Abstract
Den apoplast er en distinkt ekstracellulære rom i plantevev som ligger utenfor plasmamembranen og omfatter celleveggen. Den apoplastic rommet plante blader er åsted for flere viktige biologiske prosesser, herunder celleveggen formasjonen, cellular næringsstoff og vannopptak og eksport, plante-endophyte interaksjoner og forsvar svar til patogener. Det infiltrasjonen-sentrifugeringsmetoden er godt etablert som en robust teknikk for analyse av det løselige apoplast sammensetning av forskjellige plantearter. Det oppnås ved denne fremgangsmåte fluid er vanligvis kjent som apoplast vaskevæske (AWF). Følgende protokoll beskriver en optimalisert vakuum infiltrasjon og sentrifugeringsmetoden for AWF utvinning fra Phaseolus vulgaris (fransk bønne) cv. Tender blader. Begrensningene ved denne metoden, og optimalisering av protokollen for andre plantearter er diskutert. Utvinnes AWF kan brukes i et bredt spekter av nedstrøms experiments som søker å karakterisere sammensetningen av apoplast og hvordan den varierer i respons til plantearter og genotype, planteutvikling og miljøforhold, eller å bestemme hvordan mikroorganismer vokser i apoplast væske og reagerer på forandringer i komposisjonen.
Introduction
Anlegget apoplast er den inter plass som omgir planteceller. Dette er et dynamisk miljø der mange metabolske og transportprosesser foregår. Den viktigste strukturelle komponenten i apoplast er celleveggen, som er montert og modifisert av enzymer, strukturproteiner og metabolitter som befinner seg innenfor apoplast. Hos friske planteceller den apoplast holdes vanligvis i en syrlig tilstand tillater aminosyrer, sukker og andre næringsstoffer som skal importeres fra apoplast til cytoplasma av H + symport en. Under sukrose transport, sukrose beveger seg fra fotosyntese kilder gjennom apoplast og inn phloem blodkar; sukrose blir deretter transportert med en osmotisk potensial vedlikeholdes av apoplastic invertases spalte sukrose i vasken organer to. Sukker og andre næringsstoffer kan også bli transportert oppover og akkumuleres i stomatal hulrom gjennom transpira strøm 3.
"> Den apoplast representerer også en miljø nisje hvor mange patogener etablere sin parasittiske livsstil. Bakterielle plantepatogener har evnen til å formere seg til høye tettheter i apoplast, som de har tilgang gjennom naturlige åpninger som spalteåpninger eller gjennom sår 4. Konsentrasjonen av amino- syrer og andre nitrogenforbindelser i tomat apoplast har vist seg å være tilstrekkelig til å støtte de ernæringsmessige kravene til bakterier og sopp patogener 5,6. Primære forsvar svar mot mikrobielle patogener også oppstå i apoplast, nemlig produksjon av reaktive oksygenforbindelser av ekstracellulære peroxidases . og oksidase og styrking av celleveggen gjennom kryssbinding og callose deponering 7 Anlegget celleveggen er rik på sekundære metabolitter med anti-mikrobielle aktiviteter, den biokjemiske natur av disse sekundære metabolitter varierer mellom arter 8.Som et resultat av den ovenfor omtaleed og andre prosesser, inneholder blad apoplastic fluid en rekke proteiner, sukkerarter, organiske syrer, aminosyrer, sekundære metabolitter, metaller og andre kationer (f.eks Mg2 +, K +, Na +, Ca2 +, Fe 2/3 +). Oppløste konsentrasjoner i apoplast av skudd styres i stor grad av balanse av transport prosesser som skjer mellom apoplast og Margen, barken og cytoplasma 9. Men metabolske reaksjoner og mikrobiell vekst også forbruke eller produsere apoplastic solutes. Sammensetningen av apoplast er kjent for å være forskjellig mellom plantearter og genotyper, og i respons til endrede miljøbetingelser, inkludert lys, ernæring og biotiske og abiotiske påkjenninger 9. Ved å studere sammensetningen av apoplast og hvordan den endres, inkludert egenskaper slik som redox og osmotisk potensial, pH, næringsstoff / metabolitt tilgjengelighet og enzymatiske aktiviteter, kan man få ny innsikt i hvordan plantene respond til sitt miljø. Forståelse eller karakterisere de molekylære forandringer som oppstår i apoplast løsning er komplisert, fordi det er en romlig strukturert og dynamiske kammer hvori metabolitter og / eller ioner kan være flyktige, forbigående eller assosiert med celleveggen og plasmamembran. Videre er forskjellige analytiske teknikker som kreves for å dekke området av forskjellige kjemiske typer.
For å undersøke sammensetningen av det oppløselige apoplast, må fluidet vanligvis å bli ekstrahert fra vevet. Det finnes flere metoder for å ekstrahere apoplast fluid fra forskjellige vev, inkludert en nylig foreslått fremgangsmåte filterbånd 10, men den mest etablerte utvinningsmetoden for bladene er infiltrering-sentrifugering. Denne teknikken har blitt evaluert tidligere 11-13 og Lohaus et al. 2001 14 gi en grundig undersøkelse av mange av metodens tekniske parametere. Som antydet ved navn, infiltrasjon-centrifusøkelsen teknikk er en to-trinns metode som i det vesentlige innebærer utskifting av apoplastic luftrom med en vandig infiltrasjon væske, som blander seg med den native apoplastic fluid, etterfulgt av utvinning av infiltrering / apoplastic fluidblandingen ved forsiktig sentrifugering av bladene. Som det gjenvunnede fluid blir fortynnet og inneholder ikke alle forbindelser som er tilstede i apoplast (se nedenfor), blir dette fluidum kjent som apoplast vaskevæske (AWF), eller noen ganger intercellulære vaskevæsken, snarere enn apoplastic fluid. Det infiltrasjonen-sentrifugeringsteknikk er lett skaleres slik at enkle eller samle Awf prøver av tilstrekkelig volum til å bli generert og utsatt for et bredt spekter av nedstrøms biokjemiske og analytiske teknikker (for eksempel, protein, enzym aktivitetsmåling, NMR, flere typer av kromatografi og masse spektrometri). Blad AWF er også nyttig som et apoplast ligne vekstmedium for å studere interaksjonen av plantekolon mikrober with deres miljø fem.
I de følgende protokoller beskriver vi hvordan du utfører infiltrasjon-sentrlfugeringsteknikk hjelp Phaseolus vulgaris cv. Tender blader, og gi noen eksempler på nedstrøms analyser med fokus på metabolomics. Viktigere, til metoder vurdere kvaliteten på AWF leveres sammen med råd for å optimalisere prosedyren for ulike bladtyper.
Protocol
MERK: Valget om å starte bladmateriale og standardisering av plantevekstvilkår er kritisk som disse faktorene kan i stor grad påvirke kvaliteten, variabilitet og utbytte av AWF (figur 1). Parametere for å vurdere er vist i tabell 1, og er diskutert i mer detalj i diskusjonen.
| Parameter | Eksempel standardizations | ||
| Phaseolus vulgaris | Solanum lycopersicum | Arabidopsis thaliana | |
| Blad typen | Første virkelige blader, fullt utvidet, sunn | 2 nd og 3 rd blader start fra bunnen, 4 største brosjyrer tatt apikale pakningsvedlegget ikke brukes for apoplast utvinning | Fullt utvidet rosett blader |
| Plant alder | 21 dager | 7-9 uker 7 uker | |
| Tid på dagen | Midten av lys periode (12:00) | Midten av lys periode (12:00) | Midten av lys periode (12:00) |
| Hydration | Alle plantene godt vannet en time pre-harvest | Alle plantene godt vannet en time pre-harvest | Alle plantene godt vannet en time pre-harvest |
| Lett | 16 timer lys, 400 mikromol m -2 sek -1 | 16 timer lys, 400 mikromol m -2 sek -1 | 10 t lys (kort dag) fra uke 2, 400 mikromol m -2 sek -1 |
| Fuktighet | 70% | 70% | 70% |
| Temperatur | 22 ° C lyset, 18 ° C mørkt | 22 ° C lyset, 18 ° C mørkt | 21 ° C |
Tabell 1. Eksempler på standardisert Paramemeterne for bladene som brukes i AWF utdrag.
1. Generering Apoplast Vaske Fluid
MERK: Under denne protokollen farlig materila inculding mikrobielle patogener fra infiserte bladene skal ikke skylles ned i avløp; heller riktige avfallsdisponering bør brukes.
- Velg apparat basert på blad størrelse:
- Infiltrere mindre blader (f.eks Arabidopsis, bønne) med en nålløs sprøyte. Bruk en termos for å infiltrere blader som er for store til å passe i en sprøyte. Bruk termos metode for å infiltrere flere blader samtidig.
- Fordel bladene som er for store for den tilgjengelige infiltrasjon metode i mindre deler ved hjelp av et barberblad. Skyll kutte blad seksjoner i destillert vann før infiltrasjon å fjerne cytoplasmatiske forurensninger som utstråler fra skadede celler.
- Leaf infiltrasjon ved hjelp av en 60 ml sprøyte:
- Løsne blad fraanlegget på bladstilken ved hjelp av et barberblad. For sammensatte blader som tomat, løsner brosjyrer på petiolule.
- Skyll den ferske excised blad ved neddykking i destillert vann for å fjerne blad overflatekontaminanter. Tørk blad ved forsiktig blotting med absorberende vev eller papir.
- Mål blad vekt før infiltrasjon.
- Nøye rulle og / eller fold bladet inn i en 60 ml sprøyte og fylle sprøyten med destillert vann (infiltrasjons andre fluider kan benyttes, se diskusjon). Løse ut eventuell luft i sprøyten mens du senker stempelet til ca 40 ml-merket.
- Dekk sprøytespissen med enten en behansket finger eller et stykke av Parafilm, deretter opprette undertrykk inne i sprøyten ved å trekke stempelet utover til 60 ml-merket. Sakte slipper stempelet.
MERK: Raskt slippe trykket kan føre til cellelyse og cytoplasmic forurensning. - Trekk sprøytespissen og ta ut all luft, replug da spissen og trykkytterligere nedover på stempelet for å skape en beskjeden mengde positivt trykk.
- Gjenta trinn 1.2.5 - 1.2.6 til bladet er fullt infiltrert, som sett av den mørke fargen på infiltrert områder.
- Fjerne bladet fra sprøyten. Forsiktig, men grundig klatt blad med tørkepapir for å fjerne overflate væske.
- Måle vekten av den infiltrerte blad. Beregne forskjellen i vekt før og etter infiltrering som tett tilnærmet infiltrasjonsvolum.
- Leaf infiltrasjon av termos:
- Løsne blad fra planten på bladstilken ved hjelp av et barberblad.
- Skyll den ferske excised blad ved neddykking i destillert vann for å fjerne blad overflatekontaminanter. Tørk blad ved forsiktig blotting med absorberende papir.
- Mål blad vekt før infiltrasjon.
- Plassere bladet (eller blader hvis infiltrerende flere blader) i en 250 ml eller større sidearmen kolbe containing destillert vann (infiltrasjons andre fluider kan benyttes, se diskusjon). Fullt dekke bladene med væsken.
- Påføre et vakuum til kolben. Beveg lett å frigjøre luftboblene fra bladene. Sakte og forsiktig løsne vakuum.
MERK: Raskt slippe vakuum kan føre til cellelyse og cytoplasmic forurensning. - Gjenta trinn 1.3.5 inntil bladet er fullstendig infiltrert, slik det fremgår av den mørke fargen av de infiltrerte områder.
- Fjerne bladet fra kolben. Forsiktig, men grundig klatt blad med tørkepapir for å fjerne overflate væske.
- Måle vekten av den infiltrerte blad. Beregne forskjellen i vekt før og etter infiltrering som tett tilnærmet infiltrasjonsvolum.
- Utvinning av AWF ved sentrifugering:
- Plassere bladet på et stykke 4 tommers (10 cm) bred Parafilm. Ved hjelp av en 5 ml pipette (eller en lignende størrelse objekt),rulle opp bladet innenfor Parafilm.
- Sett rullet opp blad med pipettespissen inn i en 20 ml sprøyte. Plasser eventuelle kutt blad kanter vendt oppover. Sett sprøyten inn i en ren 50 ml polyetylen eller polykarbonat-rør.
- Sentrifuger sprøyten inne i røret i 10 minutter ved 1000 x g i en svingende spannrotor ved 4 ° C.
MERK: Visuell undersøkelse av bladene etter sentrifugering skal avsløre at flertallet av infiltrasjons fluid er blitt utstøtt. Mørkere grønne flekker indikerer at ekstra sentrifuge tid er nødvendig. - Pipette den gjen AWF inn friske 1,5 ml rør.
MERK: Volumet av AWF bør omtrent matche infiltrasjonsvolum for at blad; Dersom volumet er mindre enn ytterligere sentrifuge tid eller sentrifugehastighet er nødvendig. - Sentrifuger Awf prøvene på 15.000 xg i 5 min for å fjerne eventuelle celler eller partikler. Alternativt passere AWF gjennom et 0,22 mikrometer filter til remove celler og partikler.
- Pipettere supernatanten til et nytt rør. Hold prøvene på is inntil lagring.
- Oppbevar Awf prøvene ved -80 ° C.
2. Analyser for Cytoplasmatisk Forurensning
- Hold Awf prøvene på is for å minimere enzymatiske reaksjoner (f.eks proteolyse) og utføre analysene umiddelbart etter sentrifugeringstrinn er fullført.
NB: For metabolitt-assays, kan prøvene bli umiddelbart frosset etter ekstraksjon og lagret ved -80 ° C inntil bruk. - For en standard malat dehydrogenase (MDH) analyseprotokollen se 15; ellers bruker et kommersielt tilgjengelig MDH analysen kit.
- For en standard glukose-6-fosfat-dehydrogenase (G6PDH) analyseprotokollen se 16; ellers bruker et kommersielt tilgjengelig G6PDH analysen kit.
- For kvantifisering av cytoplasmatiske metabolitter slik som glukose-6-fosfat (G-6-P) bruke GC-MS som beskrevet i trinn 5
3. Beregning av Apoplast Fortynningsfaktor
- Forbered to volumer av infiltrasjonsvæsken som brukes i ovennevnte trinn 1.2.4 og 1.3.4 (for eksempel destillert vann). Legg indigokarmin pulver til en løsning til en sluttkonsentrasjon på 50 pM, legge noe til den andre.
- Mål absorbansen ved 610 nm (OD 610) på 200 ul av indigokarmin infiltrasjonsløsning med en plate-leser. Rett verdien ved å trekke fra OD 610 av 200 mL av infiltrasjon løsning uten indigokarmin. Erstatte dette korrigert verdi som OD 610infiltrate i ligningen nedenfor.
- Utføre minst tre replikat blad infiltrasjoner som ovenfor (trinn 1.2 eller 1.3) med begge infiltrasjons oppløsninger (med og uten indigokarmin).
- Etter infiltrasjon, rinse bladene i destillert vann for å fjerne eventuelle gjenværende indigokarmin til stede på de ytre overflater.
- Fortsett med sentrifugering som ovenfor (trinn 1.4).
- Bestem gjennomsnittlig OD 610 av 200 mL av de indigo karmin AWF ekstraksjon. Rett verdien ved å trekke den gjennomsnittlige OD 610 verdi av 200 ul indigokarmin gratis AWF. Erstatte dette korrigert verdi som OD 610AWF i ligningen nedenfor.
- Beregne fortynningsfaktoren (dvs. fold fortynning) fra de korrigerte absorbansverdier som:
Apoplast fortynningsfaktoren = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) - Multipliser konsentrasjons eller aktivitets verdier fra AWF av fortynningsfaktoren å estimere konsentrasjonen / aktivitet i apoplastic væske i planta.
4. Konsentrasjon av AWF til full styrke av frysetørking
- Slå på frysetørker og enllow det å stabilisere seg på driftstemperatur og -trykk.
- Pool ønsket mengde ferske eller lagrede AWF prøver.
- Fordel prøvene jevnt mellom 2 ml sentrifugerør.
- Bestem tilberedning volum:
Tilberedning volum = volum før frysetørking / apoplast fortynningsfaktoren - Med lokkene lukkes, fryse rørene i flytende nitrogen.
- Overfør de frosne rør til en eller flere kjølte frysetørkings fartøy. Ved overføring av rørene, setter på lokket med en som har blitt stukket med en skarp gjenstand til å tillate gassutveksling.
- Fest skipene til frysetørker og lyofilisere prøvene helt.
- Fjerne prøvene fra maskinen og rekonstituere AWF ved tilsetning av den beregnede mengde destillert vann.
- Sett på unpierced lokket og lagre prøvene ved -80 ° C.
5. Metabolitt Analyse ved gasskromatografi massespektrometri 17
<ol>Representative Results
Typiske resultater for AWF ekstraksjoner utført på sunn tre uke gammel P. vulgaris cv. Tender blader, ved å bruke destillert vann som infiltrasjons fluidum er vist i tabell 2. Young P. vulgaris bladene er mottagelig for infiltrering, og ved sentrifugehastigheten som er brukt her (1000 x g) fjerning av størstedelen av infiltrasjon fluid ved sentrifugering kan ses direkte som bladene tilbake til deres opprinnelige grønn farge. P. vulgaris blad fersk vekt var i gjennomsnitt 1,1 xg før infiltrasjon og ga 0,5 ml AWF per gram fersk vekt. Proteinkonsentrasjonen av det AWF ble bestemt til å være 0,18 ± 0,08 mg / ml ved anvendelse av en standard Bradford proteinanalyse. Fortynningsfaktoren for disse bladene, beregnet ved å måle indigokarmin fortynning, var 2,3 ± 0,3 fold. Verdiene kan variere betydelig mellom arter og pilotforsøk er nødvendig for å bestemme utbyttet av AWF per gram blad frisk viight, samt AWF proteinkonsentrasjon og fortynning faktor som kan ventes for en gitt bladtypen.
Skade på integriteten av cellene kan forekomme både under infiltrering trinnet, hvis endringene i trykket er for hurtig, og under sentrifugeringstrinn hvis sentrifugalkraften blir for høy. Det er derfor nødvendig å analysere Awf prøver for markører av cytoplasmic forurensning; Ideelt sett er flere uavhengige analyser utført. Her er resultatene fra tre mulige analysene rapportert i tabell 2. I tillegg utføres ekstraksjoner av P. vulgaris AWF, G6PDH var umulig å oppdage ved en standard enzymanalyse. Dette er i samsvar med andre rapporter hvor G6PDH-aktivitet blir synlig bare over en terskel sentrifugalkraft 12. I motsetning til dette, en referansenivået malat dehydrogenase-aktivitet (2,5 U / ml) ble observert i alle P. vulgaris AWF prøver ved å bruke en standard metabolsk analysen. Økende sentrifugal force over en terskel på 1000 xg resulterte i økte MDH aktiviteter (resultater ikke vist). Som apoplast fra andre arter er kjent for å inneholde endogene MDH aktivitet 18 blir detektert her mengde anses ekte apoplastic aktivitet og betydelige økninger over dette referansenivå er indikative for forurensning. Metabolitter som er antatt å være hovedsakelig cytoplasma, slik som heksose--6-fosfat, kan også bli brukt for å vurdere forurensning av AWF. Her, GC-MS analyse oppdaget null eller spornivåer av G-6-P i AWF ekstraksjon. I motsetning i cut mais rot seksjoner, G-6-P ble oppdaget etter at AWF utvinning på alle sentrifugeringshastighet og økt konsentrasjon i høyere hastigheter, noe som indikerer cytoplasmic forurensning 10.
Metabolitt-analyse ved GC-MS av P. vulgaris blad AWF vanligvis gir 40 - 60 identifiserbare metabolitter og omtrent like mange av uidentifiserbare forbindelser (figur 2). Ellerløse syrer, enkle sukkerarter og aminosyrer utgjør hoveddelen av de identifiserbare metabolitter imidlertid sekundære plante metabolitter har også blitt påvist og kvantifisert fra AWF 11. Flere eksempel topper fra disse forskjellige klasser molekyl er merket i figur 2 Ytterligere nedstrøms analytiske teknikker kan anvendes på disse Awf prøver å kvantifisere forskjellige molekyler, for eksempel:. ICP-MS, NMR, HPLC, atomabsorpsjonsspektroskopi, protein massespektrometri.
Proteinkomponenten av apoplast er også representert i AWF som vist i Coomassie Brilliant Blue farget SDS-PAGE-gel i figur 3. Blant andre roller, de apoplastic enzymer er ansvarlige for syntesen av cellevegg og dannelsen av ekstracellulære reaktiv oksygenarter. Proteomikk studier av AWF fra ulike arter har identifisert dusinvis av individuelle proteiner og vist at proteinkomponenten i apoplast reagerer på Environmental stresset 13,19. Ideelt AWF ekstrakt bør være fri for forurensning av cytoplasmatiske proteiner som Rubisco; Men i praksis er vanskelig å oppnå. Tilstedeværelsen av en Rubisco proteinbånd ved ~ 53 kDa etter SDS-PAGE gir en ytterligere kvalitativ analyse for integriteten til AWF prøver. For eksempel prøven som er lagt i spor 2 i figur 3 inneholder en større mengde av Rubisco forurensning som for spor 1.
| Phaseolus vulgaris AWF | |
| Volum av AWF (ml g -1 blad FW) | 0,49 ± 0,09 |
| Protein kons. (Mg ml-1) | 0,18 ± 0,08 |
| Fortynningsfaktoren | 2.3 ± 0.3 |
| G6PDH aktivitet (U ml -1) | |
| Glc-6-P (mg ml-1) | ingen oppdaget |
| MDH aktivitet (U ml -1) | 2,5 ± 0,9 |
Tabell 2. Typiske resultater for Awf utdrag fra P. vulgaris cv. Tender blader.
Figur 1. Standard apoplast utvinning arbeidsflyt. Tallene refererer til trinnene i protokollen.
Figur 2. Et eksempel GC-MS kromatogram av P. Vulgaris cv. . Pryd AWF De nummererte eksempel metabolitt topper er: 1-malonat, 2-fosfat, 3-succinat, 4-ukjente, 5-malat, 6-asparagin, 7-ribitol (intern stAndard), 8-citrat, 9-glukose, 10-inositol, 11-koffeinsyre, 12-sukrose.
Figur 3. Et eksempel på SDS-PAGE Coomassie farget gel av P. Vulgaris Awf blad ekstrakter. Denne gel gir en sammenligning mellom proteinkomponenter i to AWF ekstraksjoner som avviker i mengden av cytoplasmatiske forurensning av det rike plastidial enzym Rubisco. Etter ekstraksjon AWF begge prøver ble underkastet aceton proteinutfelling i en 4 gangers overskudd (v / v) av kald aceton og gjenoppløst i vann ved en tiendedel av det opprinnelige volum. Felt 1 og 2 inneholder 40 ug protein. Båndet svarende til Rubisco stor kjede (~ 53 kDa) er angitt med en pil. M r: protein-molekylvektmarkører.
Discussion
Optimalisering av plantevevet kilden
Biologisk og teknisk variasjon kan være store når du utfører apoplast utdrag, og dermed et svært standardisert arbeidsflyt er nyttig å øke kontinuitet på tvers av eksperimenter (figur 1). Viktigere, må kilden til plantevevet være standardisert, inklusive bladtypen, blad alder, vekst / miljøbetingelser og tid på dagen (tabell 1). Store forskjeller i hvor enkelt forskjellige blader er infiltrert og AWF senere gjenfunnet ved sentrifugering; disse forskjellene er korrelert med stomata nummer, blenderåpningen og mesophyll motstand 12,14. Selv blant ulike sortar av P. vulgaris det er store forskjeller i den enkle og utbytte av AWF utvinning prosedyre; for eksempel blader av pryd varianten her er mer mottagelig for AWF utvinning ved hjelp av denne metoden enn den kanadiske Wonder sorten. InnenforP. vulgaris de første virkelige bladene er den største og lettest å infiltrere, noe som gjør dem det opplagte valget for apoplastic ekstraksjon. Den apoplastic luft- og vannvolumet har vist seg å variere med alderen blad hos flere arter som fører til forskjeller i AWF extractability 12,14. I P. vulgaris, eldre bladene blir vesentlig vanskeligere å infiltrere og gi mindre AWF på sentrifugering; derfor bladene ble høstet når de nådd full ekspansjon. Blader som er vanskelig å infiltrere senere kreve høyere sentrifugeringshastighet for å gjenopprette AWF. En bør derfor nøye skjermen flere forskjellige typer blad og varianter før du bestemmer på en vev kilde for storskala AWF ekstraksjon.
Plantevekstbetingelser må også bli standardisert så mye som mulig innenfor rammen av forsøket. Bruken av vekst skap er å foretrekke da de gir konsistent fuktighet, temperatur og light intensitet regiments skal opprettholdes. Høsting av bladene skal alltid skje på samme tidspunkt på dagen fordi konsentrasjonene av metabolitter, enzymer, osv varierer gjennom dagaktive syklus 14. Til slutt, for å sikre at anlegget later alle har lik turgor trykk, bør plantene vannes snart før (~ 1 time) innhøstingen.
Optimalisering av blad infiltrasjon og sentrifugering
Uønsket cytoplasmisk forurensning av filteret legge på grunn av partiell cellelyse vil være resultatet hvis mekaniske påkjenninger som oppdages av cellene er for høy i løpet av infiltrasjons eller sentrifugeringstrinn. Derfor bør prosedyren for et gitt blad typen være en optimalisert avveining mellom å maksimere avkastning og minimere cytoplasmic kontaminering av AWF. I alle tilfeller bør man bruke den laveste sentrifuge hastigheten som AWF kan gjenvinnes for å unngå mekanisk ødeleggelse av bladcellene. Optimalisering av centrifusøkelsen hastighet skal bestemmes empirisk for hvert blad typen ved å overvåke volumet gjenvinnes og apoplast forurensning over et område av sentrifugehastigheter. Det har blitt observert at markeringen enzymaktiviteter, slik som MDH, G6PDH og glukose-fosfatisomerase, forblir lavt inntil et terskel sentrifugalkraft overgås, over hvilken disse aktivitetene øke raskt, antagelig på grunn av cytoplasmatisk lekkasje 9,12,14. Bruken av Parafilm for støtte under sentrifugeringstrinn, slik det fremgår av Baker et al., 2012 11, kan forbedre effektiviteten av filteret legge ekstraksjon og kan minimalisere mekaniske skader bladet bladet forårsaket av overdreven bretting og sammenpressing. Videre er bruken av Parafilm forbedrer visualiseringen av bladet etter sentrifugering når man skal undersøke blad for skader og fullstendigheten av AWF ekstraksjon.
Nouchi 12 beskriver optimalisering av AWF utvinning fra kutt ris blad seksjoner, som er difficult å infiltrere og krever høyere sentrifugeringshastighet for å samle AWF grunn av sine små stomatal åpninger. Forbedret fukting av ris bladflaten, enten ved presoaking bladene i destillert vann eller tilsetning av et overflateaktivt middel til infiltrasjon fluid, lettes infiltrasjonsprosessen. En høyere sentrifugehastighet (6000 xg) ble også brukt mens overvåking for apoplastic forurensning 12. Ved bruk av kuttet bladseksjoner er det alltid en risiko for at cytoplasmatiske forurensning vil være mer vanlig, selv med grundig vasking av såret områder; cut blader bør derfor kun brukes når det er nødvendig.
For mange studier destillert vann anvendes som infiltrasjonsfluid 11. Imidlertid kan forbindelsene bli tilsatt til infiltrasjon fluid, for eksempel salter eller buffere, for å forbedre utvinning av visse apoplastic forbindelser, spesielt proteiner 13. Lohaus 14 evaluert effekten av ionisk og osmotisk styrke on sammensetningen av gjenvunnet AWF og funnet dem til å være ubetydelig. Endringer i pH i infiltrasjon medium, men kan påvirke AWF sammensetning 14.
Riktig håndtering og lagring av den utpakkede apoplastic væske er viktig. AWF har vist seg å inneholde en overflod av proteaser og andre enzymer 13,20, samt flyktige organiske forbindelser. Derfor, for å redusere endringer i sammensetningen av AWF etter utvinning er det anbefalt å holde prøvene på is, eller på annen måte oppbevart ved -80 ° C. Videre bør enzymatiske analyser av AWF utføres så snart som mulig etter ekstraksjonen for å begrense enzyminaktivering på grunn av proteolyse, langvarig fortynning eller fryse-tining.
Fremgangsmåte for infiltrering fortynner apoplastic fluid, og det er ofte nødvendig å bestemme omfanget av denne fortynning. Den sentrifugeringstrinn kan også fortynne AWF med vann fra intracellulære kamre. En fortynningsfaktoren trengered å anslå in vivo apoplast kjemiske konsentrasjoner når målingene er gjort på AWF. En fortynningsfaktor er også nødvendig å konsentrere AWF tilbake til full styrke når den blir brukt som en apoplast ligne vekstmedium for mikroorganismer - og dermed søker in vivo metabolittkonsentrasjoner så nøyaktig som mulig. Flere variasjoner av fremgangsmåten beskrevet i trinn 4 for å bestemme AWF fortynningsfaktor ved måling av fortynning av en markørforbindelse tilsatt til infiltrasjon fluid. For alle metoder AWF fortynning beregningen forutsetter at infiltrasjon væsken ikke blir merkbart absorbert eller utvannet av bladcellene under AWF gjenopprettingsprosessen. Denne antagelsen har tidligere blitt verifisert for infiltrering trinn 14, men er ubekreftet for sentrifugeringstrinnet. Markøren sammensatte må heller ikke bli absorbert, transporteres eller endring mens i apoplast. Indigokarmin er den mest brukte og grundig testet av fargestoffer som brukesfor Awf beregninger fortynning. Indigo Carmine viser en lav absorbans i kationbytterharpiks og isolerte cellevegger, og ble vist å være egnet for Awf beregninger i Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum og Glycine max 11,21,22. Men i noen bladtyper, for eksempel ris og agurk, indigokarmin dukket ikke være fullt restituert etter infiltrasjon, noe som ville føre til en undervurdering av den AWF fortynningsfaktoren 12,21. Mangelen på utvinning av indigokarmin kan være på grunn av sin følsomhet for spalting i isatin sulfonat av superoksid 23, som er kjent for å bli produsert i apoplast, spesielt under stress 24. Spalting av indigokarmin inn isatin sulfonat vil resultere i et tap av absorbans ved 610 nm og en økning på 245 nm. Hvorvidt denne reaksjonen oppstår i vesentlig grad i apoplast, eller om denne reaksjonen kan bli inhibert ved tilsetning av superoksyd-fjernere å infiltration væske er ikke undersøkt hittil. Blå dekstran har blitt brukt i stedet for indigokarmin for kvantifisering av AWF fortynningsfaktoren i ris blader 12, selv om dens stabilitet og utvinning i AWF ikke har blitt rapportert. Alternativt kan radiomerkede forbindelser så som [14C] sorbitol eller andre målbare interne standarder brukes i stedet for fargestoffer og reduksjonen i radioaktiviteten eller konsentrasjonen målt og anvendt for å beregne den fortynningsfaktor på en analog måte 11,14,25.
Begrensninger av teknikken
Noen advarsler finnes for infiltrasjonen-sentrifuge AWF isolasjonsmetoden. For det første kan den utvanning av apoplast under infiltrasjon lokke fram et svar fra anlegget. Hvis de omkringliggende bladcellene detektere en redusert konsentrasjon av visse komponenter av apoplastic fluid, kan de reagere ved å utskille ytterligere metabolitter, forvrenge tolkning av metabolittkonsentrasjoner. Ien vurdering av dette problem ble det observert at verken tid mellom infiltrasjon og sentrifugering eller moderate forskjeller i ionestyrken av infiltrering fluid påvirket av sammensetningen av den ekstraherte AWF 14,22. Derfor vil alle gjenstander som følge av apoplast fortynning er tenkt å være minimal.
En annen potensiell ulempe er at eluering av AWF ved sentrifugering ikke fange opp alle de molekyler som er til stede i apoplast av flere grunner. Noen forbindelser, spesielt kationer og proteiner kan være tett forbundet med den negativt ladede celleveggen og ikke eluere med AWF 13. Andre molekyler som proteiner kan være for stor til å eluere effektivt ut av apoplast ved sentrifugehastigheter som brukes 14. Reaktive oksygenarter er en viktig klasse av forbindelser fremstilt i apoplast, men på grunn av den korte levetid for disse forbindelser, og uspesifiserte krav for deres fremstilling, deres presence er ikke godt fanget av AWF utvinning. Det er ikke kjent hvor nøyaktig AWF representerer in vivo sammensetningen av apoplast fluid, og dette kan variere mellom arter.
Flere analyser for å avgjøre cytoplasmic forurensning, selv om ingen er universelt akseptert. Analyser av overveiende cytoplasmatiske enzymer (f.eks G6PDH, hexose fosfatisomerase, MDH) har fordelen av å være lett å utføre, men kan ikke korrelerer godt med cytoplasmic lekkasje 14,18. Vurderingen av cytoplasmatiske metabolitter (f.eks, heksose- fosfater, klorofyll) er kanskje mer en indikasjon, men er mindre godt etablert 11. Likevel kan enten type assay være nyttig for kvantifisering av relativt apoplastic forurensning mellom prøvene. Ideelt sett bør flere uavhengige målinger brukes til å validere integriteten av AWF prøven.
Mens anerkjenner sine begrensninger, infiltrasjon-centrifugatipå teknikken beskrevet her er fortsatt en enkel og robust teknikk i studiet av apoplastic proteiner, primære og sekundære metabolitter og uorganiske ioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
References
- Felle, H. H. Apoplastic pH during low-oxygen stress in barley. Annals of Botany. 98 (5), 1085-1093 (2006).
- Schaarschmidt, S., Kopka, J., Ludwig-Müller, J., Hause, B. Regulation of arbuscular mycorrhization by apoplastic invertases: enhanced invertase activity in the leaf apoplast affects the symbiotic interaction. The Plant Journal. 51 (3), 390-405 (2007).
- Outlaw, W. H., De Vlieghere-He, X. Transpiration rate. An important factor controlling the sucrose content of the guard cell apoplast of broad bean. Plant Physiology. 126 (4), 1716-1724 (2001).
- Rico, A., Jones, R., Preston, G. M. Adaptation to the plant apoplast by plant pathogenic bacteria. Plant Pathogenic Bacteria. , 63-89 (2009).
- Rico, A., Preston, G. M. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 uses constitutive and apoplast-induced nutrient assimilation pathways to catabolize nutrients that are abundant in the tomato apoplast. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (2), 269-282 (2008).
- Solomon, P., Tan, K., Oliver, R. The nutrient supply of pathogenic fungi; a fertile field for study. Molecular Plant Pathology. 4, 203-210 (2003).
- Brunner, F. Innate immunity in plants and animals: emerging parallels between the recognition of general elicitors and pathogen-associated molecular patterns. Current Opinion in Plant Biology. 5 (4), 318-324 (2002).
- Fontaniella, B., Vicente, C., Armas, R., Legaz, M. E. Effect of leaf scald (Xanthomonas albilineans) on polyamine and phenolic acid metabolism of two sugarcane cultivars. European Journal of Plant Pathology. 119 (4), 401-409 (2007).
- Millán, A. F., Morales, F., Abadía, A., Abadía, J. Effects of iron deficiency on the composition of the leaf apoplastic fluid and xylem sap in sugar beet. Implications for iron and carbon transport. Plant Physiology. 124 (2), 873-884 (2000).
- Dragišić Maksimović, J. L., et al. Filter strip as a method of choice for apoplastic fluid extraction from maize roots. Plant Science. 223 (1), 49-58 (2014).
- Baker, C. J., et al. An internal standard technique for improved quantitative analysis of apoplastic metabolites in tomato leaves. Physiological and Molecular Plant Pathology. 78, 31-37 (2012).
- Nouchi, I., et al. Overcoming the difficulties in collecting apoplastic fluid from rice leaves by the infiltration-centrifugation method. Plant & Cell Physiology. 53 (9), 1659-1668 (2012).
- Boudart, G., et al. Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics. Proteomics. 5 (1), 212-221 (2005).
- Lohaus, G., Pennewiss, K., Sattelmacher, B., Hussmann, M., Hermann Muehling, K. Is the infiltration-centrifugation technique appropriate for the isolation of apoplastic fluid? A critical evaluation with different plant species. Physiologia Plantarum. 111 (4), 457-465 (2001).
- Bergmeyer, H. U. Malate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 614 (1974).
- Lohr, G. W., Waller, H. D. Glucose-6-phosphate Dehydrogenase. Methods of Enzymatic Analysis. 2, 636-643 (1974).
- Lisec, J., Schauer, N., Kopka, J., Willmitzer, L., Fernie, A. R. Gas chromatography mass spectrometry-based metabolite profiling in plants. Nature Protocols. 1 (1), 387-396 (2006).
- Li, Z. C., McClure, J. W., Hagerman, A. E. Soluble and bound apoplastic activity for peroxidase, beta-d-glucosidase, malate dehydrogenase, and nonspecific arylesterase, in barley (Hordeum vulgare L.) and oat (Avena sativa L.) primary leaves. Plant Physiology. 90 (1), 185-190 (1989).
- Dani, V., Simon, W. J., Duranti, M., Croy, R. R. D. Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress. Proteomics. 5 (3), 737-745 (2005).
- Shabab, M., et al. Fungal effector protein AVR2 targets diversifying defense-related Cys proteases of tomato. Plant Cell. 20 (4), 1169-1183 (2008).
- Cosgrove, D. J., Cleland, R. E. Solutes in the free space of growing stem tissues. Plant Physiology. 72 (2), 326-331 (1983).
- Husted, S., Schjoerring, J. K. Apoplastic pH and ammonium concentration in leaves of Brassica napus. L. Plant Physiology. 109 (4), 1453-1460 (1995).
- Kettle, A. J., Clark, B. M., Winterbourn, C. C. Superoxide converts indigo carmine to isatin sulfonic acid. The Journal of Biological Chemistry. 279 (18), 18521-18525 (2004).
- Bournonville, C. F. G., Díaz-Ricci, J. C. Quantitative determination of superoxide in plant leaves using a modified NBT staining method. Phytochemical Analysis. 22 (3), 268-271 (2011).
- Speer, M., Kaiser, W. M. Ion relations of symplastic and apoplastic space in leaves from Spinacia oleracea L. and Pisum sativum L. under salinity. Plant Physiology. 97 (3), 990-997 (1991).
