Abstract
apoplast प्लाज्मा झिल्ली के बाहर स्थित है और कोशिका दीवार भी शामिल है कि संयंत्र के ऊतकों में एक विशिष्ट कोशिकी कम्पार्टमेंट है। पत्तियों को संयंत्र के apoplastic डिब्बे सेल दीवार गठन, सेलुलर पोषक तत्व और पानी तेज और निर्यात, संयंत्र endophyte बातचीत और रोगजनकों के लिए रक्षा प्रतिक्रियाओं सहित कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं, की साइट है। घुसपैठ-centrifugation के विधि अच्छी तरह से विभिन्न प्रजातियों के पौधे के घुलनशील apoplast संरचना के विश्लेषण के लिए एक मजबूत तकनीक के रूप में स्थापित है। इस विधि द्वारा प्राप्त द्रव सामान्यतः apoplast धोने तरल पदार्थ (AWF) के रूप में जाना जाता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल Phaseolus vulgaris (फ्रेंच बीन) CV से AWF निकासी के लिए एक अनुकूलित वैक्यूम घुसपैठ और centrifugation विधि का वर्णन है। Tendergreen पत्ते। इस पद्धति और अन्य प्रजातियों के पौधे के लिए प्रोटोकॉल के अनुकूलन की सीमाओं पर विचार-विमर्श कर रहे हैं। AWF बहाव के experimen की एक विस्तृत श्रृंखला में प्रयोग किया जा सकता बरामदapoplast की रचना के लिए चिह्नित करना चाहते हैं और यह संयंत्र प्रजातियों और जीनोटाइप, संयंत्र विकास और पर्यावरण की स्थिति के जवाब में बदलता कैसे, या सूक्ष्मजीवों apoplast तरल पदार्थ में बढ़ने का निर्धारण कैसे और इसकी संरचना में परिवर्तन करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए है कि टीएस।
Introduction
संयंत्र apoplast संयंत्र कोशिकाओं है कि चारों ओर कहनेवाला जगह नहीं है। यह कई चयापचय और परिवहन प्रक्रियाओं जगह ले जिसमें एक गतिशील वातावरण है। apoplast के प्रमुख संरचनात्मक घटक इकट्ठा किया और apoplast के भीतर स्थित एंजाइमों, संरचनात्मक प्रोटीन और चयापचयों द्वारा संशोधित किया गया है जो कोशिका दीवार है। स्वस्थ संयंत्र कोशिकाओं में apoplast आम तौर पर अमीनो एसिड, शर्करा और अन्य पोषक तत्वों के एच + symport एक से कोशिका द्रव्य को apoplast से आयात करने की अनुमति एक अम्लीय राज्य में बनाए रखा है। सूक्रोज परिवहन, apoplast के माध्यम से और फ्लोएम वाहिका में संश्लेषक स्रोतों से सूक्रोज चालों के दौरान; सूक्रोज तो सिंक अंगों 2 में सुक्रोज cleaving apoplastic invertases द्वारा बनाए रखा एक आसमाटिक संभावित द्वारा ले जाया जाता है। शुगर्स और अन्य पोषक तत्वों को भी ऊपर की तरफ ले जाया और स्वेद धारा 3 के माध्यम से रंध्र संबंधी cavities में जमा किया जा सकता है।
"> Apoplast भी कई रोगज़नक़ों उनके परजीवी जीवन शैली स्थापित जहां एक पर्यावरण आला प्रतिनिधित्व करता है। बैक्टीरियल संयंत्र रोगजनकों वे इस तरह के रंध्र के रूप में या घाव 4 के माध्यम से प्राकृतिक उद्घाटन के माध्यम से पहुँचने के जो apoplast में उच्च घनत्व, को गुणा करने की क्षमता है। अमीनो की एकाग्रता एसिड और बैक्टीरियल और फंगल रोगज़नक़ों 5,6 के पोषण आवश्यकताओं का समर्थन करने के लिए पर्याप्त होना दिखाया गया है apoplast टमाटर में अन्य नाइट्रोजन यौगिकों। माइक्रोबियल रोगज़नक़ों की ओर प्राथमिक रक्षा की प्रतिक्रियाएं भी, apoplast में कोशिकी पराक्सिडेजों द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में से अर्थात् उत्पादन घटित । और oxidases और पार से जोड़ने और callose बयान 7 के माध्यम से कोशिका दीवार को मजबूत बनाने के संयंत्र सेल दीवार विरोधी माइक्रोबियल गतिविधियों के साथ माध्यमिक चयापचयों में समृद्ध है, इन माध्यमिक चयापचयों के जैव रासायनिक प्रकृति प्रजाति 8 के बीच होती है।ऊपर उल्लेख का एक परिणाम के रूप मेंएड और अन्य प्रक्रियाओं, पत्ती apoplastic तरल पदार्थ प्रोटीन, शर्करा, कार्बनिक अम्ल, अमीनो एसिड, माध्यमिक चयापचयों, धातुओं और अन्य फैटायनों (जैसे, 2 मिलीग्राम +, + K, ना +, सीए 2 +, फ़े 03/02 की एक किस्म शामिल +)। शूटिंग के apoplast में घुला हुआ पदार्थ सांद्रता apoplast और जाइलम, फ्लोएम और कोशिका द्रव्य 9 के बीच होने वाली परिवहन प्रक्रियाओं के संतुलन से काफी हद तक नियंत्रित कर रहे हैं। हालांकि, चयापचय प्रतिक्रियाओं और माइक्रोबियल विकास भी भस्म हो या apoplastic विलेय का उत्पादन। apoplast की रचना प्रजातियों के पौधे और जीनोटाइप के बीच और प्रकाश, पोषण और जैविक और अजैविक तनाव 9 सहित पर्यावरण की स्थिति को बदलने के जवाब में अलग करने के लिए जाना जाता है। Apoplast की संरचना का अध्ययन करके और यह इस तरह के रेडॉक्स और आसमाटिक संभावित, पीएच, पोषक तत्व / मेटाबोलाइट उपलब्धता और enzymatic गतिविधियों के रूप में संपत्तियों सहित, कैसे बदलती है, एक पौधों को फिर से कैसे में उपन्यास अंतर्दृष्टि हासिल कर सकते हैंअपने पर्यावरण के लिए spond। यह चयापचयों और / या आयनों, अस्थिर क्षणिक या सेल की दीवार और प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़ा हो सकता है, जिसमें एक spatially संरचित और गतिशील कम्पार्टमेंट है क्योंकि समझ या apoplast समाधान में होते हैं कि आणविक परिवर्तन निस्र्पक जटिल है। इसके अलावा, विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकों विभिन्न रासायनिक प्रकार की रेंज को कवर करने के लिए आवश्यक हैं।
घुलनशील apoplast की संरचना का अध्ययन करने के लिए, तरल पदार्थ आम तौर पर ऊतक से निकाले जाने की जरूरत है। कई तरीकों एक नव प्रस्तावित फिल्टर पट्टी विधि 10 सहित विभिन्न ऊतकों से तरल पदार्थ apoplast निकालने के लिए मौजूद हैं, लेकिन पत्तियों के लिए सबसे स्थापित निकासी विधि घुसपैठ-centrifugation है। इस तकनीक को 11-13 पहले से मूल्यांकन किया गया है और Lohaus एट अल। 2001 14 विधि की तकनीकी मानकों से कई की एक पूरी तरह से परीक्षा प्रदान करते हैं। नाम, घुसपैठ-centrifu के रूप में निहितgation तकनीक अनिवार्य रूप से पत्तियों की कोमल centrifugation द्वारा घुसपैठ / apoplastic तरल पदार्थ मिश्रण की वसूली के द्वारा पीछा देशी apoplastic तरल पदार्थ के साथ घोला जा सकता है जो एक जलीय घुसपैठ तरल पदार्थ, साथ apoplastic हवा अंतरिक्ष के प्रतिस्थापन शामिल है कि एक दो कदम विधि है। बरामद तरल पदार्थ पतला है और apoplast में मौजूद सभी यौगिकों (देखें नीचे) को शामिल नहीं करता है, इस द्रव सामान्यतः apoplast धोने तरल पदार्थ (AWF), या कभी कभी कहनेवाला धोने तरल पदार्थ है, बजाय apoplastic तरल पदार्थ के रूप में जाना जाता है। घुसपैठ-centrifugation तकनीक पर्याप्त मात्रा के एकल या जमा AWF नमूने उत्पन्न और नीचे की ओर जैव रासायनिक और विश्लेषणात्मक तकनीकों (की एक विस्तृत श्रृंखला के अधीन करने की अनुमति आसानी से स्केलेबल है जैसे, प्रोटीन वैद्युतकणसंचलन, एंजाइम गतिविधि माप, एनएमआर, क्रोमैटोग्राफी और मास के कई प्रकार स्पेक्ट्रोमेट्री)। पत्ता AWF भी संयंत्र बस्तियां रोगाणुओं बुद्धि की बातचीत के अध्ययन के लिए मध्यम विकास नकल उतार एक apoplast के रूप में उपयोगी हैएच उनके पर्यावरण 5।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में हम Phaseolus CV vulgaris का उपयोग कर घुसपैठ-centrifugation तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए कैसे का वर्णन। Tendergreen पत्तियां, और metabolomics पर ध्यान देने के साथ नीचे की ओर विश्लेषण के कुछ उदाहरण देते हैं। महत्वपूर्ण बात है, विधियों AWF की गुणवत्ता अलग पत्ती प्रकार के लिए प्रक्रिया का अनुकूलन करने की सलाह के साथ प्रदान की जाती हैं आकलन करने के लिए।
Protocol
नोट: इन कारकों बहुत गुणवत्ता, परिवर्तनशीलता और AWF की उपज (चित्रा 1) को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में पत्ती सामग्री और संयंत्र विकास की स्थिति का मानकीकरण शुरू करने का विकल्प महत्वपूर्ण है। पर विचार करने के लिए पैरामीटर तालिका 1 में दिखाया जाता है और चर्चा में और अधिक विस्तार से चर्चा कर रहे हैं।
| पैरामीटर | उदाहरण standardizations | ||
| Phaseolus vulgaris | सोलेनम lycopersicum | Arabidopsis thaliana | |
| पत्ता प्रकार | पहली सच पत्तियों, पूरी तरह से विस्तार किया है, स्वस्थ | नीचे से शुरू 2 एन डी और 3 आरडी पत्ते, चार सबसे बड़े पत्रक apoplast निकासी के लिए इस्तेमाल नहीं किया शिखर पत्रक लिया | पूरी तरह से विस्तार थाली पत्ते |
| प्लांट उम्र | 21 दिन | 7-9 सप्ताह 7 सप्ताह | |
| दिन का समय | प्रकाश अवधि के बीच (12:00) | प्रकाश अवधि के बीच (12:00) | प्रकाश अवधि के बीच (12:00) |
| हाइड्रेशन | सभी पौधों को अच्छी तरह एक घंटा पूर्व फसल को पानी पिलाया | सभी पौधों को अच्छी तरह एक घंटा पूर्व फसल को पानी पिलाया | सभी पौधों को अच्छी तरह एक घंटा पूर्व फसल को पानी पिलाया |
| प्रकाश | 16 घंटा प्रकाश, 400 μmol एम -2 सेकंड -1 | 16 घंटा प्रकाश, 400 μmol एम -2 सेकंड -1 | सप्ताह 2 से 10 घंटा प्रकाश (कम दिन), 400 μmol एम -2 सेकंड -1 |
| नमी | 70% | 70% | 70% |
| तापमान | 22 डिग्री सेल्सियस प्रकाश, 18 डिग्री सेल्सियस अंधेरा | 22 डिग्री सेल्सियस प्रकाश, 18 डिग्री सेल्सियस अंधेरा | 21 डिग्री सेल्सियस |
मानकीकृत parame की तालिका 1. उदाहरणAWF एक्सट्रेक्शन में इस्तेमाल पत्तियों के लिए मंत्रियों।
1. उत्पन्न Apoplast धुलाई द्रव
नोट: संक्रमित पत्तियों से माइक्रोबियल रोगज़नक़ों inculding इस प्रोटोकॉल खतरनाक Materila के दौरान नीचे नाली धोया नहीं किया जाना चाहिए; बल्कि उचित निपटान की प्रक्रिया का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
- पत्ता आकार के आधार पर उपकरण चुनें:
- एक needleless सिरिंज का उपयोग छोटे पत्ते (जैसे, एराबिडोप्सिस, सेम) घुसपैठ। एक सिरिंज में फिट करने के लिए बहुत बड़ी हैं कि पत्तियों में घुसपैठ करने के लिए एक वैक्यूम फ्लास्क का प्रयोग करें। एक साथ कई पत्ते घुसपैठ करने के लिए वैक्यूम फ्लास्क विधि का प्रयोग करें।
- एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर छोटे वर्गों में उपलब्ध घुसपैठ विधि के लिए भी बड़े हैं कि पत्तियों फूट डालो। आसुत जल में अच्छी तरह से कटौती कुल्ला पत्ती वर्गों से पहले क्षतिग्रस्त कोशिकाओं से पसीजना कि साइटोप्लास्मिक को दूर करने के घुसपैठ करने के लिए।
- एक 60 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग पत्ता घुसपैठ:
- से पत्ती को अलग करेंएक रेजर ब्लेड का उपयोग कर डंठल में संयंत्र। ऐसे टमाटर के रूप में यौगिक पत्तियों के लिए, petiolule पर पत्रक अलग।
- पत्ती की सतह को दूर करने के लिए आसुत जल में डुबकी द्वारा हौसले excised पत्ती कुल्ला। धीरे शोषक ऊतक या कागज के साथ सोख्ता द्वारा पत्ती सूखी।
- घुसपैठ से पहले पत्ती वजन को मापने।
- ध्यान से रोल और / या एक 60 मिलीलीटर सिरिंज में पत्ती गुना और आसुत जल से सिरिंज भरने (अन्य घुसपैठ तरल पदार्थ चर्चा देखते हैं, इस्तेमाल किया जा सकता है)। लगभग 40 मिलीलीटर चिह्नित करने के लिए सवार को कम करते हुए सिरिंज के भीतर किसी भी हवा बाहर निकालें।
- एक दस्ताने उंगली या parafilm का एक टुकड़ा के साथ या तो सिरिंज टिप आवरण है, तो 60 मिलीलीटर चिह्नित करने के लिए बाहर सवार खींच कर सिरिंज के भीतर नकारात्मक दबाव बनाने के लिए। धीरे धीरे सवार जारी।
नोट: सेल और cytoplasmic संदूषण में हो सकता है दबाव रिहा जल्दी। - सिरिंज टिप हाल चलाना और किसी भी हवाई बेदखल करना है, तो टिप और प्रेस replugसवार पर आगे नीचे की ओर सकारात्मक दबाव का एक मामूली राशि बनाने के लिए।
- घुसपैठ क्षेत्रों के अंधेरे रंग के रूप में देखा पत्ता पूरी तरह से घुसपैठ की है, जब तक 1.2.6 - दोहराएँ 1.2.5 कदम।
- सिरिंज से पत्ता निकालें। धीरे लेकिन पूरी तरह सतह तरल निकालने के लिए शोषक कागज के साथ पत्ती धब्बा।
- घुसपैठ की पत्ती के वजन को मापने। पहले और बारीकी से घुसपैठ की मात्रा का अनुमान लगाती है जो घुसपैठ के बाद वजन में अंतर की गणना।
- वैक्यूम फ्लास्क से पत्ता घुसपैठ:
- एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर डंठल पर संयंत्र से पत्ती को अलग करें।
- पत्ती की सतह को दूर करने के लिए आसुत जल में डुबकी द्वारा हौसले excised पत्ती कुल्ला। धीरे शोषक कागज के साथ सोख्ता द्वारा पत्ती सूखी।
- घुसपैठ से पहले पत्ती वजन को मापने।
- एक 250 मिलीलीटर या बड़ा तरफ हाथ कुप्पी सह में (एकाधिक पत्ते घुसपैठ या अगर छोड़ देता है) का पत्ता रखेंआसुत जल ntaining (अन्य घुसपैठ तरल पदार्थ चर्चा देखते हैं, इस्तेमाल किया जा सकता है)। पूरी तरह से तरल के साथ पत्तियों को कवर किया।
- कुप्पी एक निर्वात लागू करें। धीरे पत्तियों से हवा के बुलबुले की रिहाई के लिए आंदोलन। ध्यान से और धीरे धीरे वैक्यूम जारी।
नोट: जल्दी निर्वात रिहा सेल और cytoplasmic संदूषण में हो सकता है। - घुसपैठ क्षेत्रों के अंधेरे रंग से देखा के रूप में पत्ता तक दोहराएँ चरण 1.3.5 पूरी तरह से घुसपैठ की है।
- कुप्पी से पत्ता निकालें। धीरे लेकिन पूरी तरह सतह तरल निकालने के लिए शोषक कागज के साथ पत्ती धब्बा।
- घुसपैठ की पत्ती के वजन को मापने। पहले और बारीकी से घुसपैठ की मात्रा का अनुमान लगाती है जो घुसपैठ के बाद वजन में अंतर की गणना।
- Centrifugation द्वारा AWF की वसूली:
- 4 इंच (10 सेमी) parafilm का एक टुकड़ा पर पत्ता रखें। एक 5 मिलीलीटर विंदुक टिप (या एक समान आकार की वस्तु) का उपयोग करना,Parafilm के भीतर पत्ती रोल।
- एक 20 मिलीलीटर सिरिंज में पिपेट टिप के साथ लुढ़का पत्ता डालें। ऊपर की ओर का सामना करना पड़ किसी भी कटौती की पत्ती किनारों स्थिति। एक स्वच्छ 50 मिलीलीटर पॉलीथीन या polycarbonate ट्यूब में सिरिंज डालें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूलते बाल्टी रोटर में 1000 XG पर 10 मिनट के लिए ट्यूब के भीतर सिरिंज अपकेंद्रित्र।
नोट: centrifugation के निम्नलिखित पत्तियों का दृश्य परीक्षा घुसपैठ तरल पदार्थ के बहुमत से निष्कासित कर दिया गया है कि प्रकट करना चाहिए। गहरे हरे रंग के धब्बे के अतिरिक्त centrifugation के समय की आवश्यकता है कि संकेत मिलता है। - ताजा 1.5 एमएल ट्यूबों में बरामद AWF पिपेट।
नोट: AWF की मात्रा लगभग कि पत्ती के लिए घुसपैठ मात्रा मैच चाहिए; मात्रा अतिरिक्त centrifugation समय तो कम है या अगर centrifugation गति की आवश्यकता है। - 5 मिनट के लिए किसी भी कोशिकाओं या बात कण को दूर करने के लिए 15,000 XG पर AWF नमूने अपकेंद्रित्र। वैकल्पिक रूप से, रेमो को 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से AWF पारितकोशिकाओं और बात कण किया है।
- एक ताजा ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला पिपेट। भंडारण तक बर्फ पर नमूने रखें।
- -80 डिग्री सेल्सियस पर AWF नमूनों की दुकान।
Cytoplasmic संदूषण के लिए 2. Assays
- Centrifugation के चरणों को पूरा कर रहे हैं के तुरंत बाद एंजाइमी प्रतिक्रियाओं (जैसे, प्रोटियोलिसिस) को कम करने और assays के प्रदर्शन करने के लिए बर्फ पर AWF नमूने रखें।
नोट: मेटाबोलाइट assays के लिए, नमूने तुरंत निकालने के बाद जमे हुए किया जा सकता है और उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। - एक मानक Malate डिहाइड्रोजनेज के लिए (MDH) परख प्रोटोकॉल 15 देखते हैं; अन्यथा एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध MDH परख किट का उपयोग करें।
- एक मानक जी 6 पीडी के लिए (G6PDH) परख प्रोटोकॉल 16 देखते हैं; अन्यथा एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध G6PDH परख किट का उपयोग करें।
- ऐसे ग्लूकोज-6-फॉस्फेट (जी-6-पी) जीसी एमएस उपयोग के रूप में साइटोप्लास्मिक चयापचयों की मात्रा का ठहराव के लिए चरण 5 में वर्णित के रूप में
Apoplast कमजोर पड़ने कारक 3. गणना
- कदम 1.2.4 या 1.3.4 (जैसे, आसुत जल) में ऊपर प्रयोग किया जाता घुसपैठ तरल पदार्थ के दो संस्करणों की तैयारी। 50 माइक्रोन की एक अंतिम एकाग्रता के लिए एक समाधान के लिए इंडिगो कारमाइन पाउडर जोड़ें दूसरे के लिए कुछ भी नहीं जोड़ें।
- एक प्लेट रीडर के साथ इंडिगो कारमाइन घुसपैठ समाधान के 200 μl के 610 एनएम (आयुध डिपो 610) में absorbance के उपाय। इंडिगो कारमाइन बिना आयुध डिपो घुसपैठ समाधान के 610 200 μl घटाकर द्वारा इस मूल्य सही। नीचे दिए गए समीकरण में आयुध डिपो 610infiltrate के रूप में यह सही मूल्य विकल्प।
- (के साथ और इंडिगो कारमाइन के बिना) दोनों घुसपैठ के समाधान के साथ (कदम 1.2 या 1.3) के ऊपर के रूप में कम से कम तीन दोहराने पत्ती घुसपैठ प्रदर्शन करते हैं।
- घुसपैठ, आर के बादआसुत जल में पत्ते INSE बाहरी सतहों पर किसी भी शेष इंडिगो कारमाइन उपस्थित हटाने के लिए।
- (1.4 कदम) के ऊपर के रूप में centrifugation के साथ आगे बढ़ें।
- औसत आयुध डिपो इंडिगो कारमाइन AWF एक्सट्रेक्शन के 610 200 μl निर्धारित करते हैं। इंडिगो कारमाइन मुक्त AWF के 200 μl की औसत आयुध डिपो 610 मूल्य को घटाकर की इस मूल्य सही। नीचे दिए गए समीकरण में आयुध डिपो 610AWF के रूप में यह सही मूल्य विकल्प।
- के रूप में सही absorbance के मूल्यों से कमजोर पड़ने कारक (यानी, कमजोर पड़ने गुना) की गणना:
Apoplast कमजोर पड़ने कारक = आयुध डिपो 610infiltrate / (आयुध डिपो 610infiltrate - आयुध डिपो 610AWF) - कमजोर पड़ने कारक द्वारा AWF से गुणा एकाग्रता या गतिविधि मूल्यों Planta में apoplastic तरल पदार्थ में एकाग्रता / गतिविधि का अनुमान लगाने के लिए।
फ्रीज सुखाने से पूरी ताकत के AWF 4. एकाग्रता
- फ्रीज सुखाने की मशीन और एक चालू करेंकाम कर रहे तापमान और दबाव में स्थिर करने के लिए यह llow।
- ताजा या संग्रहीत AWF नमूने के वांछित राशि पूल।
- 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के बीच समान रूप से नमूने वितरित करें।
- पुनर्गठन मात्रा का निर्धारण:
पुनर्गठन मात्रा = फ्रीज सुखाने / apoplast कमजोर पड़ने कारक से पहले मात्रा - पलकों को बंद कर दिया साथ, तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों फ्रीज।
- एक या अधिक ठंडा फ्रीज सुखाने वाहिकाओं के लिए जमे हुए ट्यूबों स्थानांतरण। ट्यूब के हस्तांतरण, वहीं गैस विनिमय अनुमति देने के लिए एक तेज वस्तु के साथ में छेद किया गया है कि एक साथ ढक्कन की जगह।
- फ्रीज सुखाने की मशीन के लिए जहाजों देते हैं और पूरी तरह से नमूने lyophilize।
- मशीन से नमूने निकालें और आसुत जल की गणना की राशि जोड़कर AWF पुनर्गठित।
- Unpierced ढक्कन बदलें और -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान।
गैस क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री 17 से 5. metabolite विश्लेषण
<राजभाषा>Representative Results
स्वस्थ तीन सप्ताह पुरानी पी पर प्रदर्शन AWF एक्सट्रेक्शन के लिए विशिष्ट परिणाम CV vulgaris। घुसपैठ तरल पदार्थ के रूप में आसुत जल का उपयोग कर Tendergreen पत्ते, 2 टेबल में दिखाए जाते हैं। युवा पी vulgaris के पत्ते घुसपैठ करने के लिए उत्तरदायी हैं, और यहां इस्तेमाल किया centrifugation गति से (1000 XG) centrifugation द्वारा घुसपैठ तरल पदार्थ के बहुमत को हटाने की पत्तियों को उनके मूल हरे रंग पर वापस लौटने के रूप में सीधे देखा जा सकता है। पी संतरा पत्ता ताजा वजन घुसपैठ से पहले औसत 1.1 XG पर था और ग्राम ताजा वजन के प्रति AWF के 0.5 मिलीलीटर झुकेंगे। AWF के प्रोटीन एकाग्रता मिलीलीटर एक मानक ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का उपयोग / 0.18 ± 0.08 मिलीग्राम होने के लिए निर्धारित किया गया था। इंडिगो कारमाइन कमजोर पड़ने मापने द्वारा गणना की इन पत्तियों, के लिए कमजोर पड़ने कारक, 2.3 ± 0.3 गुना था। ऊपर मूल्यों ग्राम पत्ता ताजा हम प्रति AWF की उपज का निर्धारण करने के लिए आवश्यक हैं प्रजातियों और पायलट प्रयोगों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैंight, साथ ही एक दिया पत्ती प्रकार के लिए उम्मीद की जा सकती है कि AWF प्रोटीन एकाग्रता और कमजोर पड़ने कारक।
केन्द्रापसारक बल बहुत अधिक है अगर कोशिकाओं की अखंडता को नुकसान दबाव में परिवर्तन भी तेजी से कर रहे हैं, घुसपैठ चरण के दौरान दोनों पाए जाते हैं, और centrifugation कदम के दौरान कर सकते हैं। यह साइटोप्लास्मिक संदूषण का मार्करों के लिए AWF नमूने परख करने के लिए इसलिए जरूरी है; आदर्श रूप में, कई स्वतंत्र assays के प्रदर्शन कर रहे हैं। इधर, तीन संभावित assays से परिणाम तालिका 2 में रिपोर्ट कर रहे हैं। पी की अच्छी तरह से प्रदर्शन किया एक्सट्रेक्शन में संतरा AWF, G6PDH एक मानक एंजाइम परख द्वारा undetectable था। इस G6PDH गतिविधि केवल एक सीमा केन्द्रापसारक बल 12 से ऊपर पता लगाने योग्य हो जाता है, जहां अन्य रिपोर्ट के साथ संगत है। इसके विपरीत, Malate डिहाइड्रोजनेज गतिविधि (2.5 यू / एमएल) की एक आधारभूत स्तर सभी पी में detectable था एक मानक चयापचय परख का उपयोग vulgaris AWF नमूने हैं। के लिए केन्द्रापसारक बढ़ाने से1000 XG की एक सीमा से ऊपर सीई वृद्धि हुई MDH गतिविधियों के परिणामस्वरूप (परिणाम) नहीं दिखाया। अन्य प्रजातियों से apoplast अंतर्जात MDH गतिविधि 18 को शामिल करने के लिए जाना जाता है, यहां पता चला राशि इस आधार रेखा के स्तर से ऊपर वास्तविक apoplastic गतिविधि और काफी बढ़ जाती है माना जाता है संदूषण का संकेत कर रहे हैं। ऐसे hexose-6-फॉस्फेट के रूप में, मुख्य रूप से cytoplasmic माना जाता है कि चयापचयों भी AWF के प्रदूषण का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इधर, जीसी एमएस विश्लेषण AWF एक्सट्रेक्शन में जी-6-पी के शून्य या स्तर का पता लगाने का पता चला। साइटोप्लास्मिक संदूषण 10 का संकेत है, कट मक्का जड़ वर्गों में इसके विपरीत, जी-6-पी सभी centrifugation के गति पर AWF निकालने के बाद पता चला था और उच्च गति पर एकाग्रता में वृद्धि हुई है।
पी के जीसी एमएस द्वारा metabolite विश्लेषण 60 से पहचाने जाने चयापचयों और न पहचाने जाने यौगिकों के लगभग समान संख्या (चित्रा 2) - vulgaris पत्ती AWF आम तौर पर 40 से अर्जित करता है। याganic एसिड होता है, सरल शर्करा, और एमिनो एसिड से पहचाने जाने चयापचयों के थोक, हालांकि, माध्यमिक संयंत्र चयापचयों भी पता लगाया है और AWF 11 से मात्रा निर्धारित किया गया है प्रतिनिधित्व करते हैं। इन विभिन्न अणु वर्गों से कई उदाहरण चोटियों चित्रा 2 में चिह्नित कर रहे हैं इसके अलावा बहाव के विश्लेषणात्मक तकनीकों उदाहरण के लिए, विभिन्न अणुओं यों तो इन AWF नमूने के लिए लागू कर रहे हैं:। आईसीपी एमएस, एनएमआर, एचपीएलसी, परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी, प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोमेट्री।
चित्रा 3 में Coomassie खूब ब्लू दाग एसडीएस पृष्ठ जेल के रूप में दिखाया apoplast के प्रोटीन घटक भी AWF में प्रतिनिधित्व किया है। अन्य भूमिकाओं के अलावा, apoplastic एंजाइमों कोशिका दीवार के संश्लेषण और बाह्य प्रतिक्रियाशील के निर्माण के लिए जिम्मेदार हैं ऑक्सीजन प्रजातियों। विभिन्न प्रजातियों से AWF की प्रोटिओमिक पढ़ाई व्यक्तिगत प्रोटीन के दर्जनों पहचान की है और apoplast के प्रोटीन घटक Enviro के लिए जवाब है कि पता चला हैnmental तनाव 13,19। आदर्श रूप में AWF निकालने ऐसे Rubisco रूप cytoplasmic प्रोटीन से संक्रमण से मुक्त किया जाना चाहिए; हालांकि व्यवहार में इस लक्ष्य को हासिल करना मुश्किल है। एसडीएस पृष्ठ निम्नलिखित ~ 53 केडीए में एक Rubisco प्रोटीन बैंड की उपस्थिति AWF नमूनों की अखंडता के लिए एक और गुणात्मक परख प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 में लेन दो में भरी हुई नमूना लेन एक की कि Rubisco संदूषण की एक बड़ी राशि शामिल है।
| Phaseolus AWF vulgaris | |
| AWF की मात्रा (एमएल जी -1 पत्ती परिवार कल्याण) | 0.49 ± 0.09 |
| प्रोटीन सान्द्र। (एमजी मिलीलीटर -1) | 0.18 ± 0.08 |
| कमजोर पड़ने कारक | 2.3 ± 0.3 |
| G6PDH गतिविधि (यू मिलीलीटर -1) | |
| GLC-6-पी (मिलीग्राम मिलीलीटर -1) | कोई भी पता लगाया |
| MDH गतिविधि (यू मिलीलीटर -1) | 2.5 ± 0.9 |
पी से AWF एक्सट्रेक्शन के लिए तालिका 2. ठेठ परिणाम CV vulgaris। Tendergreen पत्ते।
चित्रा 1. मानक apoplast निकासी कार्यप्रवाह। संख्या प्रोटोकॉल में चरणों को देखें।
चित्रा 2. एक उदाहरण पी के जीसी एमएस वर्णलेख। CV vulgaris। । Tendergreen AWF गिने उदाहरण मेटाबोलाइट चोटियों कर रहे हैं: 1-malonate, 2-फॉस्फेट, 3-succinate, 4-अज्ञात, 5-Malate, 6-asparagine, 7-ribitol (आंतरिक सेंटandard), 8-साइट्रेट, 9-ग्लूकोज, 10-inositol, 11-caffeic एसिड, 12-सूक्रोज।
चित्रा 3. एसडीएस पृष्ठ Coomassie पी की जेल दाग एक उदाहरण है। इस जेल प्रचुर मात्रा में plastidial एंजाइम Rubisco द्वारा साइटोप्लास्मिक संदूषण की राशि में मतभेद है कि दो AWF एक्सट्रेक्शन के प्रोटीन घटकों के बीच एक तुलना प्रदान करता है। AWF पत्ती निष्कर्षों vulgaris। AWF निकासी के बाद दोनों के नमूने ठंड एसीटोन का एक चार गुना अधिक (वी / वी) में एसीटोन प्रोटीन तेज़ी के अधीन थे और दसवां मूल मात्रा में पानी में resolubilized। 1 गलियों और 2 प्रोटीन का 40 माइक्रोग्राम प्रति होते हैं। Rubisco बड़ी श्रृंखला के लिए इसी बैंड (~ 53 केडीए) एक तीर से संकेत दिया है। एम आर: प्रोटीन आणविक वजन मार्करों।
Discussion
प्लान्ट टिशू स्रोत का अनुकूलन
Apoplast एक्सट्रेक्शन जब प्रदर्शन जैविक और तकनीकी भिन्नता बड़ा हो सकता है, इस प्रकार एक अत्यधिक मानकीकृत कार्यप्रवाह (चित्रा 1) प्रयोगों भर में निरंतरता को बढ़ाने के लिए उपयोगी है। महत्वपूर्ण बात है, संयंत्र के ऊतकों के स्रोत पत्ती प्रकार, पत्ती उम्र, विकास / पर्यावरण की स्थिति और दिन (तालिका 1) के समय सहित, मानकीकृत किया जाना चाहिए। बड़े मतभेद अलग पत्तियों में घुसपैठ कर रहे हैं और AWF बाद में centrifugation द्वारा बरामद जिसके साथ आराम में मौजूद हैं; इन मतभेदों रंध्र संख्या, एपर्चर आकार और मेज़ोफिल प्रतिरोध 12,14 के साथ सहसंबद्ध होते हैं। यहां तक कि पी के विभिन्न किस्मों के बीच आसानी और AWF निष्कर्षण प्रक्रिया की उपज में बड़े मतभेद हैं vulgaris; यहां इस्तेमाल Tendergreen किस्म का उदाहरण पत्तियों के लिए कनाडा वंडर फसल की तुलना में इस पद्धति का उपयोग AWF निकासी के लिए उत्तरदायी हैं। अंदरपी apoplastic एक्सट्रेक्शन के लिए उन्हें स्पष्ट पसंद है, जिससे पहली सच पत्तियों में घुसपैठ के लिए सबसे बड़ा और सबसे आसान कर रहे हैं vulgaris। apoplastic हवा और पानी की मात्रा AWF extractability 12,14 में मतभेद के लिए अग्रणी कई प्रजातियों में पत्ता उम्र के साथ बदलती करने के लिए दिखाया गया है। पी में संतरा, पुराने पत्ते काफी अधिक मुश्किल घुसपैठ और centrifugation पर कम AWF उपज के लिए हो; वे पूर्ण विस्तार पर पहुंच गया जब इसलिए पत्ते काटा गया। बाद में घुसपैठ AWF ठीक करने के लिए उच्च centrifugation गति की आवश्यकता के लिए मुश्किल हैं जो बचता है। एक इसलिए सावधानी से बड़े पैमाने पर AWF एक्सट्रेक्शन के लिए एक ऊतक स्रोत पर निर्णय लेने से पहले कई अलग पत्ती प्रकार और किस्मों स्क्रीन चाहिए।
संयंत्र के विकास की स्थिति भी प्रयोग के संदर्भ में जितना संभव हो उतना मानकीकृत किया जाना चाहिए। वे अनुमति के रूप में विकास मंत्रिमंडल के उपयोग के लिए बेहतर है लगातार नमी, तापमान और lighटी तीव्रता रेजिमेंटों को बनाए रखा जाएगा। आदि चयापचयों, एंजाइमों, की सांद्रता दीन का चक्र 14 भर में अलग-अलग हो क्योंकि पत्तों की कटाई हमेशा दिन के एक ही समय में हो जाना चाहिए। अंत में, संयंत्र सभी समान टर्गर प्रेशर है छोड़ देता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए, पौधों (~ 1 घंटा) फसल से पहले जल्द ही पानी पिलाया जाना चाहिए।
पत्ती घुसपैठ और centrifugation का अनुकूलन
कोशिकाओं द्वारा सामना करना पड़ा यांत्रिक तनाव घुसपैठ या centrifugation चरणों के दौरान बहुत अधिक है की वजह से आंशिक सेल करने के लिए AWF की अवांछनीय साइटोप्लास्मिक संदूषण परिणाम होगा। इसलिए, एक दिया पत्ती प्रकार के लिए प्रक्रिया उपज को अधिकतम और AWF के cytoplasmic संदूषण को कम करने के बीच एक अनुकूलित व्यापार बंद होना चाहिए। सभी मामलों में, एक AWF पत्ता कोशिकाओं के संभावित यांत्रिक व्यवधान से बचने के लिए ठीक किया जा सकता है, जिस पर सबसे कम centrifugation गति का उपयोग करना चाहिए। Centrifu का अनुकूलनgation गति centrifugation गति की एक सीमा से अधिक बरामद की मात्रा और apoplast संदूषण की निगरानी के द्वारा प्रत्येक पत्ती प्रकार के लिए अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। यह ऐसी MDH, G6PDH और ग्लूकोज-फॉस्फेट आइसोमेरेस रूप में है कि मार्कर एंजाइम की गतिविधियों, देखा गया है, इन गतिविधियों संभवतः कारण साइटोप्लास्मिक रिसाव 9,12,14 के लिए तेजी से वृद्धि हुई है जो ऊपर को पार कर जाता है एक सीमा केन्द्रापसारक बल, जब तक कम रहेगा। बेकर एट अल। 2012 11 द्वारा नोट के रूप में centrifugation कदम के दौरान समर्थन के लिए parafilm का उपयोग करते हैं, AWF निकासी की प्रभावकारिता में सुधार कर सकते हैं और अत्यधिक तह और संपीड़न की वजह से पत्ता ब्लेड को यांत्रिक क्षति को कम कर सकते हैं। एक AWF निकासी की क्षति और पूर्णता के लिए पत्ती की जांच करनी चाहिए जब इसके अलावा, parafilm का उपयोग centrifugation के बाद पत्ती के दृश्य को बेहतर बनाता है।
Nouchi 12 घ हैं जो कटौती चावल पत्ती वर्गों से AWF वसूली के अनुकूलन का वर्णनifficult घुसपैठ और क्योंकि उनके छोटे रंध्र संबंधी उद्घाटन के AWF इकट्ठा करने के लिए उच्च centrifugation गति की आवश्यकता होती है। चावल पत्ती की सतह से गीला है, या तो आसुत जल में पत्ते या घुसपैठ तरल पदार्थ के लिए एक surfactant के अलावा presoaking द्वारा सुधार, घुसपैठ प्रक्रिया में मदद की। Apoplastic संदूषण 12 के लिए निगरानी, जबकि एक उच्च centrifugation गति (6000 XG) का भी इस्तेमाल किया गया था। कटौती का पत्ता वर्गों का उपयोग करते समय साइटोप्लास्मिक संदूषण भी घाव साइटों की व्यापक धोने के साथ अधिक प्रचलित हो जाने का जोखिम हमेशा बना रहता है; कटौती के पत्तों इसलिए केवल जब आवश्यक इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
कई अध्ययनों के लिए आसुत जल घुसपैठ द्रव 11 के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। हालांकि, यौगिकों कुछ apoplastic यौगिकों, विशेष रूप से प्रोटीन 13 की निकासी में सुधार करने के लिए, इस तरह के लवण या बफ़र्स के रूप में, घुसपैठ तरल पदार्थ में जोड़ा जा सकता है। Lohaus 14 ओ आयनिक और आसमाटिक शक्ति के प्रभाव का मूल्यांकनएन बरामद AWF की संरचना और नगण्य होने के लिए उन्हें मिल गया। घुसपैठ माध्यम की पीएच में परिवर्तन, हालांकि, AWF रचना 14 प्रभावित कर सकता है।
निकाले apoplastic तरल पदार्थ का उचित हैंडलिंग और भंडारण के लिए महत्वपूर्ण है। AWF एक प्रोटिएजों और अन्य एंजाइमों 13,20 की बहुतायत है, साथ ही वाष्पशील कार्बनिक यौगिक होते दिखाया गया है। इसलिए, यह बर्फ पर या अन्यथा -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत नमूनों रखने की सिफारिश की है वसूली के बाद AWF की संरचना में परिवर्तन को कम करने के लिए। निकासी के कारण प्रोटियोलिसिस, लंबे समय तक कमजोर पड़ने के लिए एंजाइम निष्क्रियता की सीमा या फ्रीज विगलन करने के बाद इसके अलावा, AWF के enzymatic assays के रूप में जल्द ही संभव के रूप में किया जाना चाहिए।
घुसपैठ की प्रक्रिया apoplastic द्रव dilutes और यह इस कमजोर पड़ने की सीमा निर्धारित करने के लिए अक्सर आवश्यक है। centrifugation कदम भी intracellular डिब्बों से पानी के साथ AWF पतला हो सकता है। एक कमजोर पड़ने कारक की जरूरत हैमाप AWF पर किया जाता है जब एड में विवो apoplast रासायनिक सांद्रता अनुमान लगाने के लिए। इस प्रकार के रूप में सही रूप में संभव के रूप में विवो मेटाबोलाइट सांद्रता में मिलान - एक कमजोर पड़ने कारक भी यह रोगाणुओं के लिए मध्यम विकास नकल उतार एक apoplast के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है जब पूरी ताकत वापस करने के लिए AWF ध्यान केंद्रित करने की जरूरत है। कई रूपों घुसपैठ तरल पदार्थ में जोड़ा एक मार्कर परिसर के कमजोर पड़ने को मापने के द्वारा AWF कमजोर पड़ने कारक का निर्धारण करने के लिए चरण 4 में वर्णित विधि पर मौजूद हैं। सभी तरीकों के लिए AWF कमजोर पड़ने गणना घुसपैठ द्रव appreciably अवशोषित या AWF वसूली प्रक्रिया के दौरान पत्ता कोशिकाओं द्वारा पतला नहीं है कि मानता है। यह धारणा पहले से घुसपैठ कदम 14 के लिए सत्यापित किया गया है लेकिन centrifugation कदम के लिए असत्यापित है। मार्कर यौगिक भी, अवशोषित जाया या apoplast में जबकि संशोधित नहीं किया जाना चाहिए। इंडिगो कारमाइन सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है और अच्छी तरह से इस्तेमाल रंगों का परीक्षण किया जाता हैAWF कमजोर पड़ने की गणना के लिए। इंडिगो कारमाइन कटियन विनिमय राल और पृथक सेल दीवारों के लिए एक कम absorbance के प्रदर्शित करता है और ब्रैसिका napus में AWF गणना, Pisum सटाइवम, सोलेनम lycopersicum और ग्लाइसिन मैक्स 11,21,22 के लिए उपयुक्त होना दिखाया गया था। हालांकि, कुछ पत्ती प्रकार, जैसे, चावल और ककड़ी में, इंडिगो कारमाइन पूरी तरह AWF कमजोर पड़ने कारक 12,21 के एक मूल्यवान समझना के लिए नेतृत्व करेंगे जो घुसपैठ के बाद बरामद नहीं किया जा दिखाई दिया। इसकी संवेदनशीलता को विशेष रूप से तनाव 24 के तहत, apoplast में उत्पादित करने के लिए जाना जाता है, जो सुपर 23 ने isatin सल्फ़ोनेट में दरार करने के लिए इंडिगो कारमाइन की वसूली की कमी की वजह से हो सकता है। Isatin सल्फ़ोनेट में इंडिगो कारमाइन की दरार 610 एनएम पर absorbance का एक नुकसान और 245 एनएम पर वृद्धि में परिणाम होगा। इस प्रतिक्रिया apoplast में एक प्रशंसनीय हद तक तब होता है या नहीं, या इस प्रतिक्रिया infiltrat को सुपर मैला ढोने वालों के अलावा द्वारा हिचकते जा सकता है कि क्याआयन द्रव तिथि करने के लिए जांच नहीं की गई। AWF में अपनी स्थिरता और वसूली नहीं बताया गया है, हालांकि ब्लू dextran के चावल में AWF कमजोर पड़ने कारक की मात्रा का ठहराव के लिए बजाय इंडिगो कारमाइन का इस्तेमाल किया गया है, 12 छोड़ता है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह [14 सी] सोर्बिटोल या अन्य मात्रात्मक आंतरिक मानकों के रूप में radiolabelled यौगिकों के बजाय रंगों और रेडियोधर्मिता या एकाग्रता मापा जाता है और एक अनुरूप रास्ता 11,14,25 में कमजोर पड़ने कारक की गणना करने के लिए इस्तेमाल में कमी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
तकनीक की सीमाएं
कुछ निरंतर घुसपैठ-centrifugation के AWF अलगाव विधि के लिए मौजूद हैं। सबसे पहले, घुसपैठ के दौरान apoplast के कमजोर पड़ने संयंत्र से एक प्रतिक्रिया बटोर सकता है। आसपास के पत्ता कोशिकाओं apoplastic तरल पदार्थ के कुछ घटकों के लिए एक कम एकाग्रता पता चलता है तो वे मेटाबोलाइट सांद्रता की व्याख्या विकृत, आगे चयापचयों excreting से जवाब हो सकता है। मेंइस समस्या का एक आकलन यह घुसपैठ और centrifugation और न ही घुसपैठ तरल पदार्थ की आयनिक शक्ति में उदारवादी मतभेदों के बीच के समय न तो निकाले AWF 14,22 की संरचना प्रभावित है कि मनाया गया। इसलिए, कमजोर पड़ने लगा रहे हैं apoplast से उत्पन्न किसी भी कलाकृतियों कम से कम हो।
एक दूसरा संभावित वापसी centrifugation द्वारा AWF की क्षालन कई कारणों के लिए apoplast में मौजूद सभी अणुओं पर कब्जा नहीं करता है। विशेष फैटायनों और प्रोटीन में कुछ यौगिकों, कस नकारात्मक आरोप लगाया सेल की दीवार के साथ जुड़े और AWF 13 के साथ elute नहीं किया जा सकता है। इस तरह के प्रोटीन के रूप में अन्य अणुओं 14 का इस्तेमाल किया centrifugation के गति पर apoplast से बाहर कुशलता elute करने के लिए बहुत बड़ी हो सकती है। रिएक्टिव ऑक्सीजन प्रजातियों एक महत्वपूर्ण apoplast में उत्पादित परिसर के वर्ग है, लेकिन कारण इन यौगिकों के अल्पकालिक प्रकृति के कारण, और उनके उत्पादन के लिए अनिर्दिष्ट आवश्यकताओं, उनके जनसंपर्क कर रहे हैंesence अच्छी तरह AWF निष्कर्षण द्वारा कब्जा नहीं कर रहा है। यह AWF apoplast तरल पदार्थ के vivo रचना का प्रतिनिधित्व करता है और इस प्रजाति के बीच भिन्न हो सकते हैं सही कैसे ज्ञात नहीं है।
कई assays के कोई भी सार्वभौमिक स्वीकार कर रहे हैं, हालांकि साइटोप्लास्मिक संदूषण का निर्धारण करने के लिए मौजूद हैं। मुख्य रूप से cytoplasmic एंजाइमों के assays (जैसे, G6PDH, hexose फॉस्फेट आइसोमेरेस, MDH) प्रदर्शन करने के लिए आसान होने का लाभ उठा रहे हैं लेकिन साइटोप्लास्मिक रिसाव 14,18 के साथ अच्छी तरह से मेल नहीं हो सकता है। साइटोप्लास्मिक चयापचयों (जैसे, hexose फॉस्फेट, क्लोरोफिल) के आकलन शायद अधिक संकेत है, लेकिन अच्छी तरह से कम 11 की स्थापना की है। फिर भी, परख के किसी भी प्रकार के नमूने के बीच apoplastic संदूषण के रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी हो सकता है। आदर्श रूप में, कई स्वतंत्र माप AWF नमूना की अखंडता को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
अपनी सीमाओं को स्वीकार करते हैं, घुसपैठ-centrifugatiयहाँ वर्णित तकनीक पर apoplastic प्रोटीन, प्राथमिक और माध्यमिक चयापचयों और अकार्बनिक आयनों के अध्ययन में एक सरल और मजबूत तकनीक बनी हुई है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
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