Abstract
Het apoplast een goede extracellulair compartiment plantenweefsels die ligt buiten het plasmamembraan en omvat de celwand. De apoplastische compartiment van de bladeren van de planten is de site van verschillende belangrijke biologische processen, waaronder celwandvorming, cellulaire voedingsstoffen en wateropname en export, planten-endofyt interacties en defensie reacties op ziekteverwekkers. De infiltratie-centrifugatie methode is goed gevestigd als een krachtige techniek voor de analyse van de oplosbare apoplast samenstelling van verschillende plantensoorten. De volgens deze methode verkregen fluïdum bekend als apoplast wasvloeistof (AWF). Het volgende protocol beschrijft een geoptimaliseerde vacuüm infiltratie en centrifugeren methode voor AWF extractie uit Phaseolus vulgaris (Franse bonen) cv. Tendergreen bladeren. De beperkingen van deze methode en de optimalisatie van het protocol voor andere plantensoorten worden besproken. De teruggekregen AWF kunnen worden gebruikt in een breed scala van downstream Experiments die proberen de samenstelling van de apoplast karakteriseren en hoe ze varieert in reactie op plantensoorten en genotype, plantenontwikkeling en milieuomstandigheden, of om te bepalen hoe organismen groeien apoplast vloeistof en reageren op veranderingen in de samenstelling.
Introduction
De plant apoplast is de intercellulaire ruimte die plantencellen omringt. Dit is een dynamische omgeving waarin veel metabole en transportprocessen plaatsvinden. De belangrijkste structurele component van de apoplast de celwand, dat is gemonteerd en gemodificeerd door enzymen, structurele eiwitten en metabolieten zich in de apoplast. Bij gezonde plantencellen de apoplast wordt over het algemeen gehandhaafd in een zure toestand waardoor aminozuren, suikers en andere voedingsstoffen uit de apoplast te importeren naar het cytoplasma door H + symport 1. Tijdens sucrose vervoer, sucrose moves uit fotosynthetische bronnen via de apoplast en in floëem vaatstelsel; sucrose wordt vervolgens getransporteerd door een osmotische potentieel onderhouden door apoplast invertasen splitsen sucrose in de gootsteen organen 2. Suikers en andere voedingsstoffen opwaarts getransporteerd en accumuleren in stomatale holten transpiratie stroom 3.
"> De apoplast vertegenwoordigt ook een ecologische niche waar veel pathogenen stellen hun parasitaire levensstijl. Bacteriële plantpathogenen de mogelijkheid te vermenigvuldigen tot hoge dichtheden in de apoplast, die hun in natuurlijke openingen zoals stomata of door wonden 4. De concentratie van amino zuren en andere stikstofverbindingen in tomaat apoplast bleken voldoende om de voedingsbehoeften van bacteriële en fungale pathogenen 5,6 te kunnen dragen. Primaire afweerreacties tegen microbiële pathogenen komen ook in de apoplast, namelijk de productie van reactieve zuurstof species extracellulair peroxidasen . en oxidasen en de versterking van de celwand door middel van cross-linking en callose depositie 7 De plant celwand is rijk aan secundaire metabolieten met anti-microbiële activiteiten; de biochemische aard van deze secundaire metabolieten varieert tussen soorten 8.Als gevolg van de hierboven vermelded en andere processen, blad apoplastische vloeistof bevat verschillende eiwitten, suikers, organische zuren, aminozuren, secundaire metabolieten, metalen en andere kationen (zoals Mg2 +, K +, Na +, Ca2 +, Fe 2/3 +). Opgeloste stof concentraties in de apoplast van scheuten worden grotendeels gecontroleerd door het saldo van transport processen die zich voordoen tussen de apoplast en het xyleem, floëem en cytoplasma 9. Echter, metabolische reacties en microbiële groei ook te consumeren of produceren apoplastische opgeloste stoffen. De samenstelling van de apoplast is bekend dat verschillen plantensoorten en genotypes en als reactie op omgevingsfactoren zoals licht, voeding en biotische en abiotische stress 9 verandert. Door het bestuderen van de samenstelling van de apoplast en hun wijzigingen, zoals eigenschappen zoals redox- en osmotische potentiaal, pH, nutriënten / metaboliet beschikbaarheid en enzymactiviteiten, kan men nieuwe inzichten in hoe planten re krijgenspond aan hun omgeving. Inzicht of karakteriseren van de moleculaire veranderingen die optreden in de apoplast oplossing is gecompliceerd omdat het een ruimtelijk gestructureerde en dynamische compartiment waarin metabolieten en / of ionen vluchtige, voorbijgaande of geassocieerd met de celwand en plasma membraan kan zijn. Bovendien worden verschillende analytische technieken vereist om alle verschillende chemische typen bestrijken.
De samenstelling van het oplosbare apoplast bestuderen fluïdum heeft meestal uit het weefsel te extraheren. Verschillende methoden bestaan uittreksel apoplast fluïdum uit verschillende weefsels, waaronder een nieuw voorgestelde filter strookmethode 10, maar de meest gevestigde extractiemethode voor bladeren infiltratie-centrifugatie. Deze techniek is eerder geëvalueerd 11-13 en Lohaus et al. 2001 14 zorgen voor een grondig onderzoek van vele van de technische parameters van de methode. Zoals geïmpliceerd door de naam, de infiltratie-centrifugaleking techniek Twee-staps werkwijze die in wezen omvat de vervanging van de apoplastische luchtruim met een waterige infiltratie vloeistof, die mengt met de natieve apoplastische vloeistof, gevolgd door herstel van de infiltratie / apoplastische fluïdummengsel door voorzichtig centrifugeren van de bladeren. Omdat de teruggewonnen vloeistof verdund en niet alle verbindingen in de apoplast (zie hieronder) bevat, wordt deze vloeistof bekend als apoplast wasvloeistof (AWF), of soms intercellulaire wasvloeistof, plaats apoplastische vloeistof. De infiltratie centrifugeren techniek gemakkelijk schaalbaar zodat één of gepoolde AWF monsters voldoende volume te genereren en aan diverse downstream biochemische en analytische technieken (bijvoorbeeld proteïne elektroforese enzymactiviteit metingen, NMR, vele soorten chromatografie en massa spectrometrie). Blad AWF is ook nuttig als een apoplast nabootsen groeimedium voor het bestuderen van de interactie van planten koloniseren microben with hun omgeving 5.
In de volgende protocollen beschrijven we hoe de infiltratie-centrifugeren techniek uit te voeren met behulp van Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen bladeren, en bieden een aantal voorbeelden van de downstream-analyses met een focus op metabolomics. Belangrijker nog, methoden ter beoordeling van de kwaliteit van de AWF zijn voorzien, samen met advies om de procedure voor de verschillende blad types te optimaliseren.
Protocol
OPMERKING: De keuze van uitgangsmateriaal bladmateriaal en standaardisatie van plantengroei omstandigheden is kritisch omdat deze factoren grote invloed hebben op de kwaliteit, variabiliteit en opbrengst van AWF (figuur 1). Parameters overwegen zijn weergegeven in Tabel 1 en worden in meer detail in de discussie.
| Parameter | Bijvoorbeeld normeringen | ||
| Phaseolus vulgaris | Solanum lycopersicum | Arabidopsis thaliana | |
| Bladtype | Eerste echte bladeren, volledig uitgebreid, gezond | 2 e en 3 e bladeren vanaf bodem, 4 grootste folders genomen apicale bijsluiter niet gebruikt voor apoplast extractie | Volledig uitgebreid rozetbladeren |
| Plant leeftijd | 21 dagen | 7-9 weken 7 weken | |
| Tijd van de dag | Midden van het licht periode (12:00) | Midden van het licht periode (12:00) | Midden van het licht periode (12:00) |
| Hydratatie | Alle planten goed bewaterd 1 uur vóór de oogst | Alle planten goed bewaterd 1 uur vóór de oogst | Alle planten goed bewaterd 1 uur vóór de oogst |
| Licht | 16 uur licht, 400 umol m -2 s -1 | 16 uur licht, 400 umol m -2 s -1 | 10 uur licht (korte dag) van week 2, 400 umol m -2 s -1 |
| Vochtigheid | 70% | 70% | 70% |
| Temperatuur | 22 ° C licht, 18 ° C donker | 22 ° C licht, 18 ° C donker | 21 ° C |
Tabel 1. Voorbeelden van gestandaardiseerde parameters voor het bladeren gebruikt in AWF extracties.
1. Het genereren apoplast Wassen Fluid
OPMERKING: Tijdens dit protocol gevaarlijke materila inculding microbiële ziekteverwekkers uit geïnfecteerde bladeren moeten niet worden gewassen in de afvoer; liever de juiste procedures ter beschikking moeten worden gebruikt.
- Kies apparaten gebaseerd op bladgrootte:
- Infiltreren kleinere bladeren (bijvoorbeeld Arabidopsis, bonen) met behulp van een naaldloze injectiespuit. Gebruik een thermoskan te bladeren die te groot zijn om te passen in een spuit zijn infiltreren. Gebruik de thermoskan methode om meerdere blaadjes tegelijk infiltreren.
- Verdeel bladeren die te groot is voor de beschikbare infiltratiemethode in kleinere secties met een scheermesje zijn. Spoel grondig gesneden blad secties in gedestilleerd water voorafgaand aan de infiltratie te cytoplasmatische verontreinigingen die uitstralen van beschadigde cellen te verwijderen.
- Blad infiltratie met een injectiespuit 60 ml:
- Maak het blad van defabriek in de bladsteel met een scheermesje. Voor samengestelde bladeren zoals tomaat, los folders bij de petiolule.
- Spoel de vers gesneden blad door onderdompeling in gedestilleerd water om bladoppervlak verontreinigingen te verwijderen. Droog de bladeren door zachtjes te deppen met absorberend tissue of papier.
- Meet het blad gewicht vóór infiltratie.
- Zorgvuldig te rollen en / of vouw het blad in een spuit van 60 ml en vul de spuit met gedestilleerd water (andere infiltratie vloeistoffen kunnen worden gebruikt, zie bespreking). Uitwerpen eventuele lucht uit de injectiespuit terwijl het verlagen van de zuiger tot ongeveer de 40 ml markering.
- Bedek de spuit met ofwel een gehandschoende vinger of een stuk Parafilm, maak dan onderdruk in de spuit door naar buiten te trekken op de zuiger om de 60 ml markering. De zuiger langzaam los.
OPMERKING: snel aflaten van de druk kan leiden tot cellysis en cytoplasmatische verontreiniging. - Haal de stekker van de spuit en verwijder eventuele lucht, replug dan is de tip in en druk opverder beneden de zuiger een bescheiden hoeveelheid positieve druk te creëren.
- Herhaal stap 1.2.5 - 1.2.6 totdat het blad volledig geïnfiltreerd, zoals gezien door de donkere kleur van het geïnfiltreerde gebieden.
- Verwijder het blad van de spuit. Grondig, maar voorzichtig deppen het blad met absorberend papier aan de oppervlakte vloeistof te verwijderen.
- Meet het gewicht van het geïnfiltreerde blad. Bereken het verschil in gewicht voor en na infiltratie die overeenstemt met de infiltratie volume.
- Blad infiltratie door thermoskan:
- Maak de bladeren van de plant op de bladsteel met een scheermesje.
- Spoel de vers gesneden blad door onderdompeling in gedestilleerd water om bladoppervlak verontreinigingen te verwijderen. Droog de bladeren door zachtjes te deppen met absorberend papier.
- Meet het blad gewicht vóór infiltratie.
- Plaats het blad (of verlaat als infiltreren meerdere bladeren) in een 250 ml of groter zijarm fles containing gedestilleerd water (andere infiltratie vloeistoffen kunnen worden gebruikt, zie bespreking). Volledig te dekken de bladeren met de vloeistof.
- Breng een vacuüm aan de kolf. Schud voorzichtig om de luchtbellen los van de bladeren. Voorzichtig en langzaam het vacuüm op te heffen.
OPMERKING: snel loslaten van de onderdruk kan tot cellysis en cytoplasmatische verontreiniging. - Herhaal stap 1.3.5 totdat het blad volledig geïnfiltreerd, zoals gezien door de donkere kleur van het geïnfiltreerde gebieden.
- Verwijder het blad uit de kolf. Grondig, maar voorzichtig deppen het blad met absorberend papier aan de oppervlakte vloeistof te verwijderen.
- Meet het gewicht van het geïnfiltreerde blad. Bereken het verschil in gewicht voor en na infiltratie die overeenstemt met de infiltratie volume.
- Herstel van AWF door centrifugeren:
- Plaats het blad op een stuk van 4 inch (10 cm) breed Parafilm. Met behulp van een 5 ml pipet tip (of een vergelijkbaar object ter grootte),oprollen het blad binnen de Parafilm.
- Plaats de opgerolde blad met pipet in een spuit van 20 ml. Plaats alle gesneden bladranden naar boven. Breng de spuit in een schone 50 ml polyetheen of poly- carbonaat.
- Centrifugeer de spuit in de buis gedurende 10 min bij 1000 xg in een swinging bucket rotor bij 4 ° C.
OPMERKING: Visueel onderzoek van de bladeren volgende centrifugeren moet blijken dat de meerderheid van de infiltratie fluïdum wordt uitgedreven. Donkerder groene plekken aan te geven dat extra centrifugeren tijd nodig is. - Pipetteer de herstelde AWF in de frisse 1,5 ml buizen.
Opmerking: Het volume van analysebestand moet ongeveer overeenkomen met de infiltratie volume dat blad; Als het volume kleiner dan extra centrifugatie tijd of centrifugeersnelheid vereist. - Centrifugeer de AWF monsters bij 15.000 xg gedurende 5 minuten om alle cellen of deeltjes te verwijderen. Als alternatief, passeren de AWF door een 0,22 pm filter aan remove cellen en fijnstof.
- Pipetteer het supernatant in een nieuwe buis. Houd monsters op ijs tot opslag.
- Bewaar de AWF monsters bij -80 ° C.
2. Assays voor cytoplasmatische besmetting
- Houd de AWF monsters op ijs te enzymatische reacties (bijv proteolyse) te minimaliseren en het uitvoeren van de testen onmiddellijk na het centrifugeren stappen zijn voltooid.
LET OP: Voor metaboliet assays, kunnen de monsters bevroren na extractie en opgeslagen bij -80 ° C tot gebruik. - Voor een standaard malaatdehydrogenase (MDH) assay protocol zie 15; anderszins gebruik maken van een in de handel verkrijgbaar MDH testkit.
- Voor een standaard glucose-6-fosfaatdehydrogenase (G6PDH) testprotocol zien 16; anderszins gebruik maken van een in de handel verkrijgbaar G6PDH testkit.
- Voor kwantificering van cytoplasmatische metabolieten zoals glucose-6-fosfaat (G-6-P) gebruiken GC-MS zoals beschreven in stap 5
3. Berekening van de apoplast Verdunningfactor
- Bereid twee volumes van de infiltratie vloeistof bovenstaande gebruikt in stap 1.2.4 of 1.3.4 (bv gedestilleerd water). Voeg indigokarmijn poeder een oplossing tot een eindconcentratie van 50 uM, niets toevoegen aan de andere.
- Meet de absorptie bij 610 nm (OD 610) 200 gl van het indigokarmijn infiltratie oplossing met een plaatlezer. Corrigeer deze waarde door het aftrekken van de OD 610 van 200 ul van infiltratie oplossing zonder indigokarmijn. Vervangen deze gecorrigeerde waarde als OD 610infiltrate in de onderstaande vergelijking.
- Voer tenminste drie gelijke blad infiltraties hierboven (stap 1.2 of 1.3) met beide infiltratie oplossingen (met en zonder indigokarmijn).
- Na infiltratie, rInse de bladeren in gedestilleerd water om de resterende indigokarmijn aanwezig op de buitenoppervlakken verwijderen.
- Ga door centrifugeren zoals hierboven beschreven (stap 1.4).
- Bepaal de gemiddelde OD 610 van 200 ul van de indigocarmine AWF extracties. Corrigeer deze waarde door het aftrekken van de gemiddelde OD 610 waarde van 200 ul indigocarmine gratis AWF. Vervangen deze gecorrigeerde waarde als OD 610AWF in de onderstaande vergelijking.
- Bereken de verdunningsfactor (dwz voudige verdunning) van de gecorrigeerde absorptie waarden als:
Apoplast verdunningsfactor = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) - Vermenigvuldig concentratie of activiteit waarden uit AWF door de verdunningsfactor in te schatten van de concentratie / activiteit in apoplastische vloeistof in planta.
4. Concentratie van AWF op volle sterkte door vriesdrogen
- Zet de vriesdroger enlg het stabiliseren bij de werktemperatuur en de druk.
- Verzamel de gewenste hoeveelheid vers of opgeslagen AWF monsters.
- Verdeel de monsters gelijkmatig onder de 2 ml centrifugebuis.
- Bepaal het reconstitutievolume:
Reconstitutievolume = volume vóór vriesdrogen / apoplast verdunningsfactor - Bij gesloten deksels, bevriezen de buizen in vloeibare stikstof.
- Breng de bevroren buizen één of meer gekoelde vriesdrogen schepen. Tijdens het overbrengen van de buizen, vervang het deksel met een die is doorboord met een scherp voorwerp om de gasuitwisseling mogelijk te maken.
- Bevestig de schepen aan de vriesdroger en volledig lyofiliseren de monsters.
- Verwijder de monsters uit de machine en los het AWF door het toevoegen van de berekende hoeveelheid gedestilleerd water.
- Plaats het unpierced deksel en bewaar de monsters bij -80 ° C.
5. metabolietanalyse met gaschromatografie massaspectrometrie 17
<ol>Representative Results
Typische resultaten voor AWF extracties uitgevoerd op gezonde 3 week oud P. vulgaris cv. Tendergreen bladeren, met gedestilleerd water als de infiltratie fluïdum worden in tabel 2. Young P. vulgaris bladeren zijn vatbaar voor infiltratie en de centrifugeersnelheid hier gebruikte (1.000 xg) het verwijderen van de meerderheid van infiltratie vloeistof door centrifugering direct kan worden gezien als het blad terug naar hun oorspronkelijke groene kleur. P. vulgaris blad vers gewicht was gemiddeld 1,1 xg voor infiltratie en leverde 0,5 ml AWF per gram versgewicht. De eiwitconcentratie van de AWF werd bepaald 0,18 ± 0,08 mg / ml met een standaard Bradford eiwitassay. De verdunningsfactor voor deze bladeren, berekend door het meten van indigocarmine verdunning, was 2,3 ± 0,3 maal zo hoog. De bovenstaande waarden kan sterk variëren tussen soorten en modelexperimenten moeten de opbrengst van AWF per gram vers blad bepalen weechts, evenals de AWF eiwitconcentratie en verdunningsfactor die kunnen worden verwacht voor een gegeven bladtype.
Schade aan de integriteit van de cellen kunnen zowel ontstaan tijdens het infiltreren stap, indien de veranderingen in druk te snel, en tijdens het centrifugeren stap als de middelpuntvliedende kracht te hoog. Het is daarom noodzakelijk om AWF monsters testen op markers van cytoplasmatische besmetting; idealiter worden meerdere onafhankelijke assays uitgevoerd. Hier de resultaten van drie mogelijke tests worden in tabel 2. In goed uitgevoerde extracties P. vulgaris AWF, G6PDH was niet op te sporen door een standaard enzym assay. Dit is consistent met andere rapporten waarin G6PDH activiteit detecteerbaar slechts boven een drempel centrifugaalkracht 12. Daarentegen, een basisniveau van malaat dehydrogenase activiteit (2,5 U / ml) werd gedetecteerd in alle P. vulgaris AWF monsters met behulp van een standaard metabole test. Verhoging van de centrifugale voorce boven een drempelwaarde van 1000 xg tot een toename MDH activiteiten (resultaten niet getoond). Zoals de apoplast van andere soorten is bekend dat endogene MDH activiteit 18 bevatten, is het hier gedetecteerde hoeveelheid beschouwd als echte apoplastische activiteit en een aanzienlijke stijging boven dit basisniveau zijn een indicatie van besmetting. Metabolieten die geacht overwegend cytoplasmatisch zijn, zoals hexose-6-fosfaat kunnen ook worden gebruikt om verontreiniging van AWF beoordelen. Hier, GC-MS-analyse gedetecteerd nul of sporen niveaus van G-6-P in AWF extracties. Daarentegen in gesneden maïs wortel secties, G-6-P werd ontdekt na AWF extractie helemaal centrifugeren snelheden en een verhoogde concentratie bij hogere snelheden, wat aangeeft cytoplasmatische verontreiniging 10.
Metaboliet analyse door GC-MS van P. vulgaris blad AWF levert typisch 40-60 identificeerbaar metabolieten en een ongeveer gelijk aantal identificeerbare verbindingen (figuur 2). Ofganische zuren, eenvoudige suikers en aminozuren vertegenwoordigen het grootste deel van de identificeerbare metabolieten echter secundaire plantenmetabolieten zijn ook gedetecteerd en gekwantificeerd van AWF 11. Verscheidene voorbeeld pieken uit deze verschillende klassen moleculen worden gelabeld in Figuur 2 Stroomafwaarts analytische technieken die op deze AWF monsters te kwantificeren verschillende moleculen, zoals:. ICP-MS, NMR, HPLC, atomaire absorptie spectroscopie, eiwit massaspectrometrie.
De eiwitcomponent van de apoplast wordt vertegenwoordigd in de AWF zoals in de Coomassie Briljant Blue gekleurde SDS-PAGE gel in figuur 3. Onder andere functies, de apoplast enzymen verantwoordelijk voor de synthese van de celwand en de vorming van extracellulaire reactieve zuurstofradicalen. Proteoom studies AWF uit verschillende soorten tientallen afzonderlijke eiwitten geïdentificeerd en aangetoond dat het eiwitbestanddeel van de apoplast reageert Environmental spanning 13,19. Idealiter AWF extract moet vrij zijn van verontreinigingen door cytoplasmatische eiwitten zoals Rubisco; echter in de praktijk moeilijk te realiseren. De aanwezigheid van een Rubisco eiwitband bij ~ 53 kDa na SDS-PAGE geeft een verdere kwalitatieve test voor de integriteit van AWF monsters. Bijvoorbeeld, de in laan 2 geladen in figuur 3 monster bevat een grotere hoeveelheid Rubisco contaminatie die van baan 1.
| Phaseolus vulgaris AWF | |
| Volume van AWF (ml g -1 blad FW) | 0,49 ± 0,09 |
| Protein conc. (Mg ml-1) | 0,18 ± 0,08 |
| Verdunningsfactor | 2.3 ± 0.3 |
| G6PDH activiteit (U ml-1) | |
| Glc-6-P (mg ml-1) | none gedetecteerd |
| MDH activiteit (U ml-1) | 2,5 ± 0,9 |
Tabel 2. Typische resultaten voor AWF extracties van P. vulgaris cv. Tendergreen bladeren.
Figuur 1. Standaard apoplast extractie workflow. De nummers verwijzen naar stappen in het protocol.
Figuur 2. Een voorbeeld GC-MS chromatogram P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF De genummerde voorbeeld metaboliet pieken: 1-malonaat, 2-fosfaat, 3-succinaat, 4-onbekende, 5-malaat, 6-asparagine, 7-ribitol (interne stAndard), 8-citraat, 9-glucose, 10-inositol, 11-caffeïnezuur, 12-sucrose.
Figuur 3. Een voorbeeld SDS-PAGE Coomassie gekleurde gel P. Vulgaris AWF bladextracten. Deze gel geeft een vergelijking tussen de eiwitcomponenten van twee AWF extracties die verschillen in de hoeveelheid cytoplasmatische besmetting door de overvloedige plastidial enzym Rubisco. Na AWF extractie beide monsters werden onderworpen aan aceton eiwitten neerslaan in een 4-voudige overmaat (v / v) koud aceton en opnieuw opgelost in water bij een tiende van het oorspronkelijke volume. Lanen 1 en 2 bevatten 40 ug eiwit. De band die overeenkomt met de Rubisco grote keten (~ 53 kDa) wordt aangegeven met een pijl. M r: eiwit molecuulgewicht markers.
Discussion
Het optimaliseren van het plantenweefsel bron
Biologische en technische variatie groot bij het uitvoeren apoplast extracties, waardoor een zeer gestandaardiseerde werkstroom is nuttig om continuïteit in experimenten verhogen (Figuur 1). Belangrijk is dat de bron van plantenweefsel worden gestandaardiseerd, waaronder bladtype, bladouderdom, groei / milieuomstandigheden en tijd (Tabel 1). Grote verschillen in het gemak waarmee verschillende bladeren geïnfiltreerd en de AWF vervolgens gewonnen door centrifugeren; deze verschillen worden gecorreleerd met huidmondjes nummer, diafragma en mesophyll weerstand 12,14. Zelfs onder verschillende cultivars van P. vulgaris er grote verschillen in het gemak en de opbrengst van de AWF extractieprocedure; bijvoorbeeld bladeren van de Tendergreen ras hier gebruikte ontvankelijker voor AWF extractie met deze methode dan de Canadese Wonder cultivar. BinnenP. vulgaris de eerste echte bladeren zijn de grootste en het makkelijkst te infiltreren, waardoor ze de hand liggende keuze voor apoplastische extracties. Het apoplastische lucht en water volume is aangetoond variëren bladouderdom in verschillende species leidt tot verschillen in AWF extraheerbaarheid 12,14. In P. vulgaris, oudere bladeren worden aanzienlijk moeilijker te infiltreren en de opbrengst minder AWF op centrifugeren; Daarom bladeren werden geoogst wanneer ze volle expansie bereikt. Bladeren die moeilijk vervolgens infiltreren vereisen hogere centrifugeren snelheden naar de AWF te herstellen zijn. Men moet dan ook zorgvuldig screenen verschillende blad soorten en variëteiten, alvorens te beslissen op een tissue bron voor grootschalige AWF extracties.
Plantengroei moeten eveneens zoveel mogelijk gestandaardiseerd binnen het kader van het experiment. Het gebruik van groeikasten voorkeur als zij toestaan constante vochtigheid, temperatuur verlicht intensiteit regimenten worden gehandhaafd. De oogst van bladeren moeten altijd plaats op hetzelfde tijdstip omdat de concentraties van metabolieten, enzymen, etc. variëren gedurende de dagelijkse cyclus 14. Om te vermijden dat de bladeren allemaal dezelfde turgor moeten de planten snel bewaterd voordat (~ 1 uur) het oogsten.
Optimalisatie van blad infiltratie en centrifugeren
Ongewenste cytoplasmatische verontreiniging van de AWF door gedeeltelijke cellysis resulteert wanneer de spanning waarmee de cellen te hoog tijdens de infiltratie of centrifugatiestappen. Daarom moet de procedure voor een bepaalde bladtype een geoptimaliseerd compromis tussen maximale opbrengst en het minimaliseren cytoplasmatische verontreiniging van de AWF zijn. In alle gevallen moet men de laagste centrifugeren snelheid waarmee AWF kunnen worden hersteld naar mogelijke mechanische verstoring van het blad cellen te vermijden gebruiken. Optimalisatie van de centrifugaleting snelheid moet empirisch worden bepaald voor elk blad soort door monitoring van de hoeveelheid teruggewonnen en apoplast besmetting over een bereik van centrifugeren snelheden. Er is waargenomen dat marker enzymactiviteiten, zoals MDH, G6PDH en glucose-fosfaat isomerase, laag blijven totdat een drempel centrifugaalkracht wordt overschreden, waarboven deze activiteiten snel toenemen, waarschijnlijk door cytoplasmatische lekkage 9,12,14. Het gebruik van Parafilm voor ondersteuning tijdens de centrifugatiestap, zoals opgemerkt door Baker et al. 2012 11, kan de werkzaamheid van de AWF extractie verbeteren en kan mechanische beschadiging van het blad veroorzaakt door overmatige vouwen en compressie te minimaliseren. Bovendien is het gebruik van Parafilm verbetert visualisatie van het blad na centrifugeren als een het blad op beschadigingen en volledigheid van de AWF extractie moet onderzoeken.
Nouchi 12 beschrijven de optimalisatie van AWF herstel van cut rijstblad secties, die d zijnifficult te infiltreren en vereisen hogere centrifugeren snelheden tot AWF verzamelen vanwege hun kleine stomataire openingen. Verbeterde bevochtiging van de rijst bladoppervlak, hetzij door voorweken de bladeren in gedestilleerd water of de toevoeging van een oppervlakteactieve stof de infiltratie fluïdum, vergemakkelijkt het infiltratieproces. Een hogere snelheid centrifugeren (6000 xg) werd ook gebruikt, met opvolging van apoplastische verontreiniging 12. Bij gebruik cut paneeldelen er altijd het risico dat cytoplasmatische besmetting vaker zelfs uitgebreid wassen van de wond gebieden liggen; gesneden bladeren moeten daarom alleen wanneer dat nodig is worden gebruikt.
Vele studies gedestilleerd water wordt gebruikt als de infiltratie fluïdum 11. Echter, kunnen verbindingen worden toegevoegd aan de infiltratie fluïdum, zoals zouten of buffers om de extractie van bepaalde apoplastische samenstellingen, vooral eiwitten 13 verbeteren. Lohaus 14 evalueerde het effect van ionische en osmotische kracht on de samenstelling van de herstelde AWF en vond ze te verwaarlozen. Veranderingen in pH van het medium infiltratie kan echter de AWF preparaat 14 beïnvloeden.
Correcte opslag en gebruik van het gewonnen apoplastische vloeistof is belangrijk. AWF is aangetoond dat een overvloed van proteasen en andere enzymen 13,20, en vluchtige organische verbindingen bevatten. Daarom, om wijzigingen in de samenstelling van AWF na herstel is het raadzaam om monsters op ijs of bij -80 ° C anders bewaard blijven verminderen. Bovendien moet enzymatische assays van AWF zo spoedig mogelijk nadat extractie enzym inactivatie tengevolge van de proteolyse, langdurige verdunning of bevriezen-ontdooien.
Het proces van infiltratie verdunt de apoplastische vloeistof en het is vaak noodzakelijk om de omvang van deze verdunning. De centrifugatiestap kan ook verdunnen de AWF met water uit intracellulaire compartimenten. Een verdunningsfactor is nodiged in te schatten in vivo apoplast chemische concentraties er metingen worden verricht op AWF. Een verdunningsfactor is ook nodig om terug concentreren AWF volle sterkte wanneer het wordt gebruikt als een apoplast nabootsen groeimedium voor micro - dus passen in vivo metabolietconcentraties zo nauwkeurig mogelijk. Verscheidene variaties bestaan op de in stap 4 beschreven voor de bepaling van de AWF verdunningsfactor door meting van de verdunning van een marker verbinding toegevoegd aan de infiltratie fluïdum methode. Voor alle methoden de AWF verdunning berekening gaat ervan uit dat de infiltratie vloeistof is niet noemenswaardig geabsorbeerd of verdund door het blad cellen tijdens de AWF herstelproces. Deze veronderstelling is eerder gecontroleerd voor de infiltratie stap 14, maar is niet gecontroleerd voor het centrifugeren stap. De marker verbinding mag ook niet worden geabsorbeerd, getransporteerd of gewijzigd, terwijl in de apoplast. Indigokarmijn is de meest gebruikte en grondig getest van kleurstoffen gebruiktvoor AWF verdunning berekeningen. Indigokarmijn toont een lage absorptie te kationuitwisselingshars en geïsoleerde celwanden en is geschikt gebleken voor AWF berekeningen in Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum en Glycine max 11,21,22 te zijn. Echter, in sommige blad types, bijvoorbeeld, rijst en komkommer, indigo karmijn bleek niet volledig hersteld na infiltratie, wat zou leiden tot een onderschatting van de AWF verdunningsfactor 12,21. Het ontbreken van herstel van indigokarmijn kan te wijten zijn gevoeligheid voor splitsing in isatine sulfonaat door superoxide 23 die bekend is in de apoplast te produceren, vooral onder spanning 24. Splitsing van indigokarmijn in isatine sulfonaat zal resulteren in een verlies van absorptie bij 610 nm en een verhoging bij 245 nm. Of deze reactie optreedt in belangrijke mate in de apoplast, of dat deze reactie kan worden geremd door de toevoeging van superoxide scavengers te infiltration vloeistof is niet onderzocht tot nu toe. Blauw dextran werd gebruikt in plaats van indigocarmine voor de kwantificering van de AWF verdunningsfactor in rijst verlaat 12, hoewel de stabiliteit en het herstel van AWF is niet gemeld. Als alternatief kunnen radioactief gemerkte verbindingen zoals [14C] sorbitol of andere kwantificeerbare interne standaarden worden gebruikt in plaats van kleurstoffen en de afname van radioactiviteit of concentratie gemeten en gebruikt om de verdunningsfactor berekenen op analoge wijze 11,14,25.
Beperkingen van de techniek
Een paar kanttekeningen bestaan voor de infiltratie-centrifugeren AWF isolatie methode. Ten eerste kan de verdunning van de apoplast tijdens infiltratie reactie van de plant op te wekken. Als de omliggende bladcellen detecteren een verminderde concentratie voor bepaalde onderdelen van de apoplastische vloeistof, kunnen zij reageren door het uitscheiden verdere metabolieten, verstoring van de interpretatie van de metaboliet concentraties. Ineen evaluatie van dit probleem werd opgemerkt dat noch de tijd tussen infiltratie en centrifugatie of matige verschillen in de ionsterkte van de infiltratie fluïdum invloed op de samenstelling van het geëxtraheerde AWF 14,22. Daarom alle artefacten als gevolg van apoplast verdunning gedacht minimaal zijn.
Een tweede mogelijk nadeel is dat elutie van AWF door centrifugeren niet alle in de apoplast om verschillende redenen moleculen vangen. Sommige verbindingen, met name kationen en eiwitten nauw betrokken bij de negatief geladen celwand en niet elueer met de AWF 13. Andere moleculen zoals eiwitten te groot om efficiënt elueren uit de apoplast naar het centrifugeren toerentallen die 14 zijn. Reactieve zuurstofsoorten zijn een belangrijke klasse van verbinding die in de apoplast, maar door de kortstondige aard van deze verbindingen, en gespecificeerde eisen voor de productie, de presence is niet goed opgevangen door AWF extractie. Het is niet bekend hoe nauwkeurig AWF vertegenwoordigt de in vivo samenstelling van de apoplast vloeistof en kan variëren tussen soorten.
Verschillende tests bestaan om cytoplasmatische besmetting te bepalen, hoewel geen universeel geaccepteerd. Testen van overwegend cytoplasmatische enzymen (bv G6PDH, hexose fosfaatisomerase, MDH) hebben het voordeel dat ze gemakkelijk uit te voeren maar kan niet goed correleren met cytoplasmische lekkage 14,18. De beoordeling van de cytoplasmatische metabolieten (bv hexose- fosfaten, chlorofyl) is misschien meer een indicatie, maar is minder goed uitgewerkt 11. Toch kunnen beide typen assay nuttig voor relatieve kwantificatie van apoplastische verontreiniging tussen monsters. Idealiter meerdere onafhankelijke metingen gebruikt om de integriteit van de AWF monster valideren.
Maar erkent zijn beperkingen, de infiltratie-centrifugatiop techniek die hier beschreven blijft een eenvoudige en robuuste techniek in de studie van apoplastische eiwitten, primaire en secundaire metabolieten en anorganische ionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
References
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
