Abstract
Apoplasten ist eine deutliche extrazellulären Raum in Pflanzengeweben, die außerhalb der Plasmamembran liegt, und enthält die Zellwand. Die apoplastischen Raum von Pflanzenblättern ist der Ort von mehreren wichtigen biologischen Prozessen wie Zellwandbildung, zelluläre Nährstoff- und Wasseraufnahme und Exportanlagen-Endophyten Interaktionen und Abwehrmechanismen gegen Krankheitserreger. Die Infiltration-Zentrifugationsverfahren wird auch eine robuste Technik für die Analyse der löslichen Apoplasten Zusammensetzung verschiedener Pflanzenspezies hergestellt. Das durch dieses Verfahren erhaltene Flüssigkeit wird häufig als Apoplasten Waschflüssigkeit (AWF) bekannt. Das folgende Protokoll beschreibt eine optimierte Vakuuminfiltration und Zentrifugationsverfahren für AWF Extraktion aus Phaseolus vulgaris (Französisch Bohne) cv. Tendergreen Blätter. Die Grenzen dieses Verfahrens und der Optimierung des Protokolls für andere Pflanzenarten diskutiert. Wiederhergestellte AWF können in einer breiten Palette von Downstream experimen verwendet werdents, die die Zusammensetzung des Apoplasten charakterisieren sucht und wie er in Reaktion auf Pflanzenart und Genotyp, der Pflanzenentwicklung und den Umgebungsbedingungen ändert, oder um zu bestimmen, wie Mikroorganismen wachsen in Apoplasten Fluid und auf Veränderungen in der Zusammensetzung.
Introduction
Die Anlage Apoplast ist die interzellulären Raum, die Pflanzenzellen umgibt. Dies ist ein dynamisches Umfeld, in dem viele Stoffwechsel- und Transportprozesse stattfinden. Das Hauptstrukturkomponente des Apoplasten ist die Zellwand, die zusammengebaut und durch Enzyme, strukturelle Proteine und Metaboliten im Apoplasten befindet modifiziert. Bei gesunden Pflanzenzellen Apoplasten wird im allgemeinen in einem sauren Zustand gehalten ermöglicht Aminosäuren, Zucker und anderen Nährstoffen aus den Apoplasten zum Zytoplasma von H + symport 1 eingeführt werden. Während Saccharose Verkehr, Saccharose bewegt sich von photosynthetischen Quellen durch den Apoplasten und in Phloem Gefäßsystem; Saccharose wird dann durch einen osmotischen Potential apoplastischen Invertasen Abspalten Saccharose in der Spüle Organe 2 gehalten transportiert. Zucker und andere Nährstoffe können auch nach oben transportiert werden und reichern sich in der Stomata Hohlräume durch die Transpirationsstrom 3.
"> Apoplasten stellt auch ein Umwelt Nische viele Krankheitserreger aufzubauen deren parasitäre Lifestyle. Bakterielle Pflanzenpathogene haben die Fähigkeit, hohe Dichten in den Apoplasten, das sie durch natürliche Öffnungen wie Stomata oder durch Wunden 4 Zugriff zu vermehren. Die Konzentration der Aminosäure Säuren und andere Stickstoffverbindungen in Tomaten Apoplast gezeigt worden sind, aus, um den Nährstoffbedarf von Bakterien und Pilzen 5,6 unterstützt sein. Primäre Abwehrreaktionen gegen mikrobielle Krankheitserreger auch im Apoplasten auftreten, nämlich die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies durch extrazelluläre Peroxidase . und Oxidasen und die Stärkung der Zellwand durch Vernetzung und Kallose Ablagerung 7. Die Pflanzenzellwand ist reich an sekundären Metaboliten mit antimikrobiellen Aktivitäten, die biochemische Natur dieser sekundären Metaboliten variiert zwischen den Arten 8.Als Ergebnis des oben erwähnened und andere Prozesse enthält Blatt apoplastischen Fluid eine Vielzahl von Proteinen, Zuckern, organischen Säuren, Aminosäuren, Sekundärmetaboliten, Metalle und andere Kationen (zum Beispiel Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Konzentrationen an gelösten Stoffen im Apoplasten der Triebe sind weitgehend durch das Gleichgewicht der Transportprozesse zwischen den Apoplasten und Xylem, Phloem und Zytoplasma 9 auftretenden gesteuert. Allerdings Stoffwechselreaktionen und mikrobielles Wachstum auch konsumieren oder produzieren apoplastischen gelöste Stoffe. Die Zusammensetzung des Apoplasten ist bekannt, dass zwischen Pflanzenarten und Genotypen und als Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen, einschließlich Licht, Ernährung und biotische und abiotische Stressfaktoren 9 abweichen. Durch die Untersuchung der Zusammensetzung des Apoplasten und wie sie sich ändert, einschließlich Eigenschaften wie Redox und osmotische Potential, pH-Wert, Nährstoff / Metabolit Verfügbarkeit und enzymatischen Aktivitäten, kann man neue Erkenntnisse darüber, wie Pflanzen wieder gewinnenchen an ihre Umgebung. Verständnis oder die Charakterisierung der molekularen Veränderungen, die in den Apoplasten Lösung auftreten ist kompliziert, weil es eine räumlich strukturiert und dynamische Fach, in dem Metaboliten und / oder Ionen können flüchtige, transienten oder mit der Zellwand und Zellmembran assoziiert ist. Darüber hinaus werden verschiedene Analysetechniken erforderlich, um die Reihe von verschiedenen chemischen Typen abdecken.
Um die Zusammensetzung des löslichen Apoplasten zu studieren, muss Fluid üblicherweise aus dem Gewebe herausgezogen werden. Es gibt verschiedene Verfahren, um aus verschiedenen Geweben, einschließlich einer neu vorgeschlagenen Filterstreifenmethode 10 extrahieren Apoplast Flüssigkeit, aber die meisten etablierten Extraktionsverfahren für Blätter ist Infiltration-Zentrifugation. Diese Technik hat sich bereits 11-13 bewertet worden und 14 Lohaus et al. 2001 eine gründliche Prüfung der viele der technischen Parameter der Methode. Wie der Name, die Infiltration-centrifu implizierttions Technik ist ein zweistufiges Verfahren, die im wesentlichen um Ersatz des apoplastischen Luftraum mit einer wässrigen Flüssigkeit Infiltration, die mit dem nativen apoplastischen Flüssigkeit vermischt, gefolgt von der Gewinnung der Infiltration / apoplastischen Fluidgemisch durch sanfte Zentrifugation der Blätter. Da das wiedergewonnene Flüssigkeit wird verdünnt und nicht alle in den Apoplasten vorliegenden Verbindungen (siehe unten), enthält, wird diese Flüssigkeit allgemein als Apoplasten Waschflüssigkeit (AWF) oder manchmal interzellulären Waschflüssigkeit, anstatt apoplastischen Fluid bekannt. Die Infiltrations Zentrifugationstechnik leicht skalierbar wodurch einzelne oder gepoolte AWF Proben ausreichender Lautstärke erzeugt und an eine Vielzahl von stromabwärts biochemischen und analytische Techniken (unterzogen werden, wie zB Protein-Elektrophorese, Messung der Enzymaktivität, NMR, viele Arten von Chromatographie und Massen Spektrometrie). Blatt AWF ist auch nützlich als Apoplasten imitiert Wachstumsmedium für die Untersuchung der Wechselwirkung von Pflanzen kolonisierenden Mikroorganismen with ihre Umgebung 5.
In der folgenden Protokolle beschreiben wir, wie die Infiltration-Zentrifugationstechnik mit Phaseolus vulgaris cv durchzuführen. Tendergreen Blätter, und geben einige Beispiele für Downstream-Analysen mit dem Fokus auf Metabolomics. Wichtig ist, dass Methoden zur Bewertung der Qualität der AWF werden zusammen mit Beratung zur Verfügung gestellt, das Verfahren für unterschiedliche Blattarten zu optimieren.
Protocol
HINWEIS: Die Wahl der Ausgangsblattmaterial und Standardisierung von Pflanzenwachstumsbedingungen ist kritisch, da diese Faktoren die Qualität außerordentlich, Variabilität und Ausbeute AWF (Figur 1) zu beeinflussen. Parameter zu berücksichtigen, sind in Tabelle 1 gezeigt und werden im Detail in der Diskussion erläutert.
| Parameter | Beispiel Standardisierungen | ||
| Phaseolus vulgaris | Solanum lycopersicum | Arabidopsis thaliana | |
| Blatttyp | Ersten Laubblätter, voll ausgebaut, gesunde | 2. und 3. Blättern ab Boden, 4 größten Flugblätter genommen apikal Broschüre nicht Apoplast Extraktion verwendet | Voll ausgebaut Rosettenblätter |
| Anlagenalter | 21 Tage | 7 - 9 Wochen 7 Wochen | |
| Uhrzeit | Mitte der Lichtperiode (12:00) | Mitte der Lichtperiode (12:00) | Mitte der Lichtperiode (12:00) |
| Hydration | Alle Pflanzen gut bewässert 1 h vor der Ernte | Alle Pflanzen gut bewässert 1 h vor der Ernte | Alle Pflanzen gut bewässert 1 h vor der Ernte |
| Licht | 16 Stunden Licht, 400 & mgr; mol m -2 s -1 | 16 Stunden Licht, 400 & mgr; mol m -2 s -1 | 10 Stunden Licht (Kurz Tag) von Woche 2, 400 & mgr; mol m -2 s -1 |
| Luftfeuchtigkeit | 70% | 70% | 70% |
| Temperatur | 22 ° C Licht, 18 ° C dunkel | 22 ° C Licht, 18 ° C dunkel | 21 ° C |
Tabelle 1 Beispiele für genormte Parameter für Blätter in AWF Extraktionen verwendet.
1. Generieren Apoplast Waschflüssigkeit
HINWEIS: Während dieses Protokolls gefährlichen materila inculding mikrobiellen Krankheitserregern aus infizierten Blätter sollten nicht in die Kanalisation gespült werden; nicht ordnungsgemäße Entsorgung Verfahren verwendet werden soll.
- Wählen Vorrichtung basierend auf Blattgröße:
- Infiltrieren kleinere Blätter (zB Arabidopsis, Soja) Verwendung einer nadellosen Spritze. Verwenden Sie eine Thermoskanne, um Blätter, die zu groß ist, um eine Spritze zu passen sind zu infiltrieren. Verwenden Sie die Thermoskanne Methode, um mehrere Blätter gleichzeitig zu infiltrieren.
- Teilen Blätter, die zu groß für die verfügbare Infiltrationsverfahren in kleinere Abschnitte mit einer Rasierklinge sind. Gründlich geschnitten Blattstücke in destilliertem Wasser vor der Infiltration zu zytoplasmatischen Verunreinigungen, die aus beschädigten Zellen strahlen zu entfernen.
- Blatt Infiltration mit einem 60-ml-Spritze:
- Nehmen Sie das Blatt aus derAnlage am Blattstiel mit einer Rasierklinge. Bei der Compound-Blätter wie Tomate, lösen Flugblätter an der petiolule.
- Den frisch ausgeschnitten Blatt durch Eintauchen Spülen in destilliertem Wasser auf Blattoberfläche Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie das Blatt durch leichtes Abtupfen mit saugfähigem Papier oder Papier.
- Messen Sie die Flügelgewicht vor der Infiltration.
- Vorsichtig rollen und / oder falten Sie das Blatt in einen 60-ml-Spritze und füllen Sie die Spritze mit destilliertem Wasser (Infiltration andere Flüssigkeiten verwendet werden können, siehe Diskussion). Werfen Sie keine Luft in der Spritze, während eine Senkung der Kolben bis etwa zur 40 ml-Marke.
- Decken Sie die Spritzenspitze entweder mit einem behandschuhten Finger oder ein Stück Parafilm, dann erstellen Sie Unterdruck in der Spritze, indem Sie den Kolben nach außen zur 60 ml-Marke. Sie langsam den Kolben.
HINWEIS: Schnelles Lösen des Drucks in Zell-Lyse und zytoplasmatische Verunreinigung bei. - Ziehen Sie den Spritzenspitze und werfen keine Luft, umstecken dann die Spitze, und drücken Sieweiter nach unten auf den Kolben, um einen bescheidenen Betrag von Überdruck zu erstellen.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.2.5 - 1.2.6, bis das Blatt vollständig infiltriert, wie durch den dunklen Farbe der infiltrierten Bereiche gesehen.
- Entfernen Sie das Blatt aus der Spritze. Vorsichtig, aber gründlich trocknen Sie die Blätter mit saugfähigem Papier Oberfläche Flüssigkeit zu entfernen.
- Messen des Gewichts des infiltrierten Blatt. Berechnen des Gewichtsunterschieds vor und nach der Infiltration die eng approximiert die Infiltration Volumen.
- Blatt Infiltration durch Vakuumflasche:
- Nehmen Sie das Blatt aus der Anlage an der Blattstiel mit einer Rasierklinge.
- Den frisch ausgeschnitten Blatt durch Eintauchen Spülen in destilliertem Wasser auf Blattoberfläche Verunreinigungen zu entfernen. Trocknen Sie das Blatt durch leichtes Abtupfen mit saugfähigem Papier.
- Messen Sie die Flügelgewicht vor der Infiltration.
- Legen Sie das Blatt (oder verlässt, wenn mehrere Blätter infiltriert) in einem 250 ml oder größer Seitenarm Kolben containing destilliertem Wasser (Infiltration andere Flüssigkeiten verwendet werden können, siehe Diskussion). Decken Sie die Blätter mit der Flüssigkeit.
- Anwenden eines Unterdrucks auf den Kolben. Vorsichtig geschwenkt, um die Luftblasen aus den Blättern zu lösen. Vorsichtig und langsam das Vakuum.
HINWEIS: schnell das Vakuum in Zell-Lyse und zytoplasmatische Verunreinigung bei. - Wiederholen Sie Schritt 1.3.5 bis der Flügel vollständig infiltriert, wie durch den dunklen Farbe der infiltrierten Bereiche gesehen.
- Entfernen Sie das Blatt aus dem Kolben. Vorsichtig, aber gründlich trocknen Sie die Blätter mit saugfähigem Papier Oberfläche Flüssigkeit zu entfernen.
- Messen des Gewichts des infiltrierten Blatt. Berechnen des Gewichtsunterschieds vor und nach der Infiltration die eng approximiert die Infiltration Volumen.
- Rückgewinnung von AWF durch Zentrifugation:
- Legen Sie das Blatt auf ein Stück von 4 Zoll (10 cm) breite Parafilm. Mit einem 5 ml Pipettenspitze (oder eine ähnlich große Objekt),rollen Sie das Blatt in der Parafilm.
- Legen Sie die zusammengerollten Blatt mit Pipettenspitze in einen 20-ml-Spritze. Positionieren Sie keine Schnittblatträndern nach oben zeigt. Legen Sie die Spritze in einen sauberen 50 ml Polyethylen oder Polycarbonat Rohr.
- Zentrifugieren der Spritze in der Röhre für 10 Minuten bei 1.000 × g in einem Schwenkbecher-Rotor bei 4 ° C.
HINWEIS: Die visuelle Untersuchung der Blätter nach der Zentrifugation sollte zeigen, dass die Mehrheit der Infiltrationsflüssigkeit ausgestoßen. Dunkleren grünen Flecken zeigen, dass zusätzliche Zentrifugation Zeit erforderlich ist. - Pipettieren Sie die wiederhergestellte AWF die frische 1,5-ml-Röhrchen.
HINWEIS: Das Volumen der AWF sollte etwa entsprechen die Infiltration Volumen für das Blatt; wenn das Volumen geringer als zusätzliche Zentrifugationszeit oder Zentrifugation Geschwindigkeit erforderlich. - Zentrifugieren der AWF Proben bei 15.000 xg für 5 Minuten, um alle Zellen oder Partikel zu entfernen. Sie können auch das AWF durch ein 0,22 um-Filter, um remove Zellen und Partikeln.
- Pipettieren Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen. Halten Sie Proben auf Eis, bis der Lagerung.
- Bewahren Sie die AWF Proben bei -80 ° C.
2. Assays für Zytoplasmatische Verschmutzungs
- Halten Sie die AWF Proben auf Eis zu enzymatischen Reaktionen (zB Proteolyse) zu minimieren und führen Sie die Tests unmittelbar nach der Zentrifugation Schritte abgeschlossen sind.
HINWEIS: Metabolit-Assays können Proben direkt nach der Extraktion eingefroren und bei -80ºC bis zur Verwendung gelagert werden. - Bei einer Standard-Malat-Dehydrogenase (MDH) Testprotokoll siehe 15; andernfalls verwenden Sie ein handelsübliches MDH-Testkit.
- Bei einer Standard-Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) Testprotokoll siehe 16; andernfalls verwenden Sie ein handelsübliches G6PDH-Testkit.
- Zur Quantifizierung der zytoplasmatischen Metaboliten wie Glukose-6-phosphat (G-6-P) verwenden GC-MS, wie in Schritt 5 beschrieben
3. Berechnung des Apoplasten Verdünnungsfaktor
- Bereiten Sie zwei Bände der oben in Schritt 1.2.4 oder 1.3.4 (zB destilliertes Wasser) verwendet Tränkflüssigkeit. Hinzufügen Indigokarmin Pulver eine Lösung bis zu einer Endkonzentration von 50 uM, fügen nichts zu der anderen.
- Die Absorption bei 610 nm (OD 610) von 200 ul des Indigokarmin Infiltrationslösung mit einem Plattenlesegerät. Korrigieren Sie diesen Wert durch Subtraktion der OD 610 von 200 ul der Infiltration Lösung ohne Indigokarmin. Ersetzen Sie diese korrigierte Wert als OD 610infiltrate in der Gleichung unten.
- Führen mindestens drei Wiederholungsblatt Infiltrationen wie oben (Schritt 1.2 oder 1.3) mit beiden Infiltrations Lösungen (mit und ohne Indigokarmin).
- Nach der Infiltration rinse den Blättern in destilliertem Wasser, um Rest vorliegenden Indigokarmin auf den Außenflächen zu entfernen.
- Fahren Sie mit dem Zentrifugieren wie oben (Schritt 1.4).
- Bestimmen Sie die mittlere OD 610 von 200 ul der Indigokarmin AWF Extraktionen. Korrigieren Sie diesen Wert durch Subtraktion des durchschnittlichen OD 610-Wert von 200 ul von Indigokarmin kostenlos AWF. Ersetzen Sie diese korrigierte Wert als OD 610AWF in der Gleichung unten.
- Berechnen Sie den Verdünnungsfaktor (dh fache Verdünnung) aus den korrigierten Absorptionswerte als:
Apoplast Verdünnungsfaktor = OD 610infiltrate / (OD 610infiltrate - OD 610AWF) - Multiply Konzentration oder Aktivität Werte von AWF mit dem Verdünnungsfaktor, um die Konzentration / Aktivität in apoplastischen Flüssigkeit schätzen in planta.
4. Konzentration von AWF zu Endfestigkeit durch Gefriertrocknung
- Schalten Sie den Gefriertrockner und einellow es bei der Arbeitstemperatur und den Druck zu stabilisieren.
- Pool die gewünschte Menge an frischem oder gespeicherte AWF Proben.
- Verteilen Sie die Proben gleichmäßig auf 2 ml Zentrifugenröhrchen.
- Bestimmen Sie die Rekonstitution Volumen:
Rekonstitutionsvolumen = Volumen vor dem Gefriertrocknen / Apoplast Verdünnungsfaktor - Bei geschlossenen Lidern, Gefriert die Röhrchen in flüssigem Stickstoff.
- Übertragen Sie die Tiefkühlrohre an einen oder mehrere Kühlgefriertrocknen Gefäße. Während der Übertragung der Rohre, ersetzen Sie den Deckel mit einer, mit einem spitzen Gegenstand durchbohrt worden ist, um den Gasaustausch zu ermöglichen.
- Befestigen Sie die Geräte mit dem Gefriertrockner und lyophilisieren der Proben vollständig.
- Entfernen Sie die Proben aus der Maschine und rekonstituieren AWF durch Zugabe der berechneten Menge an destilliertem Wasser.
- Ersetzen Sie die undurchbrochene Deckel und die Proben bei -80 ° C lagern.
5. Metabolit-Analyse mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie 17
<ol>Representative Results
Typische Ergebnisse für AWF Extraktionen auf gesunde 3 Wochen alt P. durchgeführt vulgaris cv. Tendergreen Blättern, unter Verwendung von destilliertem Wasser als Tränkflüssigkeit werden in Tabelle 2 gezeigt. Junge P. vulgaris Blätter zugänglich sind, um die Infiltration und am Zentrifugationsgeschwindigkeit hier verwendeten (1000 × g) das Entfernen der Mehrzahl der Tränkflüssigkeit durch Zentrifugation direkt ersichtlich, wie die Blätter wieder ihre ursprüngliche grüne Farbe. P. vulgaris Blattfrischgewicht betrug durchschnittlich 1,1 xg vor der Infiltration und ergab 0,5 ml AWF pro Gramm Frischgewicht. Die Proteinkonzentration der AWF wurde bestimmt auf 0,18 ± 0,08 mg / ml unter Verwendung eines Standard Bradford-Test. Der Verdünnungsfaktor für diese Blätter, durch die Messung Indigokarmin Verdünnung berechnet, betrug 2,3 ± 0,3-fache. Die oben genannten Werte können erheblich zwischen den Arten und Pilotversuche unterscheiden sind erforderlich, um die Ausbeute der AWF pro Gramm Blattfrisch wir bestimmen,ight sowie die AWF Proteinkonzentration und Verdünnungsfaktor, der für einen bestimmten Blatttyp erwartet werden kann.
Beschädigungen der Integrität der Zellen kann sowohl während des Infiltrationsschritt während des Zentrifugationsschritts auftreten, wenn die Änderungen im Druck zu schnell sind, und wenn die Zentrifugalkraft zu hoch ist. Es ist daher notwendig, AWF Proben für Marker zytoplasmatischer Kontamination zu testen; Idealerweise werden mehrere unabhängige Tests durchgeführt. Hier werden die Ergebnisse von drei möglichen Tests in Tabelle 2 angegeben. In gut durch Extraktionen P. vulgaris AWF war G6PDH durch eine Standard-Enzymtest nicht nachweisbar. Dies steht im Einklang mit anderen Berichten, wo G6PDH Aktivität wird erst oberhalb eines Schwellen Zentrifugalkraft 12 nachweisbar. Im Gegensatz dazu wird ein Basisniveau der Malat-Dehydrogenase-Aktivität (2,5 U / ml) war in allen P. nachweisbaren vulgaris AWF Proben mit einem Standard-Stoffwechseltest. Die Erhöhung der Zentrifugalkraft fürce über einem Schwellenwert von 1.000 x g führte zu einer erhöhten MDH-Aktivitäten (Ergebnisse nicht gezeigt). Da das Apoplast von anderen Spezies ist bekannt, endogene MDH-Aktivität 18 enthält, wird das hier erfasste Menge oberhalb dieser Grundpegel als echt apoplastischen Aktivität und signifikante Erhöhungen weisen auf Verschmutzung. Metaboliten, die vermutlich vorwiegend zytoplasmatischen sein, wie Hexose-6-Phosphate, können auch verwendet werden, um Kontamination AWF beurteilen. Hier erfasst GC-MS-Analyse Null oder Spurenmengen von G-6-P in AWF Extraktionen. Im Gegensatz dazu schneiden Maiswurzelbereiche, G-6-P wurde nach AWF Extraktion bei allen Zentrifugiergeschwindigkeiten detektiert und erhöhte Konzentration mit höheren Drehzahlen, was anzeigt zytoplasmatischen Verunreinigungen 10.
Metabolit-Analyse durch GC-MS von P. vulgaris Blatt AWF ergibt typischerweise 40 - 60 identifizierbare Metaboliten und eine etwa gleiche Anzahl von nicht identifizierbare Verbindungen (Abbildung 2). Odernische Säuren, einfache Zucker und Aminosäuren stellen den Großteil der identifizierbare Metaboliten jedoch sekundäre Pflanzenstoffe haben auch festgestellt und von AWF 11 quantifiziert. Verschiedene Beispiel Peaks aus diesen unterschiedlichen Molekülklassen sind in Figur 2 markiert Abwärts analytische Techniken sind für diese Proben AWF um verschiedene Moleküle zu quantifizieren, z. Beispiel: ICP-MS, NMR, HPLC, Atomabsorptionsspektroskopie, Proteinmassenspektroskopie.
Die Proteinkomponente des Apoplasten wird auch in der AWF dargestellt, wie in dem Coomassie-Brilliant-Blue gefärbtes SDS-PAGE-Gel in 3 gezeigt. Unter anderen Funktionen sind die apoplastischen Enzyme für die Synthese der Zellwand und der Erzeugung von extrazellulärer reaktiver verantwortlich Sauerstoffspezies. Proteomik der AWF aus verschiedenen Spezies Dutzende einzelner Proteine identifiziert und gezeigt, dass die Proteinkomponente des Apoplasten reagiert Environmental Stress 13,19. Im Idealfall sollte AWF Extrakt frei von Verunreinigungen sein von zytoplasmatischen Proteinen, wie Rubisco; aber in der Praxis ist dies schwierig zu erreichen. Die Anwesenheit eines Rubisco Proteinbande bei ~ 53 kDa nach SDS-PAGE ein weiterer qualitativer Assay für die Integrität der AWF Proben. Zum Beispiel kann die Probe in Spur 2 in Figur 3 eingelegt enthält eine größere Menge von Rubisco Kontamination der von Spur 1.
| Phaseolus vulgaris AWF | |
| Volumen der AWF (ml g -1 Blatt FW) | 0,49 ± 0,09 |
| Protein Konz. (Mg ml -1) | 0,18 ± 0,08 |
| Verdünnungsfaktor | 2,3 ± 0,3 |
| G6PDH Aktivität (U ml -1) | |
| Glc-6-P (mg ml -1) | nicht nachgewiesen |
| MDH-Aktivität (U ml -1) | 2,5 ± 0,9 |
Tabelle 2. Typische Ergebnisse für AWF Extraktionen von P. vulgaris cv. Tendergreen Blätter.
Abbildung 1. Standard Apoplast Extraktion Workflow. Die Zahlen beziehen sich auf die Schritte in dem Protokoll.
Abbildung 2. Ein Beispiel GC-MS-Chromatogramm von P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF Die numerierten Beispiel Metabolit Peaks sind: 1-malonsäurediethylester, 2-phosphat, 3-Succinat, 4-unbekannt, 5-Malat, 6-Asparagin, 7-ribitol (interne standard), 8-Citrat, 9-Glucose, 10-Inosit, 11-Kaffeesäure, 12-Saccharose.
Figur 3 Ein Beispiel SDS-PAGE mit Coomassie-gefärbtes Gel P. Vulgaris AWF Blattextrakten. Dieses Gel zeigt einen Vergleich zwischen den Proteinkomponenten von zwei AWF Extraktionen, die in der Menge von cytoplasmatischen Verunreinigungen unterscheiden sich durch die reichlich vorhandenen plastidären Enzym Rubisco. Nach AWF Extraktions beide Proben wurden in einem 4-fachen Überschuß (v / v) kaltem Aceton Aceton Proteinfällung unterzogen und in Wasser bei einem Zehntel des ursprünglichen Volumens wieder aufgelöst. Spuren 1 und 2 enthalten 40 ug Protein. Die Bande, die dem Rubisco große Kette (~ 53 kDa) wird durch einen Pfeil angezeigt. M r: Protein-Molekulargewichtsmarker.
Discussion
Optimierung der Pflanzengewebe Quelle
Biologische und technische Veränderung kann groß sein, wenn die Durchführung Apoplast Extraktionen, damit ein hoch standardisierten Workflow ist hilfreich, um Kontinuität über Experimente zu erhöhen (Abbildung 1). Wichtig ist, dass die Quelle von Pflanzengewebe standardisiert werden, einschließlich Blatttyp, Blattalter, Wachstum / Umweltbedingungen und der Tageszeit (Tabelle 1). Große Unterschiede gibt es in der Leichtigkeit, mit der verschiedene Blätter infiltriert und die AWF anschließend durch Zentrifugieren gewonnen; Diese Unterschiede sind mit Spaltöffnungen Nummer, Maschenweite und Mesophyll Widerstand 12,14 korreliert. Auch zwischen den verschiedenen Sorten von P. vulgaris gibt es große Unterschiede in der Leichtigkeit und dem Ertrag der AWF Extraktionsverfahren; zB Blättern der Tendergreen Vielfalt werden dabei zugänglicher AWF Extraktion mit dieser Methode als die kanadischen Wonder Sorte. InnerhalbP. vulgaris die ersten Laubblätter sind der größte und am leichtesten zu infiltrieren, so dass sie die offensichtliche Wahl für apoplastischen Extraktionen. Apoplastischen Luft und Wassermenge wurde gezeigt, dass mit Blattalter bei mehreren Spezies, was zu Unterschieden in AWF Extrahierbarkeit 12,14 variieren. In P. vulgaris, ältere Blätter werden wesentlich schwieriger zu infiltrieren und ergeben weniger AWF beim Zentrifugieren; daher wurden Blätter geerntet, wenn sie voll Expansion erreicht. Blätter, die schwer zu infiltrieren anschließend erfordern höhere Geschwindigkeiten Zentrifugation, um den AWF erholen. Man sollte daher verschiedene Blattarten und Sorten Bildschirm sorgfältig vor der Entscheidung über eine Gewebequelle für große AWF Extraktionen.
Pflanzenwachstumsbedingungen muss auch im Rahmen des Experiments so weit wie möglich vereinheitlicht werden. Die Verwendung von Kammern nicht bevorzugt, da sie ermöglichen konstante Luftfeuchtigkeit, Temperatur und light Intensität Regimenter beibehalten werden. Das Ernten der Blätter immer an der gleichen Tageszeit auftreten, da die Konzentrationen der Metaboliten, Enzyme etc. variieren während des Tageszyklus 14. Schließlich, um sicherzustellen, dass die Anlage verlässt alle ähnliche Turgordruck, sollten die Pflanzen bald vor (ca. 1 Stunde) der Ernte bewässert werden.
Optimierung der Blattunterwanderung und Zentrifugation
Unerwünschte zytoplasmatischen Kontamination der AWF durch partielle Zellyse eintreten werden, wenn die mechanische Belastung durch die Zellen auftritt, ist während der Infiltration oder Zentrifugationsschritte zu hoch. Daher sollte das Verfahren für eine gegebene Blatttyp ein optimierter Kompromiss zwischen der Maximierung Ausbeute und zur Minimierung zytoplasmatischen Kontamination der AWF sein. In allen Fällen sollte man den niedrigsten Zentrifugation Geschwindigkeit, mit der AWF gewonnen werden kann, um mögliche mechanische Zerstörung der Blattzellen zu vermeiden. Optimierung der centrifutionsGeschwindigkeit sollte empirisch für jede Blatttyp durch die Beobachtung der Zahl erholt und Apoplast Kontamination über einen Bereich von Zentrifugation Geschwindigkeiten bestimmt werden. Es wurde beobachtet, dass die Markerenzymaktivitäten, wie MDH, G6PDH und Glucose-Phosphat-Isomerase, bleiben, bis ein Schwellenwert Zentrifugalkraft überschritten wird, oberhalb derer diese Aktivitäten erhöhen schnell, vermutlich aufgrund zytoplasmatischen Leck 9,12,14 gering. Die Verwendung von Parafilm zur Unterstützung während der Zentrifugationsstufe, wie von Baker et al. 2012 11 angemerkt, kann die Wirksamkeit der AWF Extraktion zu verbessern und kann eine mechanische Beschädigung der durch übermäßige Faltung und Verdichtung verursacht Blattspreite minimieren. Weiterhin ist die Verwendung von Parafilm verbessert die Visualisierung des Blattes nach der Zentrifugation bei sollte das Blatt auf Beschädigungen und Vollständigkeit der AWF Extraktions untersuchen.
Nouchi 12 beschreiben die Optimierung der AWF Erholung von geschnittenen Reisblattstücke, die difficult zu infiltrieren und erfordern höhere Zentrifugiergeschwindigkeiten AWF wegen ihrer kleinen Stomata Öffnungen zu sammeln. Verbesserte Benetzung des Reisblattoberfläche, entweder durch Voreinweichen der Blätter in destilliertem Wasser oder die Zugabe eines Tensids zu der Tränkflüssigkeit, erleichtert das Infiltrationsverfahren. Eine höhere Zentrifugationsgeschwindigkeit (6000 xg) wurde auch verwendet, während der Überwachung für Kontamination apoplastischen 12. Während Einzelblattstücke gibt es immer die Gefahr, daß cytoplasmatische Kontamination werden häufiger auch bei intensivem Waschen der Wundstellen; Schnitt Blätter sollte daher nur bei Bedarf verwendet werden.
Für viele Studien von destilliertem Wasser als Tränkflüssigkeit 11 verwendet wird. Jedoch können Verbindungen zur Tränkflüssigkeit wie Salze oder Puffer zugegeben werden, um die Extraktion bestimmter apoplastischen Verbindungen, insbesondere Proteinen, 13 zu verbessern. Lohaus 14 untersuchten die Wirkung der Ionenstärke und des osmotischen on die Zusammensetzung des zurückgewonnenen AWF und fanden sie zu vernachlässigen. Änderungen des pH der Infiltrationsmedium kann jedoch die AWF Zusammensetzung 14 beeinflussen.
Die richtige Handhabung und Lagerung der extrahierten apoplastischen Flüssigkeit ist wichtig. AWF ist gezeigt worden, um eine Fülle von Proteasen und anderen Enzymen 13,20 sowie flüchtige organische Verbindungen enthalten. Deshalb, um Veränderungen in der Zusammensetzung der AWF nach der Wiederherstellung ist es empfehlenswert, Proben auf Eis oder auf andere Weise bei -80 ° C gelagert zu halten reduzieren. Weiterhin sollte enzymatischen Assays AWF sobald wie möglich durchgeführt werden nach der Extraktion zu Enzyminaktivierung durch Proteolyse verlängerte Verdünnungs begrenzen oder Gefrieren-Auftauen.
Das Verfahren der Infiltration verdünnt das apoplastischen Fluid und es ist oft notwendig, das Ausmaß dieser Verdünnung zu bestimmen. Der Zentrifugationsschritt kann auch verdünnt das AWF mit Wasser aus intrazellulären Kompartimenten. Ein Verdünnungsfaktor mussed, um in vivo Apoplast chemischen Konzentrationen schätzen, wenn Messungen an AWF gemacht. Ein Verdünnungsfaktor ist es auch notwendig AWF wieder vollzählig konzentriert ein, wenn er als Apoplast imitiert Wachstumsmedium für Mikroben - so passend in vivo Metabolitkonzentrationen so genau wie möglich. Mehrere Variationen existiert auf dem in Schritt 4 zur Bestimmung der AWF Verdünnungsfaktor durch Messung der Verdünnung einer Markerverbindung zur Tränkflüssigkeit zugegeben beschriebenen Verfahrens. Für alle Verfahren der AWF Verdünnung Berechnung davon aus, dass die Infiltrationsflüssigkeit nicht merklich absorbiert oder durch die Blattzellen während der AWF Recovery-Prozess verdünnt. Diese Annahme wurde zuvor für die Infiltrationsschritt 14 überprüft, sondern für den Zentrifugationsschritt ungeprüft. Die Markerverbindung muss auch nicht absorbiert werden, transportiert oder geändert wird, während im Apoplasten. Indigokarmin ist die am weitesten verbreitete und gründlich von Farbstoffen verwendet, getestetfür AWF Verdünnung Berechnungen. Indigokarmin zeigt eine geringe Absorption zu Kationenaustauscherharz von isolierten Zellwände und wurde als geeignet für AWF Berechnungen in Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum und Glycine max 11,21,22 sein. Doch in einigen Blatttypen, zum Beispiel Reis und Gurken, Indigokarmin schien nicht vollständig nach der Infiltration, die zu einer Unterschätzung der AWF Verdünnungsfaktor 12,21 führen würde wiederhergestellt werden. Das Fehlen von Rückgewinnungs Indigokarmin kann darauf zurückzuführen sein, ihre Anfälligkeit in Isatin Sulfonat von Superoxid 23, der bekanntlich in den Apoplasten hergestellt werden, insbesondere unter Stress 24 Spaltung. Spaltung Indigokarmin in Isatin sulfonat führt zu einem Verlust der Absorption bei 610 nm und einer Zunahme bei 245 nm zur Folge. Ob diese Reaktion in nennenswertem Umfang in den Apoplasten auftritt, oder ob diese Reaktion durch die Zugabe von Superoxid-Fänger zu Infiltrat gehemmt werdenIonenflüssigkeit wurde bisher nicht untersucht worden. Blaudextran wurde statt Indigokarmin zur Quantifizierung der AWF Verdünnungsfaktor in Reis eingesetzt Blätter 12, wenn ihre Stabilität und Erholung der AWF wurde nicht berichtet. Alternativ können radioaktiv markierte Verbindungen, wie [14 C] Sorbit oder anderen quantifizierbaren internen Standards anstelle von Farbstoffen und die Abnahme der Radioaktivität oder der Konzentration gemessen und verwendet, um den Verdünnungsfaktor in analoger Weise 11,14,25 Berechnung verwendet werden.
Grenzen der Technik
Ein paar Einschränkungen gibt es für die Infiltration-Zentrifugation AWF Isolierungsmethode. Erstens kann die Verdünnung des Apoplasten während der Infiltration eine Antwort von der Pflanze hervorzurufen. Wenn die umgebenden Blattzellen erkennen eine verminderte Konzentration für bestimmte Komponenten des apoplastischen Fluid können sie durch Ausscheidung weiteren Metaboliten Verzerrung der Auslegung Metabolitkonzentrationen reagieren. Ineine Beurteilung dieses Problems wurde festgestellt, dass weder die Zeit zwischen dem Eindringen und Zentrifugation noch moderate Unterschiede in der Ionenstärke der Tränkflüssigkeit beeinflußt die Zusammensetzung des extrahierten AWF 14,22. Daher werden alle Artefakte Apoplasten Verdünnung gedacht werden, um resultierende minimal sein.
Ein zweiter möglicher Nachteil ist, dass die Elution der AWF durch Zentrifugation nicht alle im Apoplasten mehreren Gründen vorhandenen Moleküle nicht erfassen. Einige Verbindungen, insbesondere Kationen und Proteine können dicht mit der negativ geladenen Zellwand assoziiert und nicht mit dem AWF 13 eluieren. Andere Moleküle, wie Proteine ist möglicherweise zu groß, um effizient aus den Apoplasten zu den Zentrifugiergeschwindigkeiten verwendet 14 eluieren. Reaktive Sauerstoffspezies sind eine wichtige Klasse von Verbindungen in den Apoplasten erzeugt, aber aufgrund der kurzlebigen Natur dieser Verbindungen, und nicht näher Anforderungen für ihre Herstellung, ihre prEsence ist nicht gut von AWF Extraktion eingefangen. Es ist nicht bekannt, wie genau AWF stellt die in vivo Zusammensetzung Apoplasten Fluid und dies kann zwischen Spezies variieren.
Mehrere Tests bestehen, um zytoplasmatische Kontamination festzustellen, obwohl keiner sind allgemein akzeptiert. Assays von überwiegend cytoplasmatischen Enzymen (zB G6PDH, Hexose-Phosphat-Isomerase, MDH) haben den Vorteil, dass sie leicht durchführen, kann aber nicht gut mit cytoplasmatischen Leck 14,18 korrelieren. Die Beurteilung der zytoplasmatischen Metaboliten (zB Hexose Phosphate, Chlorophyll) ist vielleicht bezeichnend, aber weniger gut untersucht 11. Dennoch können beide Arten von Assay nützlich für relative Quantifizierung apoplastischen Kontamination zwischen den Proben sein. Idealerweise sollten mehrere unabhängige Messungen verwendet werden, um die Integrität der AWF Probe validieren.
Zwar erkennt seine Grenzen, die Infiltration-centrifugatihier beschriebene Technik bleibt eine einfache und robuste Technik, die in der Studie der apoplastischen Proteine, primäre und sekundäre Metaboliten und anorganischen Ionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eppendorf Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| 60 ml syringe | Becton Dickinson | 300865 | |
| 20 ml syringe | Becton Dickinson | 300613 | |
| 4 inch parafilm | Bemis | PM-996 | |
| side arm flask | SciLabware | 12972831 | |
| vacuum source | |||
| 5 ml pipette tips | Fisher | 50-813-28 | |
| centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 369702 | |
| indigo carmine | Sigma | I8130 | |
| microplate reader | Tecan | Infinite 200 | |
| 96 well plates | Becton Dickinson | 353072 | |
| freeze dryer | SciQuip | Christ Alpha 2-4 LD | |
| microcentrifuge | biorad | 166-0612EDU | |
| oxaloacetic acid | Sigma | O4126 | |
| D-glucose-6-phosphate | Sigma | G7250 | |
| NADH | Roche | 10128023001 | |
| MDH assay kit | Biovision | K654-100 | |
| G6PDH assay kit | Sigma | MAK015-1KT | |
| G-6-P assay kit | Biovision | K657-100 | |
| ribitol | Sigma | A5502 | |
| methanol | Sigma | 650471 | |
| chloroform | Sigma | 472476 | |
| vacuum concentrator | Thermor Scientific | SC250EXP | |
| methoxyamine hydrochloride | Sigma | 226904 | |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide | Sigma | 394866 |
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