Abstract
Det apoplast är en distinkt extracellulära rummet i växtvävnader som ligger utanför plasmamembranet och innefattar cellväggen. Den apoplastiska utrymme blad är platsen för flera viktiga biologiska processer, inklusive cellvägg bildning, cellulär näringsämne och vattenupptag och export, växt entofyt interaktioner och försvars svar på patogener. Den infiltration-centrifugeringsmetoden är väl etablerad som en robust teknik för analys av den lösliga apoplast sammansättningen av olika växtarter. Vätskan som erhålls med denna metod är allmänt känd som apoplast tvättvätska (AWF). Följande protokoll beskriver en optimerad vakuuminfiltrering och centrifugeringsmetoden för AWF extraktion från Phaseolus vulgaris (böna) ev. Tendergreen blad. Begränsningarna av denna metod och optimering av protokollet för andra växtarter diskuteras. Återvunna AWF kan användas i ett brett spektrum av experimen nedströmsts som försöker karakterisera sammansättning apoplasten och hur den varierar till följd av växtarter och genotyp, växtutveckling och miljöförhållanden, eller att avgöra hur mikroorganismer växer i apoplast vätska och reagera på förändringar i dess sammansättning.
Introduction
Anläggningen apoplast är den intercellulära utrymmet som omger växtceller. Detta är en dynamisk miljö där många metaboliska processer och transportprocesser ske. Den största strukturella komponenten i apoplasten är cellväggen, som monteras och modifieras av enzymer, strukturella proteiner och metaboliter ligger inom apoplasten. Hos friska växtceller apoplasten upprätthålls generellt i en sur tillstånd möjliggör aminosyror, socker och andra näringsämnen som skall importeras från apoplasten till cytoplasman av H + symport 1. Under sackaros transporter, sackaros flyttar från fotosyntetiska källor via apoplasten och in floem kärl; sackaros transporteras sedan genom en osmotisk potential underhålls av apoplastisk invertaser klyvnings sackaros i diskhon organen 2. Socker och andra näringsämnen kan också transporteras uppåt och ansamlas i stomatala kaviteter genom transpiraströmmen 3.
"> Den apoplast representerar också en miljönisch där många patogener fastställa deras parasit livsstil. Bakteriella växtpatogener har förmågan att föröka till höga tätheter i apoplasten, som de har tillgång genom naturliga öppningar såsom klyvöppningar eller genom sår fyra. Koncentrationen av amino syror och andra kväveföreningar i tomat apoplast har visat sig vara tillräckligt för att stödja näringsbehov bakterie- och svamp patogener 5,6. Primära försvarssvar mot mikrobiella patogener förekommer även i apoplasten, nämligen produktionen av reaktiva syreradikaler genom extracellulära peroxidaser . och oxidaser och en förstärkning av cellväggen genom tvärbindning och callose nedfall 7 växtcellvägg är rik på sekundära metaboliter med antimikrobiella aktiviteter, den biokemiska naturen hos dessa sekundära metaboliter varierar mellan arter 8.Som ett resultat av den ovan nämnaEd och andra processer, blad apoplastiska fluiden innehåller en mängd olika proteiner, sockerarter, organiska syror, aminosyror, sekundära metaboliter, metaller och andra katjoner (t.ex., Mg2 +, K +, Na +, Ca2 +, Fe 3/2 +). Lösta koncentrationer i apoplast av skott styrs till stor del av balansen mellan transportprocesser som sker mellan apoplasten och xylem, floem och cytoplasma 9. Men metaboliska reaktioner och mikrobiell tillväxt konsumerar också eller producerar apoplastisk lösta ämnen. Sammansättningen av apoplasten är känd för att skilja sig mellan växtarter och genotyper och som svar på förändrade miljöförhållanden inklusive ljus, näring och biotisk och abiotisk stress 9. Genom att studera sammansättningen av apoplasten och hur det förändras, inklusive egenskaper såsom redox och osmotisk potential, pH, näring / metabolit tillgänglighet och enzymatiska aktiviteter, kan man få nya insikter i hur växter restämmer till sin miljö. Förståelse eller karakterisera de molekylära förändringar som sker i apoplasten lösningen är komplicerat eftersom det är ett rumsligt strukturerad och dynamisk fack där metaboliter och / eller joner kan vara volatil, övergående eller associerad med cellväggen och plasmamembranet. Dessutom är olika analysmetoder som krävs för att täcka den rad olika kemiska typer.
För att studera sammansättningen av lösliga apoplast behöver vätska brukar extraheras från vävnaden. Det finns flera metoder för att utvinna apoplast vätska från olika vävnader, däribland en nyligen föreslagna filter remsmetoden 10, men den mest etablerade extraktionsmetod för löv är infiltration-centrifugering. Denna teknik har utvärderats tidigare 11-13 och Lohaus et al. 2001 14 ge en grundlig undersökning av många av metodens tekniska parametrar. Som namnet antyder, infiltration-centrifugesöknings teknik är en metod i två steg som i huvudsak inbegriper utbyte av den apoplastiska luftrummet med en vattenbaserad infiltration vätska, vilket blandar sig med den nativa apoplastiska vätska, följt av utvinning av infiltration / apoplastiska fluidblandningen genom försiktig centrifugering av bladen. Som det återvunna fluiden utspädes och innehåller inte alla föreningar som finns i apoplasten (se nedan) är denna vätska allmänt känd som apoplasten tvättfluidum (AWF), eller ibland intercellulär tvättfluidum, snarare än apoplastiska vätska. Infiltreringen-centrifuge teknik är skalbar tillåter enkla eller sammanslagna AWF prover av lämplig volym som skall genereras och utsattes för en lång rad nedströms biokemiska och analystekniker (t.ex. proteinelektrofores, enzymaktivitetsmätning, NMR, många typer av kromatografi och massa spektrometri). Leaf AWF är också användbart som en apoplasten mimicking tillväxtmedium för att studera interaktionen av växt koloniserande mikrober with deras miljö 5.
I följande protokoll beskriver vi hur du utför infiltrationen-centrifuge teknik med hjälp av Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen blad och ge några exempel på analyser nedströms med fokus på metabolomik. Viktigt metoder bedöma kvaliteten på AWF tillhandahålls tillsammans med råd för att optimera förfarandet för olika blad.
Protocol
OBS: Valet av startbladmaterial och standardisering av växttillväxtbetingelser är kritiskt eftersom dessa faktorer i hög grad kan påverka kvaliteten, variabilitet och utbytet av AWF (Figur 1). Parametrar att tänka visas i tabell 1 och diskuteras mer i detalj i diskussionen.
| Parameter | Exempel standardiseringar | ||
| Phaseolus vulgaris | Solanumlycopersicum | Arabidopsis thaliana | |
| Leaf typ | Första riktiga blad, fullt utbyggt, friska | 2: a och 3: e blad som börjar nedifrån, fyra största broschyrer tagit apikala bipacksedel inte används för apoplast utvinning | Fullt utbyggda rosettblad |
| Växt ålder | 21 dagar | 7-9 veckor 7 veckor | |
| Tid på dagen | Mitten av ljusperioden (00:00) | Mitten av ljusperioden (12:00) | Mitten av ljusperioden (00:00) |
| Hydra | Alla växter väl vattnas 1 timme före skörd | Alla växter väl vattnas 1 timme före skörd | Alla växter väl vattnas 1 timme före skörd |
| Lätt | 16 timmar ljus, 400 ^ mol m -2 s -1 | 16 timmar ljus, 400 ^ mol m -2 s -1 | 10 timmar ljus (kort dag) från vecka 2, 400 mikromol m -2 sek -1 |
| Fuktighet | 70% | 70% | 70% |
| Temperatur | 22 ° C-ljus, 18 ° C mörker | 22 ° C-ljus, 18 ° C mörker | 21 ° C |
Tabell 1. Exempel på standardiserade Paramegor för bladen som används i analysregister extraktioner.
1. Generera apoplast Tvätt Fluid
OBS: Under detta protokoll farligt materila inculding mikrobiella patogener från infekterade blad bör inte spolas ner i avloppet; ganska korrekta förfaranden för bortskaffande bör användas.
- Välj apparat baserad på bladstorlek:
- Infiltrera mindre blad (t.ex. Arabidopsis, bönor) med hjälp av en spruta utan nål. Använd en termos för att infiltrera löv som är för stora för att passa i en spruta. Använd termos metoden att infiltrera flera blad samtidigt.
- Dela upp blad som är för stora för tillgängliga infiltration metoden i mindre delar med hjälp av ett rakblad. Skölj skurna sektioner blad i destillerat vatten före infiltration att avlägsna cytoplasmiska föroreningar som andas från skadade celler.
- Leaf infiltration med hjälp av en 60 ml spruta:
- Lossa bladet frånanläggning vid bladskaft med ett rakblad. För sammansatta blad såsom tomat, lossa flygblad vid småbladskaft.
- Skölj nyligen utskuren blad genom nedsänkning i destillerat vatten för att avlägsna blad ytföroreningar. Torka bladet genom att försiktigt läsk med läskpapper eller papper.
- Mät bladvikten före infiltrering.
- Försiktigt rulla och / eller vika bladet i en 60 ml spruta och fylla sprutan med destillerat vatten (andra infiltrationsvätskor får användas, se diskussion). Mata eventuell luft i sprutan samtidigt sänka kolven ungefär till 40 ml markeringen.
- Täck sprutspetsen med antingen en handske finger eller en bit av Parafilm, sedan skapa undertryck i sprutan genom att dra kolven utåt till 60 ml markeringen. Släpp långsamt kolven.
OBS: Snabbt släppa trycket kan leda cellysering och cytoplasmatisk kontamination. - Koppla sprutspetsen och mata någon luft, sätter du sedan spetsen och tryckytterligare nedåt på kolven för att skapa ett mindre belopp övertryck.
- Upprepa steg 1.2.5 - 1.2.6 tills bladet är helt infiltrerat, som ses av den mörka färgen på infiltrerade områdena.
- Ta bladet från sprutan. Försiktigt men grundligt blot blad med absorberande papper för att avlägsna ytvätska.
- Mät vikt infiltrerade blad. Beräkna skillnaden i vikt före och efter infiltration som nära approximerar infiltration volymen.
- Leaf infiltration av vakuumkolv:
- Lossa bladet från anläggningen vid bladskaft med ett rakblad.
- Skölj nyligen utskuren blad genom nedsänkning i destillerat vatten för att avlägsna blad ytföroreningar. Torka bladet genom att försiktigt läsk med absorberande papper.
- Mät bladvikten före infiltrering.
- Placera bladet (eller lämnar om infiltrerande flera blad) i en 250 ml eller större sidoarm kolv containing destillerat vatten (andra infiltrationsvätskor kan användas, se diskussion). Helt täcka bladen med vätskan.
- Applicera ett vakuum till kolven. Skaka försiktigt för att frigöra luftbubblor från bladen. Försiktigt och långsamt släppa vakuumet.
OBS: Snabbt släppa vakuumet kan resultera i cellys och cytoplasmatisk kontamination. - Upprepa steg 1.3.5 tills bladet är helt infiltrerat, som ses av den mörka färgen på infiltrerade områdena.
- Avlägsna löv från kolven. Försiktigt men grundligt blot blad med absorberande papper för att avlägsna ytvätska.
- Mät vikt infiltrerade blad. Beräkna skillnaden i vikt före och efter infiltration som nära approximerar infiltration volymen.
- Återvinning av AWF genom centrifugering:
- Placera bladet på en bit 4 tum (10 cm) bred Parafilm. Med hjälp av en 5 ml pipett spets (eller en liknande storlek objekt),rulla upp bladet i Parafilm.
- Sätt den hoprullade blad med pipettspetsen i en 20 ml spruta. Placera några skär bladkanter uppåt. Sätt sprutan i en ren 50 ml polyetylen eller polykarbonat röret.
- Centrifugera sprutan inuti röret under 10 min vid 1000 x g i en svängande hink rotor vid 4 ° C.
OBS: Visuell undersökning av bladen efter centrifugering bör avslöjar att majoriteten av infiltration vätskan har utvisats. Mörkare gröna fläckar tyder på att ytterligare centrifuge tid krävs. - Pipet den återvunna AWF i nya 1,5 ml rör.
OBS: Volymen AWF bör ungefär matcha infiltrationsvolymen för det blad; om volymen är mindre sedan ytterligare centrifugeringstiden eller centrifugering hastighet krävs. - Centrifugera AWF proverna vid 15.000 xg under 5 minuter för att avlägsna eventuella celler eller partiklar. Alternativt, passera AWF genom ett 0,22 ìm filter för att Remove celler och partiklar.
- Pipettera supernatanten till ett nytt rör. Håll proverna på is tills lagring.
- Förvara AWF proverna vid -80 ° C.
2. Analyser för cytoplasmatisk Kontamination
- Håll AWF prover på is för att minimera enzymatiska reaktioner (t.ex. proteolys) och utföra analyserna omedelbart efter centrifugeringsstegen är klar.
OBS: För metabolit analyser kan proverna omedelbart frysas efter extraktion och förvaras vid -80 ° C fram till användning. - För en vanlig malatdehydrogenas (MDH) analysprotokoll se 15; annat sätt använda en kommersiellt tillgänglig MDH analyssats.
- För en vanlig glukos-6-fosfatdehydrogenas (G6PDH) analysprotokoll se 16; annat sätt använda en kommersiellt tillgänglig G6PDH analyssats.
- För kvantifiering av de cytoplasmiska metaboliter såsom glukos-6-fosfat (G-6-P) använder GC-MS såsom beskrivits i steg 5
3. Beräkning av apoplasten Spädningsfaktor
- Bered två volymer av infiltrationen vätska som används ovan i steg 1.2.4 eller 1.3.4 (t.ex. destillerat vatten). Lägg indigokarmin pulver till en lösning till en slutlig koncentration av 50 pM, inte tillför något till den andra.
- Mät absorbansen vid 610 nm (OD 610) av 200 pl av indigokarmin infiltration lösning med en plattläsare. Korrigera detta värde genom att subtrahera OD 610 av 200 pl infiltration lösning utan indigokarmin. Ersätt denna korrigerade värde som OD 610infiltrate i ekvationen nedan.
- Utför minst tre likadana blad infiltrationer som ovan (steg 1.2 eller 1.3) med båda infiltrationslösningar (med och utan indigokarmin).
- Efter infiltrering, rInse bladen i destillerat vatten för att avlägsna eventuell kvarvarande indigokarmin närvarande på de yttre ytorna.
- Fortsätt med centrifugering som ovan (steg 1,4).
- Bestäm den genomsnittliga OD 610 av 200 | il av de indigokarmin AWF extraktioner. Korrigera detta värde genom att subtrahera det genomsnittliga OD 610 värdet av 200 pl av indigokarmin fri AWF. Ersätt denna korrigerade värde som OD 610AWF i ekvationen nedan.
- Beräkna utspädningsfaktorn (dvs faldig utspädning) från de korrigerade absorbansvärdena som:
Apoplast utspädningsfaktor = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) - Multiplicera koncentrations- eller aktivitetsvärden från AWF av utspädningsfaktorn för att uppskatta koncentrationen / aktiviteten i apoplastisk vätska i planta.
4. Koncentration av AWF till full styrka genom frystorkning
- Sätt på frystork och enllow det stabiliseras vid arbetstemperatur och tryck.
- Pool önskad mängd färska eller lagras AWF prover.
- Fördela proverna jämnt mellan 2 ml centrifugrör.
- Bestäm beredning volym:
Beredning volym = volymen innan frystorkning / apoplast utspädningsfaktor - Med stängt locken, frysa rören i flytande kväve.
- Överför de frusna rören till en eller flera kylda frystorkningskärl. Medan överföra rören, tillbaka locket med en som har genomborrat med ett vasst föremål för att tillåta gasutbyte.
- Fäst fartyg till frystorken och lyofilisera proverna helt.
- Avlägsna proven från maskinen och rekonstituera AWF genom tillsats av den beräknade mängden destillerat vatten.
- Ersätt unpierced locket och lagra proverna vid -80 ° C.
5. metabolitanalys med gaskromatografi-masspektrometri 17
<ol>Representative Results
Typiska resultat AWF extraktioner utförda på friska 3 veckor gamla P. vulgaris cv. Tendergreen blad, med hjälp av destillerat vatten såsom infiltration vätskan visas i tabell 2. Young P. vulgaris bladen är mottagliga för infiltration, och vid centrifuge hastighet som används här (1000 xg) avlägsnandet av majoriteten av infiltration vätska genom centrifugering kan ses direkt som löven återgå till sin ursprungliga gröna färg. P. vulgaris blad färskvikt var i genomsnitt 1,1 xg före infiltration och gav 0,5 ml av AWF per gram färskvikt. Proteinkoncentrationen i AWF bestämdes vara 0,18 ± 0,08 mg / ml med användning av en standard-Bradford-proteinanalys. Utspädningsfaktorn för dessa blad, beräknat genom mätning indigokarmin utspädning, var 2,3 ± 0,3 gånger. Ovanstående värden kan variera kraftigt mellan arter och pilotförsök krävs för att fastställa avkastningen av AWF per gram blad färsk viight, liksom AWF proteinkoncentrationen och utspädningsfaktor som kan förväntas för en given bladtypen.
Skador på integriteten av cellerna kan ske både under infiltrationssteget, då förändringarna i trycket är alltför snabb, och under centrifugeringssteget om centrifugalkraften är för hög. Det är därför nödvändigt att analysera AWF prover för markörer av cytoplasmatisk förorening; idealt, är flera oberoende analyser utförs. Här är resultaten från tre möjliga analyser redovisas i tabell 2. I väl utförda extraktioner av P. vulgaris AWF, G6PDH var påvisas med en standardenzymanalys. Detta ligger i linje med andra rapporter där G6PDH aktivitet blir detekterbar endast över en tröskel centrifugalkraft 12. I motsats härtill kunde påvisas i alla P. en baslinjenivå av malatdehydrogenas aktivitet (2,5 U / ml) vulgaris AWF prover med en vanlig metabolisk analys. Ökning av centrifugal förce över en tröskel på 1000 xg resulterat i ökade MDH verksamhet (resultat visas inte). Som apoplasten från andra arter är kända för att innehålla endogen MDH aktivitet 18, är beloppet upptäcks här anses äkta apoplastisk aktivitet och betydande ökningar över denna grundnivån indikerar förorening. Metaboliter som tros vara övervägande cytoplasmisk, såsom hexos-6-fosfat, kan också användas för att bedöma förorening av analysregister. Här upptäckte GC-MS-analys noll eller spårnivåer av G-6-P i AWF extraktioner. Däremot i snitt majs rot sektioner, G-6-P upptäcktes efter AWF extraktion vid alla centrifugehastigheter och ökade i koncentration vid högre hastigheter, vilket indikerar cytoplasmatisk förorening 10.
Metaboliten analys genom GC-MS av P. vulgaris blad AWF ger typiskt 40-60 identifierbara metaboliter och ett ungefär lika stort antal icke identifierbara föreningar (Figur 2). Ellerniska syror, enkla sockerarter och aminosyror utgör huvuddelen av de identifierbara metaboliter emellertid sekundära växtmetaboliter har också detekterats och kvantifieras från AWF 11. Flera exempel toppar från dessa olika molekylklasser märks i Figur 2 Ytterligare nedströms analytiska tekniker är tillämpliga på dessa AWF prover för att kvantifiera olika molekyler, till exempel:. ICP-MS, NMR, HPLC, atomabsorptionsspektroskopi, protein masspektrometri.
Proteinkomponenten i apoplasten är också representerad i AWF som visas i Coomassie Brilliant Blue-färgad SDS-PAGE-gel i figur 3. Bland andra roller, de apoplastiska enzymerna är ansvariga för syntesen av cellväggen och skapandet av extracellulärt reaktiv syrespecies. Proteomikstudier av AWF från olika arter har identifierat dussintals individuella proteiner och visat att proteinkomponenten i apoplasten svarar på Environmental påfrestning 13,19. Helst AWF Extraktet bör vara fri från föroreningar av cytoplasmaproteiner såsom Rubisco; men i praktiken är detta svårt att uppnå. Närvaron av en Rubisco proteinband vid ~ 53 kDa efter SDS-PAGE ger en ytterligare kvalitativ analys för integritet AWF prover. Till exempel, provet laddats i spår 2 i Figur 3 innehåller en större mängd Rubisco förorening som spår 1.
| Phaseolus vulgaris AWF | |
| Volym av AWF (ml g -1 blad FW) | 0,49 ± 0,09 |
| Protein konc. (Mg ml -1) | 0,18 ± 0,08 |
| Utspädningsfaktor | 2,3 ± 0,3 |
| G6PDH aktivitet (U ml -1) | |
| Glc-6-P (mg ml -1) | none upptäcks |
| MDH-aktivitet (U ml -1) | 2,5 ± 0,9 |
Tabell 2. Typiska resultat för AWF extraktioner från P. vulgaris cv. Tendergreen blad.
Figur 1. Standard apoplast utvinning arbetsflöde. Siffrorna avser steg i protokollet.
Figur 2. Ett exempel GC-MS kromatogram av P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF De numrerade exempel metabolit toppar är: 1-malonat, 2-fosfat, 3-succinat, 4-okända, 5-malat, 6-asparagin, 7-ribitol (intern stAndard), 8-citrat, 9-glukos, 10-inositol, 11-kaffeinsyra, 12-sackaros.
Figur 3. Ett exempel SDS-PAGE-Coomassie-färgad gel av P. Vulgaris AWF bladextrakt. Denna gel ger en jämförelse mellan proteinkomponenterna i två analysregister extraktioner som skiljer i mängden cytoplasmatiska kontamination genom den rikliga plastidial enzymet Rubisco. Efter AWF extraktion båda prover utsattes för aceton proteinutfällning i en 4-faldigt överskott (volym / volym) av kall aceton och återupplöses i vatten vid en tiondel av den ursprungliga volymen. Spår 1 och 2 innehåller 40 | ig protein. Bandet som motsvarar Rubisco stor kedja (~ 53 kDa) indikeras med en pil. M r: proteinmolekylviktsmarkörer.
Discussion
Optimering av växtvävnadskällan
Biologisk och teknisk variation kan vara stora när du utför apoplast extraktioner, alltså en mycket standardiserad arbetsflöde är bra att öka kontinuiteten mellan experiment (figur 1). Viktigt måste källan av växtvävnad standardiseras, inklusive blad typ, blad ålder, tillväxt / miljöförhållanden och tid på dagen (tabell 1). Stora skillnader föreligger i den lätthet med vilken olika bladen infiltreras och AWF utvanns därefter genom centrifugering; dessa skillnader är korrelerade med klyvöppningar nummer, hålstorlek och mesophyll motståndet 12,14. Även bland olika sorter av P. vulgaris det finns stora skillnader i den lätthet och avkastningen av AWF extraktionsmetod; till exempel blad från Tendergreen sorten som används här är mer mottagliga för AWF extraktion med hjälp av denna metod än den kanadensiska Wonder sorten. InomP. vulgaris de första riktiga bladen är de största och lättast att infiltrera, vilket gör dem till självklara valet för apoplastisk extraktioner. Den apoplastiska luft och vatten volym har visat sig variera med blad ålder i flera arter som leder till skillnader i AWF extraherbarhet 12,14. I P. vulgaris, äldre blad blir avsevärt svårare att infiltrera och ger mindre AWF vid centrifugering; Därför löv skördades när de nådde full expansion. Löv som är svåra att infiltrera därefter kräva högre centrifuge hastigheter att återvinna AWF. Man bör därför noga screena flera olika typer blad och sorter innan beslut fattas om en vävnadskälla för storskaliga AWF extraktioner.
Växt tillväxtbetingelser måste också standardiseras så mycket som möjligt inom ramen för experimentet. Användningen av växtkammare är att föredra eftersom de möjliggör konsekvent luftfuktighet, temperatur och light intensitets regementen upprätthållas. Skörd av blad bör alltid ske vid samma tid på dagen, eftersom koncentrationerna av metaboliter, enzymer etc. varierar hela dygnscykeln 14. Slutligen, för att säkerställa att anläggningen lämnar alla har liknande saftspänningen bör växterna vattnas snart innan (~ 1 tim) skörden.
Optimering av blad infiltration och centrifugering
Oönskad cytoplasma förorening av AWF grund av partiell cellslys kommer resultera om mekanisk påfrestning stött av cellerna är för hög under infiltrations eller centrifugeringssteg. Därför bör förfarandet för en given blad typ vara en optimerad avvägning mellan att maximera avkastningen och minimera cytoplasma förorening av AWF. I samtliga fall bör man använda lägsta centrifuge hastighet med vilken analysregister kan utvinnas för att undvika eventuell mekanisk sprängning av bladceller. Optimering av centrifugesökningshastigheten bör bestämmas empiriskt för varje typ blad genom att övervaka den återvunna volymen och apoplasten förorening över ett område av centrifugehastigheter. Det har observerats att markörenzymaktiviteter, såsom MDH, G6PDH och glukos-fosfatisomeras, fortsatt låga tills en tröskel centrifugalkraft överskrids, över vilken dessa aktiviteter ökar snabbt, förmodligen på grund av cytoplasmatisk läckage 9,12,14. Användningen av Parafilm för stöd under centrifugeringssteget, som noterats av Baker et al. 2012 11, kan förbättra effektiviteten av AWF utvinning och kan minimera mekaniska skador på bladet bladet orsakas av överdriven vikning och komprimering. Vidare användning av Parafilm förbättrar visualisering av bladet efter centrifugering när man bör undersöka bladet för skador och fullständighet AWF extraktion.
Nouchi 12 beskriver optimering av AWF återhämtning från cut ris bladsektioner, vilka är difficult att infiltrera och kräva högre centrifuge hastigheter för att samla AWF grund av deras små stomatala öppningar. Förbättrad vätning av ris bladytan, antingen genom förblötning bladen i destillerat vatten eller tillsats av ett ytaktivt ämne till infiltrationen vätska, underlättade infiltrationsprocessen. En högre centrifugehastighet (6.000 xg) användes också under övervakning för apoplastisk förorening 12. Vid användning av cut bladsektioner finns det alltid en risk att cytoplasma kontamination blir vanligare även med omfattande tvättning av sårställen; skurna blad bör därför endast användas när det är nödvändigt.
För många studier destillerat vatten används som infiltrations fluiden 11. Emellertid kan föreningarna sättas till infiltrationsvätska, såsom salter eller buffertar, för att förbättra utvinningen av vissa apoplastisk föreningar, särskilt proteiner 13. Lohaus 14 utvärderade effekten av joniska och osmotisk styrka on sammansättningen av den återvunna AWF och funnit dem vara försumbar. Förändringar i pH i infiltrationsmediet kan dock påverka AWF sammansättningen 14.
Korrekt hantering och lagring av den extraherade apoplastiska vätskan är viktigt. AWF har visats innehålla ett överflöd av proteaser och andra enzymer 13,20, samt flyktiga organiska föreningar. Därför, för att reducera ändringar i sammansättningen av analysregister efter återvinning är det rekommenderat att hålla prover på is eller på annat sätt lagras vid -80 ° C. Vidare bör enzymatiska analyser av AWF utföras så snart som möjligt efter extraktion för att begränsa enzyminaktivering på grund av proteolys, långvarig utspädning eller frysning-upptining.
Processen för infiltration späder ut apoplastiska vätska och det är ofta nödvändigt att fastställa omfattningen av denna utspädning. Centrifugeringssteget kan också späda AWF med vatten från intracellulära fack. En utspädningsfaktor behövered att uppskatta in vivo apoplast kemiska koncentrationer när mätningar görs på AWF. Det behövs också en utspädningsfaktor att koncentrera AWF tillbaka till full styrka när den används som en apoplast härma tillväxtmedium för mikrober - alltså matcha in vivo metabolitkoncentrationer så noggrant som möjligt. Flera variationer existera på den metod som beskrivs i steg 4 för att bestämma AWF utspädningsfaktor genom mätning av utspädningen av en markörförening sättes till infiltrationsvätskan. För alla metoder spädberäkningen AWF förutsätter att infiltrationen vätskan inte nämn absorberas eller utspädd med bladcellerna under återställningsprocessen AWF. Detta antagande har tidigare verifierats för infiltration steg 14 men overifierade för centrifugeringssteget. Markörföreningen får inte heller absorberas, transporteras eller modifierad medan apoplasten. Indigokarmin är den mest använda och noggrant testade av färgämnen som användsför AWF utspädnings beräkningar. Indigokarmin visar en låg absorbans till katjonbytarharts och isolerade cellväggar och visades vara lämplig för AWF beräkningar i Brassica napus, Pisum sativum, Solanumlycopersicum och Glycine max 11,21,22. Men i vissa bladtyper, t.ex. ris och gurka, indigokarmin verkade inte återhämtat sig helt efter infiltration, vilket skulle leda till en underskattning av AWF utspädningsfaktorn 12,21. Bristen på återhämtning av indigokarmin kan bero på dess känslighet för klyvning in isatin sulfonat genom superoxid 23, som är känt för att produceras i apoplasten, särskilt under stress 24. Klyvning av indigokarmin i isatin sulfonat kommer att resultera i en förlust av absorbans vid 610 nm och en ökning vid 245 nm. Huruvida denna reaktion sker i nämnvärd omfattning i apoplasten, eller om denna reaktion kan hämmas genom tillsats av superoxid asätare att infiltration vätska har inte undersökts hittills. Blå dextran har använts i stället för indigokarmin för kvantifiering av AWF utspädningsfaktorn i ris bladen 12, även om dess stabilitet och återhämtning i AWF inte har rapporterats. Alternativt kan radioaktivt märkta föreningar, såsom [14 C] sorbitol eller andra kvantifierbara interna standarder användas i stället för färgämnen och minskningen i radioaktivitet eller koncentration mäts och används för beräkning av utspädningsfaktorn på ett analogt sätt 11,14,25.
Begränsningar av tekniken
Några varningar finns för infiltration-centrifuge AWF isoleringsmetod. Först, kan utspädningen av apoplasten under infiltreringen framkalla ett svar från växten. Om den omgivande bladcellerna detekterar en minskad koncentration för vissa komponenter i apoplastiska vätska, kan de svara genom att utsöndra ytterligare metaboliter, förvränga tolkningen av metabolitkoncentrationer. Ien bedömning av detta problem konstaterades att varken tid mellan infiltration och centrifugering eller måttliga skillnader i jonstyrka infiltration vätskan påverkat sammansättningen av den extraherade AWF 14,22. Därför att några artefakter som härrör från apoplast utspädning tros vara minimal.
En andra potentiell nackdel är att eluering av AWF genom centrifugering inte fångar alla de molekyler som är närvarande i apoplasten av flera skäl. Vissa föreningar, i synnerhet katjoner och proteiner kan vara tätt förknippad med den negativt laddade cellväggen och inte eluera med AWF 13. Andra molekyler som proteiner kan vara för stor för att eluera effektivt ur apoplasten vid centrifuge hastigheter används 14. Reaktiva syreradikaler är en viktig klass av förening som produceras i apoplasten, men på grund av den kortlivade karaktären av dessa föreningar, och ospecificerade krav på sin produktion, deras presence är inte väl fångats av AWF extraktion. Det är inte känt hur exakt AWF representerar sammansättningen in vivo av apoplasten vätskan och kan variera mellan arter.
Flera analyser finns för att bestämma cytoplasmatisk förorening, men ingen är allmänt accepterad. Analyser av övervägande cytoplasmiska enzymer (t.ex. G6PDH, hexos fosfatisomeras, MDH) har fördelen av att vara lätt att utföra men kan inte korrelerar väl med cytoplasmatisk läckage 14,18. Bedömningen av cytoplasmiska metaboliter (t.ex., hexos fosfater, klorofyll) är kanske mer vägledande men är mindre väletablerat 11. Ändå kan antingen typ av analys vara användbar för relativ kvantifiering av apoplastisk kontamination mellan prover. Helst bör flera oberoende mätningar användas för att verifiera integriteten av AWF provet.
Samtidigt som vi erkänner sina begränsningar, infiltration-centrifugatipå teknik som beskrivs här är fortfarande en enkel och robust teknik i studiet av apoplastiska proteiner, primära och sekundära metaboliter och oorganiska joner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
References
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
