Abstract
apoplast은 세포막과 외측에있는 칸막이 벽을 포함 식물 조직의 세포 외 구획 별개이다. 잎 식물의 apoplastic 구획은 세포벽 형성, 세포 영양 및 수분 흡수 및 수출, 식물 내생 상호 작용과 병원균에 대한 방어 반응 등 여러 가지 중요한 생물학적 과정의 사이트입니다. 침투 원심 분리 방법은 물론 다양한 식물 종의 수용성 apoplast 조성물의 분석을위한 강력한 기술로서 확립된다. 이 방법에 의해 얻어진 액은 일반적 apoplast 세척액 (AWF)로 알려져있다. 다음 프로토콜은 위 Phaseolus 심상 (프랑스 콩) 이력서에서 AWF 추출을위한 최적의 진공 침투 및 원심 분리 방법을 설명합니다. Tendergreen 잎. 이 방법과 다른 식물 종에 대한 프로토콜의 최적화의 한계가 논의된다. AWF 하류 experimen의 넓은 범위에서 사용할 수있는 회수 된apoplast의 조성물의 특성을 추구하고 식물 종 및 유전형, 식물의 개발과 환경 조건에 따라 어떻게 변화하는지, 또는 미생물 apoplast 유체 성장 방법을 결정하고, 그 구성의 변화에 대응하는 TS.
Introduction
식물 apoplast은 식물 세포를 둘러싸고있는 세포 간 공간입니다. 이것은 많은 대사 및 전송 과정이 수행되는 동적 환경이다. apoplast의 주요 구성 요소는 조립 apoplast 위치한 효소 및 구조 단백질 대사에 의해 수정된다 셀벽이다. 건강한 식물 세포에서 apoplast은 일반적으로 아미노산, 당 및 기타 영양소 symport H + (1)에 의해 세포질 apoplast에서 가져올 수 있도록 산성 상태로 유지된다. 자당 교통, apoplast을 통해와 체관부 혈관에 광합성 소스에서 자당 이동하는 동안; 자당은 다음 싱크 기관 2에서 크로스를 절단 apoplastic invertases에 의해 유지 삼투압 전위에 의해 운반된다. 설탕과 다른 영양소도 위쪽으로 운반 및 증산 스트림 (3)을 통해 기공 충치에 축적 될 수있다.
"> apoplast이 많은 병원체가 기생 생활 양식을 확립 환경 틈새 시장을 나타냅니다. 세균 식물 병원균이 될 수 있도록 기공이나 상처 넷을 통해 자연 개구부를 통해 액세스 apoplast에서 높은 밀도로 번식 할 수있는 능력을 가지고있다. 아미노산의 농도를 산 및 세균성 병원균 5,6의 영양 요구 사항을 지원하기에 충분한 것으로 밝혀졌다 apoplast 토마토 다른 질소 화합물. 병원성 미생물 향해 차 방어 반응은 또한 apoplast에서 세포 외 퍼 옥시다아제에 의한 활성 산소 종의 즉 생산을 발생할 .과 산화 효소 및 가교 및 callose 증착 (7)을 통해 세포벽의 강화 식물 세포 벽 항균 활동 이차 대사 산물이 풍부하다, 이러한 이차 대사 산물의 생화학 적 특성은 종 8 사이에 다릅니다.상기 언급 한 결과ED 및 다른 프로세스는, 리프 apoplastic 유체는 단백질, 당, 유기산, 아미노산, 이차 대사 산물, 및 다른 금속 양이온 (예를 들면, Mg를 2 +, K +, + 나트륨, 칼슘, 철의 2/3 다양한 포함 +). 촬영의 apoplast에서 용질 농도는 apoplast와 목부, 체관과 세포질 (9) 사이에서 발생하는 전송 프로세스의 균형에 의해 주로 제어된다. 그러나, 대사 반응과 미생물 성장은 소비 또는 apoplastic 용질을 생산하고 있습니다. apoplast의 조성물은 식물 종 및 유전형과 빛 사이, 영양 생물 및 비 생물 적 스트레스를 포함하여 9 환경 조건의 변화에 따라 다를 것으로 알려져있다. apoplast의 구성을 공부하고 같은 산화 환원과 삼투 가능성, 산도, 영양 / 대사 가용성 및 효소 활동과 같은 속성을 포함하여, 변경 방법, 하나는 식물이 다시 방법에 새로운 통찰력을 얻을 수 있습니다자신의 환경에 좋은지. 이 대사 산물 및 / 또는 이온이, 휘발성 과도하거나 세포벽과 세포막과 연관 될 수있는 공간적으로 체계화되고 동적 구획이므로 이해 또는 apoplast 용액에서 발생하는 분자의 변화를 특징은 복잡하다. 또한, 상이한 분석 기술은 상이한 유형의 화학의 범위를 커버해야한다.
수용성 apoplast의 조성물을 연구, 유체는 일반적으로 조직으로부터 추출 될 필요가있다. 몇 가지 방법이 새롭게 제안 된 필터 스트립 제 10 포함한 다양한 조직으로부터 유체를 추출하는 apoplast 존재하지만, 잎을위한 가장 확립 추출법 침윤 원심이다. 이 기술은 11 ~ 13 이전에 평가되었으며 Lohaus 등. 2001 14는 방법의 기술적 인 매개 변수의 많은에 대한 철저한 검사를 제공합니다. 이름, 침윤-centrifu 같이 암시gation 기술은 본질적으로 잎의 부드러운 원심 분리에 의해 침윤 / apoplastic 유체 혼합물을 회수 하였다 네이티브 apoplastic 유체와 혼합 수성 침윤 유체와 apoplastic 공기 공간의 교체를 포함하는 2 단계 방법이다. 회수 된 유체 희석 및 apoplast에있는 모든 화합물 (아래 참조)가 포함되어 있지 않기 때문에,이 유체는 일반적 apoplast 세척액 (AWF), 또는 때때로 간 세척액보다는 apoplastic 유체로서 알려져있다. 침투 원심 분리 기술은 충분한 양의 단일 또는 풀링 AWF 샘플 생성 하류 생화학 분석 기술 (폭넓게 실시 할 수 있도록 쉽게 확장이다 예 단백질 전기 영동, 효소 활성의 측정, NMR, 크로마토 그래피 및 질량의 많은 유형 분석). 잎 AWF는 공장 식민지 미생물 위트의 상호 작용 연구를위한 성장 매체를 흉내 낸 apoplast로서 유용하다시간 자신의 환경 오.
다음 프로토콜에서 우리는 위 Phaseolus는 이력서 vulgaris의 사용 침투 원심 분리 기술을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. Tendergreen 잎, 및 대사 체학에 초점을 다운 스트림 분석의 몇 가지 예를 제공합니다. 중요한 방법 AWF의 품질이 상이한 리프 타입 절차를 최적화하도록 어드바이스와 함께 부여되는 평가한다.
Protocol
주 : 이러한 요인은 크게 품질 가변성과 AWF의 수율 (도 1)에 영향을 미칠 수 있기 때문에 잎 식물 재료와 성장 조건의 표준화의 개시 선택은 중요하다. 고려해야하는 파라미터는 표 1에 도시되고 논의에서 상세하게 논의된다.
| 매개 변수 | 예 표준화 | ||
| 위 Phaseolus 심상 | 까 lycopersicum | 애기 장대 | |
| 잎 유형 | 최초의 진정한 잎, 완전히 확장, 건강한 | 바닥에서 시작하는 2 차 및 3 차 잎, 4 위 전단지 apoplast 추출에 사용하지 혀끝의 전단지를 촬영 | 완전히 확장 장미 잎 |
| 식물 나이 | 이십일일 | 7~9주 칠주 | |
| 하루의 시간 | 빛 기간의 중간 (12시) | 빛 기간의 중간 (12시) | 빛 기간의 중간 (12시) |
| 수화 | 모든 식물은 잘 1 시간 전 수확을 물을 | 모든 식물은 잘 1 시간 전 수확을 물을 | 모든 식물은 잘 1 시간 전 수확을 물을 |
| 빛 | 16 시간 빛, 400 μmol m -2 초 -1 | 16 시간 빛, 400 μmol m -2 초 -1 | 주 2 ~ 10 시간 빛 (짧은 일), 400 μmol m -2 초 -1 |
| 습기 | 70 % | 70 % | 70 % |
| 온도 | 22 ° C의 빛, 18 ° C 어두운 | 22 ° C의 빛, 18 ° C 어두운 | 21 ° C |
표준화 된 parame 표 1. 예AWF의 추출에 사용되는 나뭇잎에 대한 TERS.
1. 생성 Apoplast 세척 유체
참고 : 감염된 잎에서 병원성 미생물을 inculding이 프로토콜 유해 materila 동안 하수구로 세척하지 마십시오; 오히려 적절한 폐기 절차가 사용되어야한다.
- 잎의 크기에 따라 장치를 선택 :
- 바늘 주사기를 사용하여 작은 잎 (예를 들어, 애기 장대, 콩)을 침투. 주사기에 맞게 너무 큰 잎에 침투 진공 플라스크를 사용합니다. 동시에 여러 잎에 침투 진공 플라스크 방법을 사용합니다.
- 면도날을 사용하여 작은 부분으로 가능한 침투 방법에 대한 너무 큰 잎을 나눈다. 증류수로 깨끗하게 잘라 헹굼 잎 부분은 이전에 손상된 세포에서 스며 세포질 오염 물질을 제거 할 수있는 침투합니다.
- 60 ML의 주사기를 사용하여 리프 침윤 :
- 에서 잎을 분리면도날을 사용하여 식물의 엽병. 같은 토마토와 같은 화합물 나뭇잎 들어, 소엽에서 전단지를 분리합니다.
- 잎 표면 오염물을 제거하기 위해 증류수에 의해 침수 갓 잎을 절제 헹군다. 부드럽게 흡수 티슈 나 종이 찍어 내듯 잎을 건조.
- 함침 전의 잎 무게를 측정한다.
- 조심스럽게 롤 및 / 또는 60 ml의 시린지에 잎을 접어 증류수로 주사기를 채우기 (다른 유체 침투는 설명을 참조가 사용될 수있다). 약 40 ml의 표시로 플런저를 낮추면서 주사기 내의 모든 공기를 꺼냅니다.
- 장갑을 낀 손가락이나 파라 필름 조각 하나와 주사기의 끝 부분을 커버하고, 그 후에 60 ml의 표시로 바깥쪽으로 플런저를 잡아 당겨 주사기 내에 음압을 만듭니다. 천천히 플런저를 놓습니다.
참고 : 세포 용해 및 세포질 오염이 발생할 수 있습니다 압력을 해제 빠르게. - 주사기의 끝 부분을 분리하고 공기를 배출, 다음 팁을 눌러 다시 연결플런저에 아래쪽으로는 긍정적 인 압력의 적당한 양을 만들 수 있습니다.
- 침투 지역의 어두운 색상으로 볼 때 잎이 완전히 침투 할 때까지 1.2.6 - 반복 1.2.5 단계를 반복합니다.
- 주사기에서 잎을 제거합니다. 부드럽지만 철저하게 표면의 액체를 제거하는 흡수 종이와 잎을 오 점.
- 침투 된 잎의 무게를 측정한다. 이전과 밀접 침윤 량에 근사 침윤 후 중량의 차이를 계산한다.
- 진공 플라스크에 의한 잎 침투 :
- 면도날을 사용하여 잎자루에서 식물 잎에서 분리.
- 잎 표면 오염물을 제거하기 위해 증류수에 의해 침수 갓 잎을 절제 헹군다. 부드럽게 흡수 종이 찍어 내듯 잎을 건조.
- 함침 전의 잎 무게를 측정한다.
- 250 ml의 또는 더 큰 쪽 팔 플라스크 공동으로 (여러 잎에 침투하는 경우 또는 잎) 잎을 배치증류수를 ntaining (다른 침투 유체는 토론을 참조 사용할 수있다). 완전히 액체와 잎을 커버한다.
- 플라스크에 진공을 적용합니다. 부드럽게 잎에서 공기 방울을 해제 선동. 조심스럽게 천천히 진공을 놓습니다.
참고 : 빨리 진공을 해제하는 세포 용해 및 세포질 오염의 원인이 될 수 있습니다. - 침투 지역의 어두운 색상으로 볼 때 잎까지 단계를 반복 1.3.5은 완전히 침투한다.
- 플라스크에서 잎을 제거합니다. 부드럽지만 철저하게 표면의 액체를 제거하는 흡수 종이와 잎을 오 점.
- 침투 된 잎의 무게를 측정한다. 이전과 밀접 침윤 량에 근사 침윤 후 중량의 차이를 계산한다.
- 원심 분리 AWF의 복구 :
- 4 인치 (10cm) 넓은 파라 필름의 조각에 잎을 놓습니다. 5 ml의 피펫 팁 (또는 비슷한 크기의 객체)를 사용하여,파라 필름 내에서 잎을 굴립니다.
- 20 ML의 주사기에 피펫 팁으로 올리고 잎을 넣습니다. 위쪽으로 향하게 어떤 컷 잎의 가장자리를 배치합니다. 깨끗한 50 ml의 폴리에틸렌 또는 폴리 카보네이트 튜브에 주사기를 삽입합니다.
- 4 ° C에서 스윙 버킷 로터 1,000 XG에 10 분 동안 튜브 내에서 주사기를 원심 분리기.
주 : 원심 다음 잎의 외관 검사는 침윤 유체의 대부분이 방출되었음을 보여한다. 어두운 녹색 패치는 추가 원심 분리 시간이 필요하다는 것을 나타냅니다. - 신선한 1.5 ml의 튜브에 복구 된 AWF을 피펫.
주 : AWF의 부피는 대략 그 잎에 대한 침윤 량과 일치한다; 볼륨이 추가 원심 분리 시간 후 적은 경우, 또는 원심 분리 속도가 필요합니다. - 5 분은 어떤 세포 또는 입자상 물질을 제거하는 15,000 XG에서 AWF 샘플을 원심 분리기. 또한, 레모하기 위해 0.22 μm의 필터를 통해 AWF 전달세포 및 입자상 물질을했습니다.
- 새로운 튜브에 뜨는을 피펫. 저장 될 때까지 얼음에 샘플을 유지합니다.
- -80 ° C에서 AWF 샘플을 저장합니다.
세포질 오염 2. 분석 실험
- 원심 분리 단계가 완료 직후 효소 반응 (예를 들어, 단백질 분해)를 최소화하고 분석을 수행하기 위해 얼음에 AWF 샘플을 보관하십시오.
주 : 대사 분석법, 샘플 추출 후 즉시 동결 될 수 있고, 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관. - 표준 말산 탈수소 효소를 들어 (MDH) 분석 프로토콜은 15 참조; 그렇지 않으면 시판 MDH 분석 키트를 사용합니다.
- 표준 글루코스 -6- 인산 탈수소 효소 (G6PDH) 분석 프로토콜은 16 참조; 그렇지 않으면 시판 G6PDH 분석 키트를 사용한다.
- 글루코오스 -6- 인산 (G-6-P) GC-MS를 사용하여 세포질과 같은 대사 정량 단계 5에 기술 된 바와 같이
Apoplast 희석 요인 3. 계산
- 단계 1.2.4 또는 1.3.4 (예를 들면, 증류수)에 위에서 사용 된 침투 유체의 두 개의 볼륨을 준비합니다. 50 μM의 최종 농도로 하나의 솔루션에 인디고 카민 분말을 추가 다른 아무것도 추가하지 않습니다.
- 플레이트 리더와 인디고 카민 침투 솔루션의 200 μL의 610 nm의 (OD 610)에서의 흡광도를 측정한다. 인디고 카민없이 OD에게 침투 솔루션 (610) 200 μl를 차감하여이 값을 수정합니다. 다음 식에 OD 610infiltrate 등이 보정 값을 대체합니다.
- (와 인디고 카민없이) 모두 침투 솔루션 (단계 1.2 또는 1.3) 상기 적어도 세 개의 복제 잎 침입을 수행합니다.
- 침투, R 후증류수에 잎 INSE 외부 표면에 남아있는 인디고 카민 존재를 제거합니다.
- (단계 1.4) 위와 같이 원심 분리를 진행합니다.
- 평균 OD에게 인디고 카민 AWF의 추출 610 200 μl를 결정합니다. 인디고 카민 무료 AWF의 200 μL의 평균 OD 610 값을 감산하여이 값을 수정합니다. 다음 식에 OD 610AWF 등이 보정 값을 대체합니다.
- 같은 보정 흡광도 값으로부터 희석 계수 (즉, 희석 배) 계산 :
Apoplast 희석 요인 = OD 610infiltrate / (OD의 610infiltrate - OD 610AWF) - 희석 계수를 AWF에서 곱하기 농도 또는 활동 값은 란타에 apoplastic 유체 농도 / 활동을 평가한다.
동결 건조하여 전체 강도에 AWF 4. 농도
- 동결 건조기를 켜십시오작동 온도 및 압력에서 안정화를 llow.
- 신선하거나 저장 AWF 샘플의 원하는 금액 풀.
- 2 ML의 원심 분리기 튜브 균등하게 샘플을 배포합니다.
- 재구성 볼륨을 결정합니다
재구성 용적 = 동결 건조 / apoplast 희석 인자 전에 볼륨 - 뚜껑이 닫힌 상태, 액체 질소에 튜브를 동결.
- 하나 이상의 냉장 동결 건조 선박에 고정 된 튜브를 전송합니다. 튜브를 전송하는 동안, 가스 교환을 허용하는 날카로운 물체로 관통 된 하나 뚜껑을 교체합니다.
- 동결 건조기에 혈관을 연결하고 완전히 샘플을 동결 건조.
- 기계로부터 샘플을 제거하고 증류수 계산 된 양을 첨가함으로써 재구성 AWF.
- unpierced 뚜껑을 교체하고 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다.
가스 크로마토 그래피 질량 분석 (17) 5. 대사 분석
<OL>Representative Results
건강한 삼주 된 P.에서 수행 AWF의 추출에 대한 일반적인 결과 이력서 vulgaris의. 함침 유체로서 증류수를 사용 Tendergreen 잎, 표 2에 나타낸다. 젊은 P. 심상 성 침윤 잎 의무이며, 여기에 사용 된 원심 분리 속도 (1000 XG)를 원심 분리에 의해 침윤 유체의 대부분의 제거는 잎을 원래로 되돌릴 녹색으로 직접 볼 수있다. P. 심상 잎 신선한 무게가 침투하기 전에 평균 1.1 XG있었습니다 그램 신선한 중량 당 AWF의 0.5 ml의 열매를 산출. AWF의 단백질 농도는 표준 ml를 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석을 이용하여 / 0.18 ± 0.08 (MG)로 측정되었다. 인디고 카민 희석을 측정함으로써 계산이 잎에 대한 희석 배수는 2.3 ± 0.3 배였다. 위의 값은 g 잎 신선한 우리 당 AWF의 수율을 결정하는 데 필요한 종 및 파일럿 실험 사이에 실질적으로 다를 수 있습니다광명뿐만 아니라 잎 소정 유형에 대해 예상 될 수 AWF 단백질 농도 및 희석 배수.
원심력이 너무 높으면, 셀의 무결성이 손상 압력의 변화가 너무 빠른 경우, 침투 단계에서 동시에 발생하고, 원심 분리 단계 동안있다. 그것은 세포질 오염 AWF 문자에 대해 샘플을 분석하는 것이 필요하다; 이상적으로, 여러 개의 독립적 인 분석이 수행됩니다. 여기서, 세 가지 분석으로부터 결과를 표 2에보고된다. P.의 잘 수행에서 추출한 심상 AWF는 G6PDH 표준 효소 분석에 의해 탐지했다. 이것은 G6PDH 활성 만 임계 원심력 12 이상 검출하게 다른 리포트와 일치한다. 대조적으로, 말산 탈수소 효소 활성 (2.5 U / ㎖)의베이스 라인 레벨 모두에서 검출되었다 P. 표준 대사 분석을 사용하여 심상 AWF 샘플. 에 대한 원심을 증가1000 XG의 임계 값 이상의 가전이 증가 MDH 활동 결과 (결과는 도시하지 않음). 다른 종으로부터 apoplast 내생 MDH 활동 18를 포함하도록 공지 된 바와 같이, 여기에서 검출 된 양이 기준선 수준 이상으로 정품 apoplastic 활성 및 현저한 증가를 고려 오염을 가리킨다. 이러한 육탄 -6- 포스페이트, 주로 세포질 것으로 생각되는 대사는 또한 AWF의 오염을 평가하기 위해 사용될 수있다. 여기에, GC-MS 분석 AWF의 추출에 G-6-P의 제로 또는 추적 레벨을 감지했습니다. 세포질 오염 (10)를 나타내는, 컷 옥수수 루트 섹션에 대비,으로 G-6-P는 모든 원심 분리 속도 AWF 추출 후 검출 된 더 높은 속도로 농도가 증가했다.
P.의 GC-MS에 의해 대사 산물 분석 60 식별 대사와 식별 할 수없는 화합물의 대략 동일한 수의 (그림 2) - 심상 잎 AWF는 일반적으로 40을 산출한다. 또는ganic 산, 단당류, 아미노산은 식별 대사 산물의 대부분은, 그러나, 이차 식물 대사 산물도 감지 AWF (11)에서 정량화 된 나타냅니다. 이들 상이한 분자 클래스에서 여러 예시적인 피크는도 2에 표시되어 하류 분석 기법은 예를 들어, 다양한 분자 정량화 이들 AWF 샘플들에 적용 가능하다 :. ICP-MS, NMR, HPLC, 원자 흡수 분광법, 단백질 질량 분석.
도 3에 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 SDS-PAGE 겔에 도시 apoplast의 단백질 성분은 AWF에 표시된다. 다른 역할 중에서도 apoplastic 효소는 세포벽의 합성과 세포 반응의 생성을 담당 산소 종. 다양한 종에서 AWF의 프로테옴 연구는 개별 단백질의 수십 식별 apoplast의 단백질 성분이 ENVIRO에 응답하는 것으로 나타났습니다nmental 스트레스 13, 19, 21, 23. 이상적으로 AWF 추출물은 인, rubisco와 같은 세포질 단백질에 의한 오염이 없어야한다 그러나 이것은 실제로 달성하기 어려울 것이다. SDS-PAGE ~ 53 kDa의 다음에 인, rubisco 단백질 밴드의 존재는 AWF 샘플들의 무결성을위한 추가의 정성 분석을 제공한다. 예를 들어, 그림 3에서 레인 2에 들어있는 샘플 레인 1의 인, rubisco 오염의 더 많은 양이 포함되어 있습니다.
| 위 Phaseolus는 AWF vulgaris의 | |
| AWF의 부피 (g -1 잎 FW) | 0.49 ± 0.09 |
| 단백질 진한. (MG ml의 1) | 0.18 ± 0.08 |
| 희석 배수 | 2.3 ± 0.3 |
| G6PDH 활동 (U ml의 1) | |
| GLC-6-P (-1 ㎖의 MG) | 아무도는 검출되지 |
| MDH 활동 (U ml의 1) | 2.5 ± 0.9 |
P.에서 AWF의 추출 표 2. 일반적인 결과 이력서 vulgaris의. Tendergreen 잎.
그림 1. 표준 apoplast 추출 워크 플로우. 숫자는 프로토콜의 단계를 참조하십시오.
그림 2. 예를 들어 P의 GC-MS 크로마토 그램. 이력서 vulgaris의. . Tendergreen AWF 번째 예 대사 산물의 피크는 1 - 말로 네이트, 2- 포스페이트, 3- 석시 네이트, 4- 알려지지 -5- 말산, 아스파라긴 6, 7 리비 톨 (내부 세인트andard) -8- 시트르산 -9- 글루코스, 10 - 이노시톨, 11 카페 산, 12- 수크로오스.
그림 3. SDS-PAGE 쿠마 P의 젤 스테인드 예.이 겔은 풍부한 plastidial 효소 인, rubisco에 의해 세포질 오염의 양에 차이가 두 AWF의 추출의 단백질 구성 요소 사이의 비교를 제공합니다. AWF 잎 추출물 vulgaris의. AWF 추출 후 두 샘플은 차가운 아세톤의 4 배를 초과 (v / v)의 아세톤 단백질 침전을 실시 하였다 10 분의 1 원래 볼륨에서 물에 재용. 레인 1과 2는 단백질 40 μg의 포함되어 있습니다. 인, rubisco 대형 체인에 대응하는 대역 (~ 53 kDa의)은 화살표로 표시된다. R의 M : 단백질 분자량 마커.
Discussion
식물 조직 소스를 최적화
apoplast 추출을 수행 할 때 생물 및 기술 변화가 클 수있다, 따라서 매우 표준화 된 워크 플로우 (그림 1) 실험에서 연속성을 증가하는 것이 도움이된다. 중요하게는, 식물 조직의 소스는 리프 타입, 리프 연령, 성장 / 일의 환경 조건으로 (표 1)의 시간을 포함하여, 표준화되어야한다. 큰 차이는 다른 나뭇잎이 침투되고 AWF 이후 원심 분리에 의해 회수되는 용이성 존재; 이러한 차이는 기공 번호, 조리개의 크기와 엽육 저항 (12, 14)과 관련된다. P. 심지어 다른 품종 중에서도 쉽고 AWF 추출 절차의 수율로 큰 차이가 vulgaris의; 여기에 사용되는 Tendergreen의 다양한 예를 잎에 대한 캐나다 원더 품종보다이 방법을 사용하여 AWF 추출에 더 많은 의무가 있습니다. 이내P.는 apoplastic 추출을 위해 그들에게 분명한 선택을하고, 최초의 진정한 잎에 침투하는 가장 큰 및 가장 쉬운 vulgaris의. apoplastic 공기와 물 볼륨이 AWF의 추출 성 (12, 14)의 차이에 이르는 여러 종의 잎 시대에 따라 변화하는 것으로 나타났다. P.에서 심상, 오래된 잎은 실질적으로 더 어려운 침투 해 원심 분리에 따라 적은 AWF을 얻었다 될; 그들이 전체 확장에 도달 한 시점 따라서 잎 수거 하였다.이어서 침투 AWF를 복구 원심 높은 속도를 필요로하기 어려운 떠난다. 하나는 따라서 신중하게 대규모 AWF의 추출을위한 조직 소스에 따라 결정하기 전에 여러 가지 잎의 종류와 품종을 선별해야한다.
식물 성장 조건은 실험의 컨텍스트 내에서 최대한 표준화되어야한다. 이들이 허용하는 성장 캐비닛의 사용이 바람직하다 일관된 습도, 온도 및 LIGHt 강도 연대는 유지되어야합니다. 등 대사 효소의 농도가 낮의주기 (14)에 걸쳐 다양하기 때문에 잎의 수확은 항상 날의 동일한 시간에 발생한다. 마지막으로, 공장이 모두 비슷한 팽압이 잎 수 있도록, 식물 (~ 1 시간) 수확하기 전에 빨리 물을해야합니다.
잎 침투와 원심 분리의 최적화
세포에 의해 발생하는 기계적 응력이 침투 또는 원심 분리 단계 동안 너무 높으면 인해 부분적인 세포 용해에 AWF의 바람직하지 않은 세포질 오염이 발생합니다. 따라서, 소정의 리프 형 절차는 수율을 최대화하고 AWF 세포질의 오염을 최소화 간의 최적 트레이드 오프해야한다. 모든 경우에, 하나는 AWF 잎 세포의 기계적인 혼란을 피하기 위해 회수 될 수있는 최저 속도로 원심 분리를 사용한다. centrifu의 최적화gation 원심 분리 속도는 속도 범위에 걸쳐 회수 양과 apoplast 오염을 모니터링하여 각 리프 유형에 대해 경험적으로 결정되어야한다. 그것은 같은 MDH, G6PDH 포도당 인산 이성화 효소로 그 마커 효소의 활동을 관찰되었다, 이러한 활동은 아마도 때문에 세포질 누출 9,12,14에, 빠르게 증가하는 이상 초과하는 임계 원심력 때까지 낮게 유지. 베이커 등. 2012 (11)에 의해 언급 된 바와 같이 원심 분리 단계 동안 지원 파라 필름의 사용은, AWF 추출 효율을 향상시킬 수 있고, 과도한 폴딩 및 압축에 의해 야기 엽신 기계적으로 손상을 최소화 할 수있다. 하나는 AWF 추출의 손상과 완전성의 잎을 조사해야 할 때 또한, 파라 필름의 사용은 원심 분리 후 잎의 시각화를 향상시킵니다.
한정한다 (12)는 D 아르 컷 쌀 잎 섹션에서 AWF 복구의 최적화를 설명ifficult는 침투 때문에 작은 기공 개구의 AWF를 수집하기 위해 더 높은 원심 분리 속도를 필요로합니다. 벼 잎 표면의 젖음성, 어느 증류수 잎 또는 침윤 유체에 계면 활성제를 첨가함으로써 향상 침지 처리, 침투 과정을 용이. 오염 apoplastic 12 모니터링하면서 더 높은 속도를 원심 분리 (6,000 XG)도 사용되었다. 잘라 리프 섹션을 사용하는 경우 세포질 오염조차 상처 부위를 광범위하게 세정하고 더 확산 될 것이라는 위험이 항상있다; 절단 잎 따라서 필요한 경우에만 사용해야합니다.
많은 연구 증류수 침투 유체 (11)로서 사용된다. 그러나, 화합물은 특정 apoplastic 화합물, 특히 13 단백질의 추출을 향상시키기 위해, 예컨대 염 또는 완충제, 침윤 유체에 첨가 될 수있다. Lohaus 14 O를 이온 삼투압 강도의 효과를 평가n은 복구 된 AWF의 구성과는 무시할 수를 발견했다. 침투 배지의 pH의 변화는, 그러나, AWF 조성물 (14)에 영향을 미칠 수있다.
추출 된 apoplastic 유체의 적절한 취급 및 보관이 중요합니다. AWF는 프로테아제 및 다른 효소의 풍부한 13, 20,뿐만 아니라 휘발성 유기 화합물을 함유하는 것으로 나타났다. 따라서,이 얼음하거나 -80 ° C에서 보관 샘플을 유지하는 것이 좋습니다 복구 후 AWF의 구성에 대한 변경 사항을 줄일 수 있습니다. 추출에 의한 단백질 분해, 장기 희석 효소의 불 활성화를 제한하거나 동결 해동을하는 후 또한, AWF의 효소 분석은 가능한 한 빨리 수행되어야한다.
침투 과정 apoplastic 유체 희석하고이 희석 범위를 결정하는 것이 필요하다. 원심 분리 공정은 또한 세포 내 구획에서 물로 희석 AWF있다. 희석 인자는해야한다측정 AWF에 만들어진 에드는 생체 apoplast 화학 물질 농도를 추정하기. 따라서 가능한 한 정확하게 생체 내 대사 물질의 농도에 일치 - 희석 인자는 또한 미생물이 성장 배지를 흉내 apoplast으로서 사용될 때 완전한 힘 AWF 다시 농축하는데 필요하다. 수 가지 변형 침투 유체에 추가 마커 화합물의 희석을 측정함으로써 AWF 희석 인자를 결정하기위한 단계 4에 기재된 방법에 존재한다. 모든 메소드에 대해 AWF 희석 계산 침윤 유체가 상당히 흡수되거나 AWF 복구 프로세스 동안 잎 세포에 의해 희석되지 않은 것으로 가정한다. 이 가정은 이전 침투 단계 (14)가 확인 되었으나 원심 분리 단계에서 확인되지된다. 마커 화합물은 또한, 흡수 운반 또는 apoplast에 동안을 수정해서는 안됩니다. 인디고 카민은 가장 널리 사용하고 철저하게 사용될 염료 시험AWF 희석 계산. 인디고 카민은 양이온 교환 수지와 격리 된 세포벽에 낮은 흡광도를 표시하고 브라 시카 napus에서 AWF 계산, Pisum의 sativum, 까 lycopersicum과 글리신 최대 11,21,22에 적합한 것으로 나타났다. 그러나 일부 잎 유형, 예를 들어, 쌀과 오이에, 인디고 카민 완전히 AWF 희석 요인 12,21의 과소 평가로 이어질 것이다 침투 후 복구 할 수 없습니다 등장. 그 감수성이 특히 스트레스 (24)에서, apoplast에서 생산되는 것으로 알려져있다 슈퍼 옥사이드 (23)에 의해 이사 틴 설포 네이트로 절단 할에 인디고 카민의 회복의 부족 때문일 수 있습니다. 이사 틴 네이트로 인디고 카민 개열은 610 nm에서 흡광도의 손실 및 245 nm에서의 증가를 초래한다. 이 반응은 apoplast에 상당한 정도로 수행 할 것인지, 또는 상기 반응은 infiltrat 슈퍼 옥사이드 제거제의 첨가에 의해 억제 될 수 있는지이온 액은 현재까지 조사되지 않았다. AWF의 안정성 및 복구가보고되지 않은 있지만 블루 덱스 트란이 쌀 AWF 희석 요인의 정량화 대신 인디고 카민의 사용 된 12 잎. 대안 적으로, [14 C] 소르비톨 또는 다른 정량 가능한 내부 표준 물질로서 방사성 표지 화합물 대신 염료 또는 방사능 농도 측정과 유사한 방법으로 11,14,25 희석 계수를 계산하는 데에 감소 사용될 수있다.
기술의 한계
몇 가지주의 사항이 침투 원심 AWF 분리 방법 존재합니다. 먼저, 침윤 동안 apoplast의 희석 공장에서 반응을 유도 할 수있다. 주변 셀 리프 apoplastic 유체의 특정 구성 요소에 대해 감소 된 농도를 검출하는 경우, 그들은 대사 산물 농도의 해석을 왜곡, 상기 대사 배설함으로써 응답 할 수있다. 에이 문제의 평가가 침윤하고 원심 분리 나 액의 침투에 적당한 이온 강도 사이의 시간 차이가 모두 추출 AWF 14, 22의 조성물에 영향을 관찰 하였다. 따라서, 희석 생각된다 apoplast에서 발생하는 모든 인공물이 최소화합니다.
두 번째 잠재적 인 단점은 원심 분리 AWF의 용출이 여러 가지 이유로 apoplast에 존재하는 모든 분자를 포착하지 않습니다. 특히 양이온과 단백질의 일부 화합물은 단단히 음전하 세포벽과 연관되고 13 AWF 용출 될 수있다. 단백질과 같은 다른 분자 (14)를 사용하는 원심 분리 속도로 apoplast에서 효율적으로 용출 너무 클 수 있습니다. 반응성 산소 종은 중요 apoplast 제조 화합물의 클래스 있지만 때문에 이들 화합물의 단기 자연, 그리고 이들의 제조에 대한 요구 불특정 그들의 PR 아르esence 잘 AWF 추출에 의해 캡처되지 않습니다. 그것은 AWF는 apoplast 유체의 생체 구성을 나타내며,이 종에 따라 다를 수 있습니다 얼마나 정확하게 알려져 있지 않다.
여러 분석은 어느 것도 보편적으로 인정되지 않지만, 세포질 오염을 결정하기 위해 존재한다. 주로 세포질 효소 분석 실험 (예를 들어, G6PDH, 탄당 인산 이성화, MDH)를 수행하기 쉬운있는 장점을 가지고 있지만 세포질 누설 (14, 18)과 상관 관계가되지 않을 수 있습니다. 세포질 대사 산물 (예를 들어, 육탄 당 인산염, 엽록소)의 평가는 아마도 더 나타내는하지만 덜 (11)이 설정됩니다. 그럼에도 불구하고, 분석 유형 중 하나는 샘플 사이 apoplastic 오염의 상대 정량 유용 할 수 있습니다. 이상적으로, 여러 개의 독립적 인 측정은 AWF 샘플의 무결성을 확인하는 데 사용되어야한다.
한계가 인정되지만, 침윤-centrifugati여기에 설명 된 기술에 apoplastic 단백질, 일차 및 이차 대사 산물 및 무기 이온의 연구에서 간단하고 강력한 기술 남아있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
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