Abstract
apoplastı plazma zarı dışında yer alır ve hücre duvarı içeren bitki dokularında belirgin bir hücre dışı bölme olduğunu. yaprakları bitkinin apoplastik bölmesi hücre duvarı oluşumu, hücresel besin ve su alımı ve ihracat, bitki-endophyte etkileşimleri ve patojenlere karşı savunma yanıtları dahil olmak üzere birçok önemli biyolojik süreçlerin, sitedir. infiltrasyon-santrifüj metodu da çeşitli bitki türlerinin çözünür apoplastı bileşiminin analizi için güçlü bir yöntem olarak kurulur. Bu yöntemle elde edilen sıvılar yaygın bir apoplastı yıkama sıvısı (AWF) olarak da bilinir. Aşağıdaki protokol Phaseolus vulgaris (Fransızca fasulye) cv gelen AÇD çıkarılması için optimize edilmiş vakum infiltrasyon ve santrifüj yöntemi açıklamaktadır. Tendergreen yaprakları. Bu yöntemin ve diğer bitki türleri için protokol optimizasyonu sınırlamaları tartışılmıştır. AWF alt baş experimen geniş bir aralığında kullanılabilir Kurtarılanapoplast bileşimini karakterize etmeye ve bitki türlerinin ve genotip, bitki gelişimi ve çevre koşullarına tepki olarak değişir nasıl, ya da mikroorganizmalar apoplastı sıvıda büyür nasıl belirlemek ve bileşimindeki değişikliklere yanıt ts.
Introduction
Bitki apoplastı bitki hücrelerini çevreleyen hücreler arası bir alandır. Bu, birçok metabolik ve taşıma işlemleri yer aldığı dinamik bir ortamdır. apoplast önemli yapısal bileşeni monte ve apoplast içinde bulunan enzimler, yapısal proteinler ve metabolitler tarafından değiştirilmiş hücre duvarı vardır. Sağlıklı bitki hücrelerinde apoplastı genellikle amino asitler, şekerler ve diğer besinler ile H + symport 1 ile sitoplazmaya apoplast ithal sağlayan asidik bir halde muhafaza edilir. Sükroz nakliye, apoplast boyunca ve floem damar içine fotosentetik kaynaklardan sükroz taşıma sırasında; sakaroz sonra lavabo organlarının 2 sükroz bölünmesiyle apoplastik invertases tarafından tutulan ozmotik potansiyeli taşınır. Şekerler ve diğer besinler de yukarı doğru taşınır ve terleme akışı 3 ile stoma boşluklarında birikir olabilir.
"> Apoplastı birçok patojen kendi parazitik yaşam tarzı kurmak bir çevre niş temsil eder. Bakteriyel bitki patojenleri böyle stoma veya yaralar 4 ile doğal deliklerden erişmek apoplast yüksek yoğunluklarına için çoğalabilen. Amino konsantrasyonu asitler ve bakteriyel ve mantar hastalıklarına 5,6 beslenme ihtiyaçlarını desteklemek için yeterli olduğu gösterilmiştir apoplastı domates diğer azot bileşikleri. mikrobiyal patojenlere karşı birincil savunma tepkileri ayrıca, apoplast hücre dışı peroksidazlarla reaktif oksijen türlerinin üretimi, yani meydana . ve oksidazlar ve çapraz-bağlama ve kaloz birikimi 7 ile sağlanan hücre çeperinin güçlendirilmesi bitki hücre duvarı, anti-mikrobik aktiviteleri ile ikincil metabolitlerin açısından zengindir; bu ikincil metabolitlerin biyo-kimyasal yapısı türleri 8 arasında değişir.Yukarıda söz sonucundaEd ve diğer işlemler, yaprak apoplastik sıvı proteinler, şekerler, organik asitler, amino asitler, ikincil metabolitlerin, metaller ve diğer katyonlar (örneğin, Mg + 2, K +, Na +, Ca + 2, Fe 2/3 çeşitli içerir +). Sürgünler apoplast içinde çözünen konsantrasyonu apoplast ve ksilem, floem ve sitoplazma 9 arasında meydana gelen ulaştırma süreçlerinin dengesi büyük ölçüde kontrol edilir. Ancak, metabolik reaksiyonlar ve mikrobiyal büyüme de tüketmek veya apoplastik solütleri üretmek. apoplast bileşimi bitki türleri ve genotipler arasında ve hafif, beslenme ve biyotik ve abiyotik streslere 9 olmak üzere değişen çevre koşullarına tepki olarak farklılık bilinmektedir. Apoplast bileşimini inceleyerek ve bu tür redoks ve ozmotik potansiyeli, pH, besin / metaboliti kullanılabilirliği ve enzimatik faaliyetleri gibi özellikleri de dahil olmak üzere, nasıl değiştirdiğini, bir bitki yeniden nasıl yeni bakış açıları kazanabilirlerçevrelerine göre hala. Bu metabolitler ve / ya da iyon, uçucu geçici ya da hücre duvarı ve plazma membranı ile bağlantılı olabilir, burada uzaysal olarak yapılandırılmış ve dinamik bölmesi olduğu anlama veya apoplastı çözelti içinde meydana gelen moleküler değişiklikler karakterize karmaşıktır. Bundan başka, çeşitli analitik teknikler, farklı kimyasal türleri kapsaması gerekmektedir.
Çözünür apoplast bileşimini incelemek için, akışkan, genellikle dokudan ekstre edilmesi gerekmektedir. Çeşitli yöntemler yeni önerilen filtre şerit yöntemi 10 dahil olmak üzere çeşitli dokulardan gelen sıvıyı apoplastı ayıklamak için var, ama yaprakları için en köklü ekstraksiyon yöntemi infiltrasyonu-santrifüj olduğunu. Bu teknik 11-13 önceden değerlendirildi ve Lohaus ark., 2001 14 yönteminin teknik parametrelerin çoğunu kapsamlı bir inceleme sağlar. Isim, sızma-Santrifüj ima gibiNavigasyon teknik, esas yapraklar yumuşak santrifüj ile infiltrasyon / apoplastik sıvı karışımının geri ardından doğal apoplastik sıvısı ile karıştıktan sulu infiltrasyon sıvısı ile apoplastik hava boşluğu değiştirme içeren iki aşamalı bir yöntemdir. Geri kazanılmış sıvı seyreltilir ve apoplast mevcut tüm bileşikleri (aşağıya bakınız) ihtiva etmez, bu sıvılar yaygın bir apoplastı yıkama sıvısı (AWF) ya da bazen arası yıkama sıvısı yerine apoplastik sıvı olarak bilinmektedir. infiltrasyonu santrifüj tekniği yeterli hacim tek ya da bir araya getirilmiş AWF örnekleri oluşturulan ve aşağı doğru, biyokimyasal ve analitik teknikler (geniş tabi sağlayan kolayca ölçeklendirilebilir, örneğin, protein elektroforezi, enzim aktivitesi ölçümü, NMR, kromatografi ve kütle çok çeşitli spektrometrisi). Yaprak AWF bitki kolonize mikrop zekâ etkileşimini incelemek için büyüme ortamı taklit bir apoplast olarak yararlıdırh çevreleri 5.
Aşağıdaki protokoller biz Phaseolus vulgaris cv kullanarak sızma-santrifüj tekniği gerçekleştirmek için nasıl açıklar. Tendergreen yaprakları ve metabolomik odaklanarak mansap analizler bazı örnekler sunmak. Önemlisi, yöntemler AWF kalitesi, farklı yaprak türleri için prosedürü optimize etmek tavsiyeleri ile birlikte verilmektedir değerlendirmek için.
Protocol
Not: Bu faktörler büyük kalitesi, değişkenlik ve AWF verimi (Şekil 1) etkileyebilir gibi yaprak malzeme ve bitki büyüme koşullarının standardizasyonu başlangıç seçimi kritiktir. Dikkate parametreler Tablo 1 'de gösterilmiştir ve tartışma daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır.
| Parametre | Örnek standardına | ||
| Phaseolus vulgaris | Solanum lycopersicum | Arabidopsis thaliana | |
| Yaprak tipi | Ilk gerçek yaprak tam olarak genişletilmiş, sağlıklı | Alttan başlayarak 2. ve 3. yaprakları, 4 büyük broşürler apoplastı çıkarımı için kullanılan değil apikal broşür alınan | Tamamen genişletilmiş rozet yaprakları |
| Bitki yaşı | 21 gün | 7-9 hafta 7 hafta | |
| Günün Saati | Işık dönemi Orta (00:00) | Işık dönemi Orta (00:00) | Işık dönemi Orta (00:00) |
| Hidrasyon | Tüm bitkiler iyi 1 saat ön hasat sulanan | Tüm bitkiler iyi 1 saat ön hasat sulanan | Tüm bitkiler iyi 1 saat ön hasat sulanan |
| Işık | 16 saat ışık, 400 umol m -2 sn -1 | 16 saat ışık, 400 umol m -2 sn -1 | Haftada 2 den 10 saat ışık (kısa gün), 400 mmol m -2 sn -1 |
| Nem | % 70 | % 70 | % 70 |
| Sıcaklık | 22 ° C Hafif, 18 ° C karanlık | 22 ° C Hafif, 18 ° C karanlık | 21 ° C |
Standart parametre tek Tablo 1. ÖrnekAWF çekimlerinde kullanılan yaprakları için ters.
1. Yaratma apoplast Yıkama Sıvı
NOT: enfekte yapraklardan mikrobiyal patojenler inculding bu protokol tehlikeli materila sırasında boşa yıkanıp edilmemelidir; oldukça uygun bertaraf işlemleri kullanılmalıdır.
- Yaprak boyutuna göre aparatı seçin:
- Bir iğnesiz şırınga kullanarak küçük yaprakları (örneğin, Arabidopsis, fasulye) sızmak. Bir şırınga sığmayacak kadar büyük olan yaprakları sızmak için bir termos kullanın. Aynı anda birden fazla yaprak sızmaya termos yöntemini kullanın.
- Bir jilet kullanarak küçük bölümlere mevcut infiltrasyon yöntemi için çok büyük yaprakları bölün. Damıtılmış su içinde iyice kesilmiş durulama yaprak bölümleri önce hasarlı hücrelerden terlemek sitoplazmik kirleri çıkarmak için süzülme için.
- 60 ml'lik bir şırınga kullanılarak yaprağı süzme:
- Dan yaprak ayırınBir jilet kullanarak yaprak sapı bitki. Domates gibi bileşik yaprakları için, petiolule de broşürler ayırın.
- Yaprak yüzey kirleri çıkarmak için distile su içinde dalma taze kesilmiş yaprak durulayın. Hafifçe emici dokusu veya kağıt ile lekeleme ile yaprak kurulayın.
- Infiltrasyon önce yaprak ağırlığını ölçün.
- Dikkatle döndürün ve / veya bir 60 ml şırınganın içine yaprak katlama ve damıtılmış su ile doldurun şırınga (diğer infiltrasyon sıvılar açıklamalara bakın kullanılabilir). Yaklaşık 40 ml işaretine pistonu düşürürken şırınga içinde herhangi bir hava çıkarma.
- Eldivenli parmak veya Parafilm bir parça ile ya şırınga ucu Kapak, daha sonra 60 ml işaretine dışarı pistonu çekerek şırınga içindeki negatif basınç oluşturmak. Pistonu yavaşça serbest bırakın.
NOT: hücre parçalama ve sitoplazmik kirlenmesine neden olabilir basıncı serbest Çabuk. - Şırınga ucu çıkarın ve herhangi bir hava çıkarma, sonra ucu ve basın replugpistonu ileri aşağı pozitif basınç mütevazı bir miktarda oluşturmak için.
- Sızmış alanların karanlık renk ile görüldüğü gibi yaprak tamamen sızmış kadar 1.2.6 - Tekrar 1.2.5 adımları.
- Şırınga yaprak çıkarın. Yavaşça ama iyice yüzey sıvıyı çıkarmak için emici kağıt yaprağı kurulayın.
- Infiltre yaprak ağırlığını ölçün. Önce ve yakından sızma hacmini yaklaşan sızma sonra ağırlık farkı hesaplayın.
- Termos ile Yaprak infiltrasyonu:
- Bir jilet kullanarak yaprak sapı ile bitkiden yaprak ayırın.
- Yaprak yüzey kirleri çıkarmak için distile su içinde dalma taze kesilmiş yaprak durulayın. Yavaşça emici kağıt blot yaprak kurulayın.
- Infiltrasyon önce yaprak ağırlığını ölçün.
- 250 ml veya daha büyük yan kol şişe co (birden çok yaprakları infiltre ise ya bırakır) yaprak yerleştirindamıtılmış su ntaining (diğer infiltrasyon sıvıları açıklamalara bakın kullanılabilir). Tamamen sıvı ile yaprakları kapsar.
- Balona bir vakum uygulayın. Yavaşça yapraklarından hava kabarcıkları serbest bırakmak için çalkalayın. Dikkatlice ve yavaşça vakumu boşaltmak.
Not: hızlı bir şekilde vakum serbest hücre lizizi ve sitoplazmik kirlenmesine neden olabilir. - Sızmış alanların karanlık renk ile görülen yaprak kadar adımı yineleyin 1.3.5 tam sızmış edilir.
- Şişeden yaprak çıkarın. Yavaşça ama iyice yüzey sıvıyı çıkarmak için emici kağıt yaprağı kurulayın.
- Infiltre yaprak ağırlığını ölçün. Önce ve yakından sızma hacmini yaklaşan sızma sonra ağırlık farkı hesaplayın.
- Santrifüj ile AWF geri kazanımı:
- 4 inç (10 cm) genişliğinde Parafilm bir parça üzerinde yaprak yerleştirin. 5 ml'lik bir pipet (ya da benzer boyutlu bir nesne) kullanılarak,Parafilm içinde yaprak rulo.
- 20 ml'lik enjektöre pipet ile sarılmış yaprak yerleştirin. Yukarı bakacak şekilde herhangi bir kesim yaprak kenarları yerleştirin. Temiz bir 50 ml'lik polietilen veya polikarbonat tüp içine şırınga yerleştirin.
- 4 ° C'da bir sallanan kepçeli rotor içinde 1000 x g'de 10 dakika süre ile boru içinde şırınga santrifüjleyin.
Not: santrifüj aşağıdaki yaprakların Görsel muayene sızma sıvının çoğunluğu sınır dışı edildiğini açığa çıkarmalıdır. Koyu yeşil yamalar ek santrifüj süresi gerekli olduğunu göstermektedir. - Yeni bir 1.5 ml tüpler içinde geri AWF Pipet.
NOT: AWF hacmi yaklaşık bu yaprak için sızma hacmini aynı olmalıdır; hacim, ek santrifüj zaman daha az ise veya santrifüj hızı gereklidir. - 5 dk herhangi bir hücre veya partikül madde kaldırmak için 15.000 xg'de AÇD örnekleri santrifüj. Seçenek olarak ise, remo 0.22 um filtre içinden AWF geçmesihücreleri ve partiküler madde ettik.
- Taze bir tüp içine süpernatant Pipet. Depolama kadar buz üzerinde örnekleri tutun.
- -80 ° C'de AWF örnekleri saklayın.
Sitoplazmik Zehirlenme 2. Tahliller
- Santrifüj adımlar tamamlandıktan hemen sonra enzimatik reaksiyonları (örn, proteoliz) en aza indirmek ve analizleri gerçekleştirmek için buz üzerinde AÇD örnekleri tutun.
Not: metabolit analizi için, numuneler hemen ekstre sonra dondurulabilir ve kullanılana kadar -80 ° C'de saklandı. - Standart malat dehidrogenaz için (MDH) tahlil protokolü 15 bakınız; Aksi takdirde, bir ticari olarak temin edilebilir MDH deney kiti kullanmak.
- Standart glikoz-6-fosfat dehidrogenaz için (G6PDH) tahlil protokolü 16 bakınız; Aksi takdirde, bir ticari olarak temin edilebilir G6PDH deney kiti kullanmak.
- Örneğin glikoz-6-fosfat (G-6-P), GC-MS kullanımı gibi sitoplazmik metabolitlerin miktarının, adım 5'te tarif edildiği gibi
Apoplast Seyreltme Faktörü 3. Hesaplama
- Adım 1.2.4 veya 1.3.4 (örneğin, distile su) yukarıda kullanılan sızma sıvı iki cilt hazırlayın. 50 uM bir nihai konsantrasyona kadar bir çözeltisine Indigo Carmin tozu eklenir diğer hiç katkıda bulunmazlar.
- Bir levha okuyucu ile Indigo Carmin infiltrasyonu çözeltisi 200 ul 610 nm (OD 610) de absorbansı ölçülür. Indigo karmin olmadan OD infiltrasyon solüsyonu 610 200 ul çıkarılarak bu değeri düzeltin. Aşağıdaki denklemi içine OD 610infiltrate olarak bu düzeltilmiş değeri değiştirin.
- (Ve indigo carmine almadan) infiltrasyon çözümleri ile (adım 1.2 veya 1.3), yukarıdaki gibi en az üç kopya yaprak sızmaları yapın.
- Infiltrasyon, r sonradamıtılmış su içinde yaprakların böcek ö dış yüzeyleri üzerinde herhangi bir geri kalan Indigo Carmin uzaklaştırmak üzere.
- (Aşama 1.4), yukarıdaki gibi santrifüj ile devam edin.
- Ortalama OD indigo karmin AÇD çekimi 610 200 ul belirleyin. Indigo karmin ücretsiz AWF 200 ul ortalama OD 610 değeri çıkarılarak bu değeri düzeltin. Aşağıdaki denklemi içine OD 610AWF olarak bu düzeltilmiş değeri değiştirin.
- Olarak düzeltilmiş absorbans değerleri seyreltme faktörü (yani, seyreltme kat) hesaplayın:
Apoplastı seyreltme faktörü = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) - Seyreltme faktörü ile AWF gelen çarpın konsantrasyon veya etkinlik değerleri planta'daki apoplastik sıvıda konsantrasyon / aktiviteyi tahmin etmek.
Freeze Kurutma Full Strength AWF 4. Konsantrasyon
- Donma-kurutucu ve a aççalışma sıcaklığı ve basıncında stabilize için llow.
- Taze veya depolanmış AÇD numunelerinin istenilen miktarda Havuz.
- 2 ml santrifüj tüplerine arasında eşit örnekleri dağıtın.
- Sulandırma hacmi belirleyin:
Sulandırma hacmi = dondurularak kurutma / apoplastı seyreltme faktörü önce volüm - Kapaklarının kapalı, sıvı azot tüpleri dondurma.
- Bir veya daha fazla soğutulmuş dondurarak kurutma gemilere donmuş tüpler aktarın. Tüpler aktarırken, gaz alışverişini sağlamak için keskin bir nesne ile deldi olmuştur biriyle kapağı değiştirin.
- Donma-kurutucu gemileri takın ve tamamen örnekleri lyophilize.
- Makinenin numune alın ve damıtılmış su hesaplanan miktarının eklenmesiyle AWF sulandırın.
- Delinmemiş kapağını çıkarın ve -80 ° C'de örnekleri saklayın.
Gaz Kromatografi Kütle Spektrometresi 17 ile 5. metabolit Analizi
<ol>Representative Results
Sağlıklı 3 haftalık P. gerçekleştirilen AÇD çekimi için tipik sonuçlar cv vulgaris. Infiltrasyon sıvısı olarak distile edilmiş su ile Tendergreen yaprakları, Tablo 2 'de gösterilmiştir. Genç S. vulgaris yaprakları infiltrasyon mükellef olan ve burada kullanılan santrifüj hızında (1.000 xg) santrifüj infiltrasyonu sıvının çoğunluğu kaldırılması yaprakları özgün yeşil rengi dönmek doğrudan görülebilir. P. vulgaris yaprak taze ağırlığı infiltrasyonu öncesinde ortalama 1.1 x g oldu ve yaş olarak her gramında AWF 0.5 ml elde edildi. AWF protein konsantrasyonu ml standart Bradford protein deneyi kullanılarak / 0.18 ± 0.08 mg olduğu tespit edilmiştir. indigo karmin seyreltme ölçerek hesaplanan bu yaprakları için seyreltme faktörü, 2.3 ± 0.3 kat oldu. Yukarıdaki değerler gram yaprak taze biz başına AWF verimini belirlemek için gerekli olan türler ve pilot deneyler arasında önemli ölçüde değişebilirkilolu olan, hem de belirli bir yaprak türü için beklenebilir AWF protein konsantrasyonu ve seyreltme faktörü.
Merkezkaç kuvveti çok yüksek olduğu takdirde hücrelerin bütünlüğüne zarar basıncı değişiklikleri çok hızlı ise, sızma aşaması esnasında hem de meydana gelir ve santrifüj aşaması esnasında olabilir. Bu sitoplazmik kontaminasyon belirteçleri için AÇD örnekleri tahlil etmek gereklidir; ideal olarak, çok sayıda bağımsız tayin gerçekleştirilmiştir. Burada, üç olası tahlillerinden elde edilen sonuçlar, Tablo 2'de rapor edilmiştir. P. iyi yapılan ekstraksiyon olarak vulgaris AWF, G6PDH, standart enzim testi ile tespit edilememiştir. Bu G6PDH aktivitesi, yalnızca bir eşik santrifüj kuvveti 12 üzerinde tespit olma özelliğini raporlarla tutarlıdır. Bunun aksine, malat dehidrojenaz aktivitesi (2.5 U / ml) 'in bir baz düzeyi, tüm P. saptanabilir standart metabolik tahlili kullanılarak vulgaris AWF örnekler. Için santrifüj artırılması1000 xg bir eşik değerinin üzerinde CE artan MDH faaliyetleri ile sonuçlanmıştır (sonuçlar gösterilmemiştir). Diğer türler, apoplastı endojen MDH aktivitesi 18 ihtiva bildiği gibi, burada tespit edilen miktarı bu taban seviyesinden gerçek apoplastik aktivitesi ve önemli artışlar kabul kirlenmeye göstergesidir. Örneğin heksoz-6-fosfat gibi, esas olarak, sitoplazmik olduğu düşünülen metabolitleri de AWF kirlenmesini değerlendirmek için de kullanılabilir. Burada, GC-MS analizi, AWF ekstraksiyon G-6-P sıfır ya da eser seviyeleri tespit edildi. Sitoplazmik kirlenme 10 gösteren kesme mısır kök bölümlerde aksine, G-6-P, santrifüj hızlarda AWF ekstraksiyondan sonra tespit edildi ve daha yüksek hızlarda konsantrasyonda artmıştır.
P. GC-MS ile metabolit analizi 60 tanımlanabilir metabolitleri ve tanımlanamayan bileşiklerin yaklaşık eşit sayıda (Şekil 2) - vulgaris yaprak AWF genellikle 40 verir. Veyamentasyon asitler, basit şekerler, amino asitler, tanımlanabilir metabolitlerin kütle Bununla birlikte, ikincil bitki metabolitleri de algılanabilir ve AWF 11 miktarı edilmiştir temsil eder. Bu farklı molekül sınıflarından birkaç örnek tepe Şekil 2'de etiketli daha aşağı analitik teknikler, örneğin, çeşitli moleküller ölçmek için, bu AWF örneklere uygulanabilir niteliktedir:., ICP-MS, NMR, HPLC, atomik absorpsiyon spektroskopisi, protein, kütle spektrometrisi.
Şekil 3, Coomassie Brillant Blue lekeli SDS-PAGE jeli gösterilen apoplast protein bileşeni de AWF temsil edilmektedir. Diğer roller arasında apoplastik enzimler, hücre duvarı sentezi ve hücre dışı reaktif oluşturulması için sorumludur oksijen türleri. Çeşitli türlerden AWF proteomik çalışmalar bireysel proteinlerin onlarca tespit ve apoplast protein bileşeni enviro tepki göstermiştirnmental stres 13,19. İdeal AWF özü gibi Rubisco'nun gibi sitoplazmik proteinleri tarafından kontaminasyon serbest olmalıdır; Ancak uygulamada, bu elde etmek zordur. SDS-PAGE aşağıdaki ~ 53 kDa bir Rubisco protein bandının varlığı AÇD örneklerinin bütünlüğü için bir başka nitel tahlil sağlar. Örneğin, Şekil 3 içinde yol 2'de yüklü örnek şerit 1 bu Rubisco kirlenme büyük bir miktarda içerir.
| Fikriye AWF vulgaris | |
| AWF Hacmi (ml g -1 yaprak FW) | 0.49 ± 0.09 |
| Protein kons. (Mg mi-1) | 0.18 ± 0.08 |
| Sulandırma faktörü | 2.3 ± 0.3 |
| G6PDH aktivitesi (U mi-1) | |
| GLC-6-P (mg mi-1) | hiçbiri tespit |
| MDH-aktivitesi (U mi-1) | 2.5 ± 0.9 |
P. AWF çekimi için Tablo 2. Tipik sonuçlar cv vulgaris. Tendergreen yaprakları.
Şekil 1. Standart apoplastı çıkarma iş akışı. Numaralar protokolde adımlara bakın.
Şekil 2. Bir örnek P GC-MS kromatogramı. Cv vulgaris. . Tendergreen AWF sayılı örnek metabolit pikleri: 1-malonat, 2-fosfat, 3-suksinat, 4-bilinmiyor, 5-malat, 6-asparagin, 7-ribitol (iç standard), 8-sitrat, 9-glükoz, 10-inositol, 11-kafeik asit, 12-sakroz.
Şekil 3. SDS-PAGE koomassie P jelini örneği. Bu jel bol plastidsel enzim Rubisco ile sitoplazmik kirlenme miktarda farklılık gösteren iki AWF ekstraksiyon protein bileşenleri arasında bir karşılaştırma sağlar. AWF yaprak ekstreleri vulgaris. AWF ekstre sonra her iki numune, soğuk aseton 4 kat fazla (h / h) aseton proteini çökeltmeye tabi tutulmuş ve onda biri orijinal ses su içinde çözündürülmüştür. Kuşak 1 ve 2 proteininin 40 ug içermektedir. Rubisco büyük zincirine karşılık gelen bant (~ 53 kDa) bir ok ile belirtilmiştir. M r: Protein molekül ağırlığı belirteçleri.
Discussion
Bitki doku kaynağı Optimize
Apoplastı çekimi yaparken Biyolojik ve teknik varyasyon büyük olabilir, böylece bir çok standart iş akışı (Şekil 1) deneyler arasında sürekliliği artırmak için yararlıdır. Önemli bir şekilde, bitki doku kaynağı yaprak tipi, yaprak yaşı, büyüme ve / veya çevresel koşullar ve gün (Tablo 1) zaman da dahil olmak üzere, standardize edilmelidir. Büyük farklılıklar yaprakları sızmış ve AÇD sonra santrifüj kurtarıldı hangi ile kolaylığı var; Bu farklılıklar stoma sayısı, açıklık boyutu ve mezofil direnci 12,14 ile ilişkilidir. Hatta P. farklı çeşitler arasında kolaylık ve AÇD çıkarma işleminin verimi büyük farklılıklar vardır vulgaris; Burada kullanılan Tendergreen çeşitli örneğin yaprak Kanada Wonder çeşidinde göre, bu yöntemi kullanarak AWF ekstre için daha uygundurlar. IçindeP. apoplastik ekstraksiyon için onlara bariz bir seçim yapmak, ilk gerçek yaprakları sızmak için en büyük ve en kolay vulgaris. apoplastik hava ve su hacmi AWF ekstrakte 12,14 farklılıklara yol açan çeşitli türlerde yaprak yaşma gösterilmiştir. P. vulgaris, yaşlı yapraklar önemli ölçüde daha zor sızmak ve santrifüj üzerine az AWF elde haline; tam genişleme eriştiğinde, bu nedenle yaprakları hasat edilmiştir. sonradan sızmak AWF kurtarmak için yüksek santrifüj hızları gerektiren zor Yapraklar. Bir nedenle dikkatli büyük ölçekli AÇD çekimi için bir doku kaynağı üzerine karar vermeden önce birkaç farklı yaprak türleri ve çeşitleri ekran gerekir.
Bitki büyüme koşulları da deney kapsamında mümkün olduğu kadar standardize edilmelidir. Onlar izin gibi büyüme dolapları kullanılması tercih edilir tutarlı nem, sıcaklık ve aydınlatabilirizt yoğunluğu alayları muhafaza edilmesi. vb metabolitler, enzimler, konsantrasyonları gündüz döngüsü 14 boyunca değişir, çünkü yaprakların hasat her zaman günün aynı saatinde meydana gelmelidir. Son olarak, bitki benzeri tüm turgor basıncı bırakır sağlamak için, bitkiler (~ 1 saat) hasattan önce yakında sulanmalıdır.
Yaprağı süzme ve santrifüj optimizasyonu
Hücreler tarafından karşılaşılan mekanik gerilim infiltrasyonu veya santrifüj adımları sırasında çok yüksek ise, azalan kısmi hücre lizisine AWF istenmeyen sitoplazmik kirlenme neden olur. Bu nedenle, belirli bir yaprak türü için prosedür verimi maksimize ve AWF sitoplazmik bulaşmasını en aza arasındaki optimize edilmiş ticaret-off olmalıdır. Her durumda, bir AWF yaprak hücrelerinin olası mekanik kesintileri önlemek için telafi edilebilir ki en düşük santrifüj hızı kullanmalısınız. Santrifüj OptimizasyonuNavigasyon hızda santrifüj hızlarının bir aralığında geri hacmi ve kirlenme apoplastı izleyerek, her bir yaprak tipi için ampirik bir şekilde tespit edilmelidir. Bu tür MDH, G6PDH ve glukoz-fosfat izomeraz olarak bu işaretleyici enzim aktiviteleri tespit edilmiştir, bu aktiviteler ki tahminen bu, sitoplazmik sızıntı 9,12,14 için, hızlı bir artış yukarıda aştı bir eşik merkezkaç kuvvetine kadar düşüktür. Baker ve diğ. 2012 11 tarafından belirtildiği gibi santrifüj aşaması esnasında destek Parafilm kullanımı, AWF ekstraksiyon etkinliğini geliştirebilir ve aşırı katlama ve sıkıştırma neden olduğu yaprak bıçağı mekanik hasara en aza indirebilir. Bir AWF ekstraksiyon hasar ve bütünlüğü için yaprak incelemek gerekir Dahası, Parafilm kullanımı santrifüj sonra yaprak görselleştirme geliştirir.
Nouchi 12 d vardır kesim pirinç yaprağı bölümlerden gelen AWF kurtarma optimizasyonu tarififficult sızmak ve küçük olmasından dolayı stoma açıklıklar AWF toplamak için yüksek santrifüj hızları gerektiren. Pirinç yaprağı yüzeyinin ıslanma ya damıtılmış su içinde yaprakları veya sızma sıvısına bir yüzey aktif madde ilave edilmesini, önceden ıslatma ile geliştirilmiş, infiltrasyon işlemi kolaylaştırılır. Apoplastik kontaminasyon 12 izlerken daha yüksek santrifüj hızı (6,000 xg) de kullanıldı. Kesme yaprak bölümleri kullanırken sitoplazmik kirlenme bile yara sitelerinin geniş yıkama ile daha yaygın olacağı riski her zaman vardır; kesilmiş yaprak, bu nedenle sadece gerektiğinde kullanılmalıdır.
Birçok çalışmada için damıtılmış su, sızıntı sıvısı 11 olarak kullanılır. Ancak, bu bileşiklerin belirli apoplastik bileşikler, özellikle proteinlerden 13 çıkarılmasını artırmak için, bu tür tuzlar ya da tampon olarak, sızma sıvısına ilave edilebilir. Lohaus 14 o iyonik ve ozmotik kuvvet etkisi değerlendirildin kurtarıldı AWF kompozisyonu ve ihmal olarak bulundu. Infiltrasyon ortamının pH değişiklikleri, ancak, AWF bileşim 14 etkileyebilir.
Ekstre apoplastik sıvının Uygun kullanım ve depolama önemlidir. AWF bir proteaz ve diğer enzimler 13,20 bolluğu, aynı zamanda uçucu organik bileşikler içeren gösterilmiştir. Bu nedenle, buz üzerinde ya da başka şekilde, -80 ° C'de depolanmış numune tutulması tavsiye edilir iyileşme sonrası AWF bileşimi değişiklikleri azaltır. Ekstraksiyon, proteoliz, uzun süreli seyreltme enzimi etkisiz hale sınırlamak veya dondurarak çözülme sonrası Ayrıca, AWF enzimatik deneyler, en kısa sürede yapılmalıdır.
infiltrasyon işlemi apoplastik sıvıyı seyreltilir ve bu seyreltme derecesinin tespit edilmesi için gerekli olabilir. santrifüjleme aşaması, aynı zamanda, hücre içi bölmelerin su ile AWF seyreltik olabilir. Bir seyreltme faktörü ihtiyaç vardırölçümler AWF üzerinde yapıldığında ed in vivo apoplastı kimyasal konsantrasyonlarını tahmin etmek. Böylece mümkün olduğu kadar doğru in vivo metaboliti konsantrasyonlarda eşleşen - Bir seyreltme faktörü de mikroplar için büyüme ortamı taklit bir apoplast olarak kullanılan zaman tam gücü geri AWF konsantre gereklidir. Çeşitli varyasyonlar süzülme sıvısına ilave bir işaret bileşiğinin seyreltme ölçülerek AWF seyreltme faktörünü belirlemek için, aşama 4'te tarif edilen yöntem ile ilgili bulunmaktadır. Tüm yöntemler için AÇD seyreltme hesaplama sızma sıvı kayda değer emilir veya AÇD kurtarma işlemi sırasında yaprak hücreleri tarafından seyreltilmiş olmadığını varsayar. Bu varsayım, daha önce sızma adım 14 doğrulanmıştır ama santrifüj aşaması için doğrulanmamış olduğunu. işaretleyici Bileşik ayrıca, emilen taşınan veya apoplast olarak süre modifiye edilmemelidir. Indigo karmin en yaygın kullanılan ve iyice kullanılan boyaların test edilirAWF seyreltme hesaplamalar için. Indigo Carmin katyon değiştirme reçinesi ve izole edilmiş bir hücre duvarları için düşük bir emicilik gösteren ve Brassica napus AWF hesaplamalar, Pisum sativum, Solanum esculentum Mill ve Glycine max 11,21,22 için uygun olduğu gösterilmiştir. Ancak, bazı yaprak tipleri, örneğin, pirinç ve salatalık, indigo karmin tam AÇD seyreltme faktörü 12,21 küçümsenmesi yol açacak sızma, sonra kurtarılamaz çıktı. karşı hassas oluşudur özellikle stres 24 altında, apoplast üretilen bilinmektedir süperoksit 23 ile izatin sülfonat içine yarığa için indigo carmine geri kazanımı eksikliği nedeniyle olabilir. Izatin sülfonat içine indigo carmine klevajı 610 nm'de absorbans bir kayıp ve 245 nm 'de bir artışa neden olacaktır. Bu reaksiyon, apoplast kayda değer bir ölçüde oluşur olsun, ya da, bu reaksiyon infiltre süperoksit süpürücü olarak inhibe olup olmadığınıiyon sıvı bugüne kadar araştırılmamıştır. AWF kendi istikrar ve iyileşme bildirilmemiştir olsa mavi dekstran pirinçte AÇD seyreltme faktörü ölçümü için yerine indigo karmin kullanılan olmuştur, 12 bırakır. Seçenek olarak ise, örneğin [14C] sorbitol ya da başka ölçülebilir, iç standart olarak radyo-etiketli bileşikler, yerine boyalar ve radyoaktif ya da konsantrasyon ölçüldü ve benzer bir şekilde 11,14,25 seyreltme faktörünü hesaplamak için kullanılan azalma kullanılabilir.
Tekniğin Sınırlamalar
Birkaç uyarılar sızma-santrifüj AÇD izolasyon yöntemi var. İlk olarak, sızma sırasında apoplast seyreltme bitkisinden bir tepkisi olabilir. Çevredeki yaprak hücreleri apoplastik sıvının belirli bileşenleri için bir azalmış konsantrasyon tespit ederse, onlar metaboliti konsantrasyonlarının yorumunu bozan, daha metabolitleri salgılayan ile yanıt verebilir. IçindeBu sorunun bir değerlendirme de infiltrasyonu ve santrifüj veya süzme sıvısının iyon gücü orta farklar arasındaki zaman ne ekstre AWF 14,22 bileşimini etkili olduğu gözlenmiştir. Bu nedenle, seyreltme düşünülen apoplastı kaynaklanan herhangi eserler az olması.
İkinci bir sakınca santrifüjle AWF elüsyonu çeşitli nedenlerle apoplast içinde mevcut olan bütün moleküller yakalayamaz olmasıdır. Özellikle katyonları ve proteinler bazı bileşikler, sıkı bir şekilde negatif yüklü hücre duvarı ile ilgili ve AWF 13 ile elüte olmayan olabilir. Proteinler gibi diğer moleküllerin 14 kullanılan santrifüj hızlarında apoplast dışarı verimli Zehir için çok büyük olabilir. Reaktif oksijen türlerinin, önemli apoplast üretilen bileşik sınıfı, fakat bu bileşiklerin kısa süreli olması nedeniyle, ve bunların üretimi için tanımlanmamış gereksinimleri, pr vardıresence iyi AWF çıkarma tarafından yakalanan değildir. Bu AWF apoplastı sıvının in vivo bileşimi temsil eder ve bu türler arasında değişebilir ne kadar doğru bilinmemektedir.
Birkaç tahliller hiçbiri evrensel olarak kabul edilir olsa da, sitoplazmik kontaminasyonu belirlemek için var. Ağırlıklı sitoplazmik enzimlerin Tahliller (örneğin, G6PDH, heksoz fosfat izomeraz, MDH) gerçekleştirmek kolay olmanın yararı var ama sitoplazmik sızıntı 14,18 ile iyi bir korelasyon olmayabilir. sitoplazmik metabolitleri (örneğin, heksoz fosfatlar, klorofil) değerlendirilmesi belki de daha göstergesidir ama daha az iyi 11 kurulmuştur. Bununla birlikte, deneyin ya türü örnekleri arasında apoplastik kirlenme nispi ölçümü için yararlı olabilir. İdeal olarak, birden fazla bağımsız ölçümler AWF numunenin bütünlüğünü doğrulamak için kullanılır.
Sınırlamaları kabul etmekle birlikte, sızma-centrifugatiBurada tarif edilen tekniği apoplastik proteinler, birincil ve ikincil metabolitleri ve inorganik iyonların çalışmada basit ve sağlam bir teknik olarak yerini korumaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
References
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
