersøgt til dato. Blå dextran har været anvendt i stedet for indigokarmin for kvantificering af AWF fortyndingsfaktor på ris blade 12, selv om dens stabilitet og fremgang i AWF ikke er blevet rapporteret. Alternativt kan radiomærkede forbindelser, såsom [14 C] sorbitol eller andre målelige interne standarder anvendes i stedet for farvestoffer og faldet i radioaktivitet eller koncentrationen måles og anvendes til at beregne fortyndingsfaktoren på en analog måde 11,14,25.
Begrænsninger af teknikken
Et par advarsler findes for infiltration-centrifugering AWF isolation metode. For det første kan fortynding af apoplasten under infiltration fremkalde en reaktion fra anlægget. Hvis de omgivende bladceller detektere en formindsket koncentration for visse bestanddele af den apoplastisk fluid, kan de reagere ved at udskille yderligere metabolitter, fordreje fortolkningen af metabolitkoncentrationer. Iblev det observeret en vurdering af dette problem, som hverken tid mellem infiltration og centrifugering eller moderate forskelle i ionstyrke infiltration fluid påvirket sammensætningen af den ekstraherede AWF 14,22. Derfor, for at eventuelle artefakter som følge af apoplast fortynding menes være minimal.
En anden potentiel ulempe er, at eluering af AWF ved centrifugering ikke indfange alle molekylerne til stede i apoplasten af flere grunde. Nogle forbindelser, især kationer og proteiner kan være tæt forbundet med den negativt ladede cellevæg og ikke elueres med AWF 13. Andre molekyler, såsom proteiner, kan være for stor til at eluere effektivt ud af apoplasten ved centrifugeringshastigheder anvendte 14. Reaktive oxygenarter er en vigtig klasse af forbindelsen fremstillet i apoplasten, men på grund af kortvarig karakter af disse forbindelser, og uspecificerede krav til deres produktion, deres presence er ikke godt fanget af AWF ekstraktion. Det vides ikke, hvor nøjagtigt AWF repræsenterer in vivo sammensætning apoplasten væske og kan variere mellem arter.
Adskillige analyser findes til at bestemme cytoplasmatisk forurening, selv om ingen af dem er alment accepteret. Assays af overvejende cytoplasmiske enzymer (f.eks G6PDH, hexose phosphatisomerase, MDH) har fordelen af at være let at udføre, men kan ikke korrelerer godt med cytoplasmisk lækage 14,18. Vurderingen af cytoplasmatiske metabolitter (f.eks hexose fosfater, klorofyl) er måske mere vejledende, men er mindre veletableret 11. Alligevel kan enten type assay være nyttigt til relativ kvantificering af apoplastisk forurening mellem prøver. Ideelt set bør flere uafhængige målinger benyttes til at validere integriteten af AWF prøven.
Anerkender sine begrænsninger, infiltrationen-centrifugatipå teknik beskrevet her er en enkel og robust teknik i studiet af apoplastiske proteiner, primære og sekundære metabolitter og uorganiske ioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
References
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
