Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

מספר גדול של חלבונים יונקים הם שונה במידה רבה על ידי הפעולה של אנזימים הבאים הסינתזה של חלבונים על ידי הריבוזום. שינויים אלה לאחר translational (PTMs) יכולים להגדיל באופן משמעותי את המגוון הפונקציונלי של proteome על ידי שינוי הגודל, מטען, מבנה, ומדינת oligomerization (בין תכונות אחרות) של חלבוני 1-3. כתוצאה מכך, השינוי במבנה חלבון יכול להוביל לתוצאות פיסיולוגיות, כגון פירוק חלבונים, התמיינות תאים, איתות, אפנון בביטוי גנים, ואינטראקציות בין חלבונים. בעוד שינויים אלה נפוצים באחוז גדול של כל החלבונים האנושיים, המסוף מסתיים בחלבוני היסטון לעבור מספר גבוה מרגיל של שינויים קוולנטיים 4. חלבוני היסטון הם משפחה של חלבונים מבניים המאפשרים העיבוי של הדנ"א הגנומי. שינויים קוולנטיים של זנבות היסטון לא מובנים מתבצעים ומוסדרים על ידי סרייהשל אנזימים שיכולים לזרז את השינוי קוולנטיים של שאריות (סופרים), להפוך את אותם שינויים (מחקים), ולהבחין בין השינויים שהוטבעו על זנבות היסטון (קוראים) 5-7. למעשה, רוב PTMs הידוע ניתן לצפות בקטע קצר זה של היסטון כולל מתילציה, זירחון, acetylation, sumoylation, ubiquitination, וcitrullination 8.

Citrullination כולל ההמרה של peptidyl-ארגינין לRNA t הלא peptidyl-Citrulline המקודד (איור 1 א). החלבונים, אחראים לנטרול שרשרת צד זה, הנם החלק מPAD (עמ 'eptide rginine ד eiminase) משפחת חלבונים, אשר כולם אנזימי סידן תלוי. 9,10. עד כה, חמישה בני משפחת PAD תוארו (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, וPAD6). כל אחד ממשפחה זו מופיעה למקד חלבונים תאיים שונים ומציג גם חדפרופילי הפצת רקמת que. PAD4 הוא החבר היחיד של משפחת חלבון זה ידוע להיות מקומי בתוך הגרעין באמצעות רצף לוקליזציה גרעיני 11. בהתאם לכך, זה הוכח deiminate מספר יעדי גרעין, כוללים שרשרות צד ארגינין על זנבות N- מסוף שאריות ארגינין H2A ההיסטונים 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, וH3R26) וH4 (H4R3) 12, 13. בעוד כל אחד מisozymes PAD יש פונקציות פיסיולוגיות ספציפיות וקריטיות, PAD4 קיבל הרבה יותר תשומת לב בשל תפקידה במספר התהליכים האנושיים בשני תאים חולים ובריאים. לאחרונה, PAD4 הוצג להיות חבר ברשת תעתיק pluripotency 14. שני רמות ביטוי PAD4 והפעילות הוצגו להיות גבוהות במצבי pluripotent תכנות מחדש וקרקע מדינה בעכברים. על ידי שליטה על הרגולציה של גנים בתאי גזע, PAD4 עשוי לשמור תפקיד מרכזי ביעילות תכנות מחדש של תאים. PAD4 גם היה מעורב בהיווצרות מלכודות תאי נויטרופילים, שעל הכריכה של פתוגנים לאפשר פינוי המערכת שלהם. Hypercitrullination של חלבוני היסטון ידי PAD4 גורם decondensation של הכרומטין, המשמש כחומר הבסיס לאנקפסולציה של חיידקים פתוגניים במלכודת תאית, ובכך לבלום את זיהומים חיידקיים 15,16.

בנוסף, PAD4 כבר נמצא לשחק תפקיד פעיל במספר המחלות בבני אדם. זה הוכח בעבר שביטוי חריג של PAD4 קשור עם תחילת וחומרת דלקת מפרקים שגרונית, מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, טרשת נפוצה 17. למעשה, הנוכחות של נוגדני חלבון אנטי-citrullinated היא אחד מהסמנים דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים אמינות והמקיפים ביותר של דלקת מפרקים שגרונית 18. כמו כן, פעילות PAD4 dysregulated לאחרונה נצפתה במספר סוגים של סרטן אנושי כוללים השחלות, שד, ריאות,סרטן הוושט ד 19-22. הקשר בין PAD4 והסרטן הוכח להיות מתווך דרך אונקוגן ELK1 או באמצעות החלבון המדכא גידולי p53 22,23 ועבודה קודמת הציעה כי PAD4 יכול להיות יעד נגד סרטן רומן טיפולי 17,24,25. כהוכחה למחקר עיקרון, הדלדול של PAD4 באמצעות shRNA בשורת תאי סרטן המעי הגס HCT116 התגלה כמספיק לגרימת אפופטוזיס ומחזור תא מעצר 26. מעכב PAD4 בלתי הפיך שפותח לאחרונה הביא להפחתת שבעים אחוז במסת גידול בעכברי 27. די להפליא, עיכוב PAD4 הופיע לפעול כטיפול ממוקד שגרם להריגתם בררני של תאים סרטניים מבלי לפגוע בתאי untransformed.

השימוש במולקולות קטנות כדי לכבות את הפונקציה של PAD4 עשויים להיות אסטרטגיה חדשה וחזקה למקד תאים סרטניים או כדי להגדיל chemotherapeutics הסרטן קיים 28. לרוע המזל, ת.ד.מעכב PAD4 הפיך אוהל שעדיין לא התגלה. מספר המעכבים קוולנטיים פותחו באמצעות לורו / ידית imidine fluoro המחקה את מצע ארגינין 27,29,30 והוכיחה להיות כלים מעשיים להבנת תפקידו של PAD4 בשני תאי מצב בריאים וחולים. עם זאת, מולקולות אלה כל הרפידות הפעילים עם עוצמה דומה לעכב. לכן, הצורך בassay קליל שמדווח על הפעילות של PAD4 הוא קריטי. עד כה, PAD4 מבחני תוארו המקשרים השחרור של אמוניה מהתגובה לקריאת colorimetric 31, לנצל אנלוגי מצע chloroamidine שכותרתו fluorescently עבור assay קיטוב הקרינה 32, להסתמך על התגובה בסיוע החומצה בין glyoxal וCitrulline 33, ו כמה פעילות PAD4 לקרינת dequenching צעד 34. מבין אלה, רק אסטרטגית haloacetamidine משנה קוולנטיים הוכיחה להיות תואם עם scre תפוקה גבוההפלטפורמות ening 32,35,36. אנו מתארים assay המבוסס הקרינה קלילה שאמינים מודד את הפעילות של PAD4. Assay, אשר מציג יחס חזק אות לרעש, מהירות של ניתוח, ואת חוסן של מדידה, יש את הפוטנציאל לגלות מעכב PAD4 באמת חזק ובררני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 טרנספורמציה, ביטוי, וטיהור

  1. לשינוי PAD4, להפוך את הפלסמיד pGEX מכיל היתוך GST PAD4 לא כימי המוסמך תאי coli (BL21 (DE3)) לביטוי חלבון באמצעות ההליך הבא. הכן (סידן כלורי) כימי המוסמך E. תאי coli (BL21 (DE3)) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
    1. הפשירי 50 μl של BL21 כימי המוסמך שהוכן קודם לכן (DE3) תאים על קרח ולערבב עם 1 μl של פלסמיד המכיל גן pGEX PAD4 בצינור תרבות 5 מיליליטר. דגירה את התערובת על קרח למשך 10 דקות תוך רעד כל 2 דקות בעדינות.
    2. Heat Shock התאים על ידי הצבת את התערובת באמבט מים 42 מעלות צלזיוס במשך 40 שניות. מייד מניח את תערובת התא-פלסמיד חזרה על קרח במשך 2 דקות, כדי לאפשר לתאים להתאושש. הוסף 1 מיליליטר של מרק LB סטרילי לתערובת ומניח על קרח 1 דקות.
    3. דגירה חום הלם תאים על 37 מעלות צלזיוס, הרועדת ב 250 סל"ד 1שעות. פיפטה 75 μl של התאים הופכים על צלחת אגר עמידה אמפיצילין ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות. צלחת חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. ביטוי PAD4.
    1. פיק מושבה 1 של BL21 תאים (DE3) מהצלחת אגר אמפיצילין והמקום ב 5 מיליליטר של LB המכיל אמפיצילין 1x. מקום חממה ולנער O / N על 37 מעלות צלזיוס.
    2. העברת 5 מיליליטר של LB (מתנע) ל1 ליטר של LB סטרילי המכיל trihydrate אמפיצילין 1x (MW 403.45 g / mol). צמיחה במקום רועד חממת 37 מעלות צלזיוס. צג OD 600 של הצמיחה. כאשר צמיחה מגיעה OD של 600 0.3, להעביר צמיחה ל- 16 מעלות צלזיוס רועדות חממה.
    3. עם הגיע OD 600 של 0.6, משרה את התאים עם 0.3 isopropylthiagalactoside מ"מ (IPTG, ז MW 238.30 / mol). אפשר תאים לנער במשך 15 שעות על 16 מעלות צלזיוס.
    4. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב4,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. יוצקים את supernatant וגלול חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  3. טיהור PAD4
    1. מחדש להשעות את גלולה המכילה את PAD4 בא לידי ביטוי בBL21 (DE3) תאים במאגר של 50 מ"מ NaCl (MW 58.44 g / mol), 300 מ"מ לאא 2 PO 4 (MW 119.98 g / mol), 10 מ"מ Imidazole (MW 68.077 ז /, 0.1 פלואוריד phenylmethylsulfonyl מ"מ (PMSF, MW 174.94 g / mol) וdithiothreitol 1 מ"מ (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0 mol).
    2. Lyse התאים באמצעות sonication במשך 15 דקות ב 4 ° C. בעקבות sonication, צנטריפוגה lysate התא ב20,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. יוצקים את ולשמור supernatant. אצווה supernatant עם חרוזים agarose גלוטתיון (GSH) למשך 30 דקות ב RT.
    3. מסננים supernatant מGST חרוזים / טור באמצעות כוח משיכה. לשטוף חרוזים עם 4 x 25 מיליליטר של 1x PBS (בופר פוספט, pH = 8.0) בשעה RT.
    4. Elute PAD4 עם 2 x 10 מיליליטר חיץ elution, aminomethane 50 טריס מ"מ (hydroxymethyl) (טריס בסיס, MW 121.14 g / mol), 10 גלוטתיון מ"מ (GSH, ז MW 307.32 / mol), pH = 8.0.
    5. להתרכז PAD4 באמצעות חיתוך o 100k MWצינורות ff צנטריפוגה ו צנטריפוגות ב XG 4,000 במשך 20 דקות ב 4 ° C. חלבון Aliquot לכרכי μl 200 ב1.0 מיליליטר צינורות microcentrifuge ולאחסן ב -80 ° C.

2. פתרונות מניות הכנה לחוצצים

  1. לשקול את נתרן כלורי (NaCl, MW 58.44 g / mol) ולהכין פתרון 2 M. מערבבים פתרון עד ברור.
  2. לשקול את aminomethane טריס (hydroxymethyl) (טריס בסיס, MW 121.14 g / mol) ולהכין 2 M פתרון, pH = 8.0. מערבבים פתרון עד ברור.
  3. לשקול את dihydrate סידן כלורי (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) ולהכין פתרון מ"מ 500. מערבבים פתרון עד ברור.
  4. לשקול את phosphine טריס (2-carboxyethyl) (ז TCEP, MW 250.19 / mol) ולהכין פתרון 200 מ"מ. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C.
  5. לשקול את dithiothreitol (DTT, MW 154.25 g / mol) ולהכין פתרון 1 M. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C.
  6. הכןפתרון 0.5% טריטון X-100.
  7. לשקול את חומצת ethylenediaminetetraacetic (ז EDTA, MW 292.24 / mol) ולהכין פתרון 100 מ"מ. מערבבים פתרון עד ברור.
  8. לשקול את Z- Arg- Arg- 7- amido- 4 methylcoumarin hydrochloride (ז ZRcoum, MW 621.69 / mol) ולהכין פתרון 10 מ"מ בsulfoxide דימתיל (DMSO).

3. PAD4 Assay על 37 מעלות צלזיוס

  1. החל מ- 10 מניות מ"מ ZRcoum, להכין פתרון 125 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 125 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון
  2. הכן חיץ של 62.5 מ"מ NaCl, 62.5 מ"מ טריס, 12.5 מ"מ CaCl 2, 6.25 מ"מ DTT, ו -5 PAD4 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב '
  3. הכן חיץ של 62.5 מ"מ NaCl, 62.5 מ"מ טריס, 12.5 מ"מ CaCl 2, ו -6.25 מ"מ DTT (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג
  4. לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ"ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד בהיר ולאחסן ב -20מעלות צלזיוס. זה יהיה הפתרון ד
  5. להשיג צלחת 96-היטב ולייעד מספר הבארות לביקורת (לא PAD4) ובארות (+ PAD4).
  6. פיפטה μl 160 של התמיסה B לבארות ופיפטה μl 160 של הפתרון C לתוך בארות שליטה. דגירה במשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  7. פיפטה 40 μl של פתרון לכל הבארות ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  8. פיפטה 10 μl של DH 2 O למחצית מבארות השליטה ומחצית מהבארות. למחצית השנייה של בארות שליטה ובקרת מבחן, פיפטה 10 μl של פתרון ד דגירה של 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
  9. להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר.

4. PAD4 Assay ב RT

  1. החל מ- 10 מניות מ"מ ZRcoum, להכין פתרון 50 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון ZRcoum 50 מיקרומטר זה יהיה א הפתרון
  2. הכן מאגר של 100 מ"מ NaCl, 100 מ"מ טריס, 20 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ TCEP, 0.02%-100 X, ו- 8 PAD4 מיקרומטר טריטון (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב '
  3. הכן מאגר של 100 מ"מ NaCl, 100 מ"מ טריס, 20 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ TCEP, ושל 0.02% טריטון X-100 (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג
  4. לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ"ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ד
  5. להשיג צלחת 384 גם ולייעד בארות לביקורת (לא PAD4) ובארות (+ PAD4).
  6. פיפטה 25 μl של התמיסה B לבארות ופיפטה 25 μl של הפתרון C לתוך בארות שליטה. לאפשר חיץ עם / בלי PAD4 כדי לדגור בבארות עבור 20 דקות ב RT.
  7. 25 μl פיפטה של ​​הפתרון C לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT.
  8. פיפטה 10 μl של DH 2 O למחצית מבארות השליטה ומחצית מהבארות. למחצית השנייה של בארות שליטה ובקרת מבחן, pipettדואר 10 μl של פתרון ד לדגור על RT במשך 10 דקות.
  9. להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר.

5. מבחני קורס זמן PAD4 על 37 מעלות צלזיוס וRT

  1. החל מ- 10 מניות מ"מ ZRcoum, להכין פתרון 125 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 125 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון
  2. הכן חיץ של 62.5 מ"מ NaCl, 62.5 מ"מ טריס, 12.5 מ"מ CaCl 2, 6.25 מ"מ DTT, ו -5 PAD4 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב '
  3. לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ"ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ג
  4. להשיג 2 96-גם צלחות וpipet 160 μl של התמיסה B ל# סכום של בארות (# בארות יהיו תלויים בכמה נקודות זמן).
  5. דגירה צלחת 96-היטב אחד על 37 מעלות צלזיוס. דגירה את הצלחת גם 96 האחרות ב RT.
  6. פְּעִיםette 40 μl של פתרון לכל הבארות בשני 96-גם צלחות ומייד פיפטה 10 μl של הפתרון C לתוך בארות t = 0 דקות. להמשיך ולהוסיף 10 μl של הפתרון C בנקודות זמן ספציפי, עד שכל הבארות כבר הרווה.
  7. להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר.

6. PAD4 העיכוב Assay ב RT

  1. החל מ- 10 מניות מ"מ ZRcoum, להכין פתרון 83 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון ZRcoum 83 מיקרומטר זה יהיה א הפתרון
  2. לשקול את CL-amidine (MW 424.8 g / mol) ולהכין פתרון מניות 100 מיקרומטר. זה יהיה פתרון ב '
  3. הכן מאגר של 100 מ"מ NaCl, 100 מ"מ טריס, 20 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ TCEP, 0.02% Triton X-100, וPAD4 8 מיקרומטר (pH = 8.0). זה יהיה הפתרון ג
  4. הכן מאגר של 100 מ"מ NaCl, 100 מ"מ טריס, 20 מ"מ CaCl 2, 2 מ"מ TCEP, ושל 0.02% טריטון X-100 (pH = 8.0). ההוא יהיה הפתרון ד
  5. לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ"ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון E.
  6. להשיג צלחת 384 גם ולייעד בארות לביקורת (לא PAD4), בארות (+ PAD4), ובארות עיכוב (PAD4 + CL-amidine).
  7. פיפטה 25 μl של הפתרון C לבארות ופיפטה 25 μl של הפתרון D לתוך בארות שליטה. לאפשר חיץ עם / בלי PAD4 כדי לדגור בבארות עבור 20 דקות ב RT.
  8. פיפטה 10 μl של התמיסה B לתוך בארות עיכוב דגירה במשך 20 דקות ב RTE.
  9. 15 μl פיפטה של ​​פתרון לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT.
  10. פיפטה 10 μl של פתרון ה 'לכל הבארות. לדגור על RT במשך 10 דקות.
  11. להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר.

7. תא גולמי lysate Assayב RT

  1. לאחר קצירת תאים מPAD4 צמיחת L 1, תאים גלולים ב 10 מיליליטר של 50 מ"מ טריס, 50 מ"מ NaCl, 0.1 פלואוריד מ"מ phenylmethylsulfonyl (PMSF, MW 174.94 g / mol) וdithiothreitol 1 מ"מ (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0.
  2. Lyse התאים באמצעות sonication במשך 15 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגה lysate התא ב20,000 XG במשך 20 דקות ב 0 מעלות צלזיוס. להתרכז supernatant ברור למחצית הנפח על ידי צנטריפוגה בסל"ד 4,000 4 ° C באמצעות 100k MW צינורות צנטריפוגה חתוך.
  3. החל מ- 10 מניות מ"מ ZRcoum, להכין פתרון 250 מיקרומטר של ZRcoum במים. פתרון 250 מיקרומטר ZRcoum זה יהיה א הפתרון
  4. הכן מאגר של 100 מ"מ NaCl, 100 מ"מ טריס, 20 מ"מ CaCl 2, ו -2 מ"מ TCEP (pH = 8.0). זה יהיה פתרון ב '
  5. לשקול את טריפסין, גבישים (מלבלב שור) ולהכין 10 מ"ג / מיליליטר ב100 mM EDTA. מערבבים פתרון עד ברור ולאחסן ב -20 ° C. זה יהיה הפתרון ג
  6. להשיג צלחת 384 גם שחורה ועיצובאכלתי בארות לביקורת (לא lysate תא) ובארות (+ lysate תא).
  7. פיפטה של ​​התמיסה B 100 μl לכל הבארות ו -60 μl פיפטה של ​​lysate תא לתוך בארות. דגירה של 20 דקות ב RT.
  8. 40 μl פיפטה של ​​פתרון לכל בארות דגירה במשך 45 דקות ב RT.
  9. פיפטה 10 μl של הפתרון C לכל הבארות. לדגור על RT במשך 10 דקות.
  10. להשיג הקרינה קריאה על קורא multimodal עם גל עירור של 345 ננומטר ואורך גל פליטה של ​​465 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בתחילה, זה היה הוכיח כי ZRcoum יכול לדווח על הפעילות של PAD4 בפורמט צלחת 96-היטב. ולס הודגרו עם ZRcoum המצע ובנוכחות / ההיעדרות של PAD4. בעקבות תקופת דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, הקרינה נמדדה עם 340/40 - 475/15 ננומטר מסנן (איור 2 א). כצפוי, רמות הקרינה נשארות נמוכות כמו fluorophore בתוך ZRcoum (או ZRcoum citrullinated) נשארו במצב הנעול. עם התוספת של טריפסין העודף / EDTA לפתרון, fluorophores היו משוחררת מZRcoum אבל נשארה בעיקר ללא שינוי בנוכחות PAD4. התוספת של EDTA נועדה לסייע בהפסקת תגובת PAD4 בשל יכולתו Chelate יוני סידן החיוני. מתוך נתונים אלה, ירידה 5.2 של פי פלט הקרינה נצפתה בנוכחות PAD4. בשלב הבא, compatibility של assay החדש שפותח עם פלטפורמות הקרנת תפוקה גבוהה הודגם. זה היה עניין העיקרי לנתח ארבעה משתני תגובה שיהיו טוב ביותר עבור הקרנת מטרות (1) מזעור נוסף של נפח assay (2) האפשרות לביצוע assay ב RT (3) היציבות של תערובת החלבונים וחיץ לפני שסיימתי את assay ו- (4) ההפרעה האפשרית של ממסים / חומרי ניקוי אורגניים.

לאמצע או מאמצי הקרנת תפוקה גבוהה, צלחות גם בצפיפות גבוהה נמצאות בשימוש נרחב במסכי מולקולה קטנים. זה אומת כי assay ניתן לבצע כמעט זהה בצלחת 384 גם בהשוואה לצלחת 96-היטב (איור 2). בקביעה נוספת תנאי העבודה עבור assay בפורמט תפוקה גבוהה, זה היה חשוב לבדוק האם פעילות PAD4 יכולה להיות במעקב במסגרת זמן סביר על RT. מכיוון שלא כל מכשירי טיפול בנוזלבקר טמפרטורה, זה יכול להיות מסורבל ויקר שיש שלב דגירה בטמפרטורה גבוהה. יתר על כן, טיפול חשבונאי בתנודות בטמפרטורה יכול להיות סיבה לפער בין צלחות וריצות. על מנת לקבוע את ההשפעה של טמפרטורות נמוכות יותר עבור assay שתואר כאן, assay דומה בוצע ב RT. נמצא כי האותות היו כמעט ללא שינוי בין 37 ° C ו RT (איור 3). כדי למטב את ביצועי assay עוד יותר על ידי צמצום זמן דגירה הנדרש בין PAD4 ואת המצע, קינטיקה של התגובה נותחה. פעילות PAD4 הייתה פיקוח לאורך הזמן הן בRT ו- 37 ° C. כצפוי, נראה כי PAD4 הוא פעיל יותר ב- C ° 37 (עולה בקנה אחד עם טמפרטורה פיזיולוגית אנושית) עם התגובה בעיקר מלאה של 20 דקות. באופן משביע רצון, התגובה אינה מושפעת במידה רבה מהירידה בטמפרטורה עד לRT. התגובה ממשיכה כבמחצית מהירות כבגבוה טמפרטורה והוא למעשה שלאחר אתחול, 40-45 דקות שלמות. מרגע כמובן ניתוחים, קבוע קינטיקה חושבו והפרמטרים (K M = 397 מיקרומטר, k cat = 2.98 שניות -1, k חתול / M = 7,400 שניות k -1 M -1) נמצאו דומה לPAD4 האחר מצעים. ביום 31 בעם קינטיקה של התגובה המאופיינת, כל מבחני שלאחר מכן הופחתו לשעה 1 מההתחלה ועד לנקודת המדידה.

בשלב הבא, יציבות של PAD4 הוערכה כאשר הם מומסים במאגר התגובה על פני תקופה ממושכת של זמן. באופן מעשי, הקרנת תפוקה גבוהה תדרוש ריאגנטים להיות יציב בדרך כלל במשך שעות רבות ואילו המכשיר משלים את המסך. אם יש לי ריאגנטים מסוימים חיי מדף יחסי של דקות, זה יכול להיות די יקר וזמן רב כדי לסיים את המסך על מנת להכין את חומרים כימיים טריים. בהתאם לתנאי assay, זה לאיוצא דופן עבור כמה מבחני כדי להיות בקנה אחד עם הקרנה לשים דרך-גבוהה מסיבה זו ממש. עם הרעיון הזה בראש, יציבות PAD4 במאגר הייתה פיקוח על פני מספר שעות. כמעט ללא הפסד בפעילות האנזימטית נצפה לאורך תקופת הזמן, ובכך מצביע על כך שהחלבון הוא יציב גם לאחר שישב על RT במשך 15 שעות (איור 4 א). בשלב הבא, זה הוערך אם assay לפעול תחת תנאים ממוזערים ועל RT עדיין כראוי יגיב לנוכחות של PAD4. על הדגירה של המעכב הידוע PAD4, chloroamidine (CL-amidine), הוביל לשיקום של אות הקרינה עולה בקנה אחד עם העיכוב המלא של PAD4 (איור 4) מלא. לבסוף, היא גם וידאה שהנוכחות של ממס DMSO האורגני, שימוש נפוץ בפתרונות מניות של מולקולות קטנות, עד 3% כנפח סופי, לא התערבה בassay (מידע לא מוצג). כמו כן, התוספת של 0.01% טריטון X-100 הביאה simמגמות ilar הקרינה (מידע לא מוצג).

לאחר שהראה כי assay הוא סובלני למגוון רחב של תנאים, כי הם נתקלו בדרך כלל במאמצי גילוי תרופות מולקולות קטנים, סינון ראשוני של 80 תרכובות נערך וערך "חזק Z של 0.71 זוהה. בקידום הפוטנציאל של assay, הסלקטיביות של תגובת PAD4 / ZRcoum הודגשה על ידי ביצוע התגובה בlysates תא השלם הגולמי. E. קולי תאים המכילים את וקטור ביטוי GST-PAD4 היו מושרה עם IPTG, בדומה להליך המשמש לבידוד של GST-PAD4. בעקבות השיבוש של קרום התא באמצעות sonication, פסולת הסלולר הופרדה על ידי צנטריפוגה להרשות לעצמם lysate תא הבהיר. כאשר lysate התא המכיל PAD4 הוגש לאותם התנאים assay כassay GST-PAD4 המטוהר, אות הקרינה מגוונת בהסכם עם הנוכחות של PAD4 הפעיל בפתרון ( > איור 5). lysates התא מכיל מספר של Biomacromolecules בריכוזים גבוהים שעלולים להפריע לפעילות של PAD4, תכונות הניאון של ZRcoum, וצעד טריפסין. הממצא שassay היה פונקציונלי בתא lysates הגולמי מצביע על כך שיש סלקטיביות גבוהה בתגובה בין PAD4 וZRcoum. כדי להדגים עוד כי ירידת האות בנוכחות lysates תא הגולמי הייתה ספציפית לנוכחות של PAD4 הפעיל, ההשפעה של Cl-amidine, מעכב PAD4 קוולנטיים הוקם, הוערך. התוספת של Cl-amidine הובילה לשיקום באות הקרינה, עולה בקנה אחד עם איון של PAD4 (איור 5). יחד, זה הודגם assay ניתן לפשט עוד יותר על ידי שימוש בתא lysates הגולמי לניטור פעילות PAD4.

2114 / "width =" 52114fig1highres.jpg 600 "/>
איור 1. PAD4 והעיצוב של assay הקרינה המבוססת. (א) ייצוג Cartoon של מכלולי היסטון המרכיבים את היחידה הבסיסית של הנוקלאוזום. PAD4 מזרז citrullination של מספר שאריות ארגינין בחלבוני היסטון. (ב) ZRcoum ועליהן מצע הילידים (המוסתר לבהירות) של PAD4 (קוד הצטרפות 2DW5). ייצוג (C) של הצעדים בassay PAD4 טיפוסי. Citrullination ידי PAD4 של ZRcoum המצע מפחית את הרגישות שלו להידרוליזה אמיד בתיווך טריפסין, וכך גורם לשינוי ברמות הקרינה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

איור 2 assay 2. PAD4 איור בפורמטי צלחת 96-היטב ו384 גם. הקרינה נמדדה (עירור 345 ננומטר / פליטה 465 ננומטר) בשני תבנית 96, גם (א) ופורמט 384 גם (ב) לתנאים המיועדים (C ° 37). התוספת של טריפסין פרוטאז מובילה לעלייה גדולה ברמות הקרינה בבארות ללא PAD4 ונשארה כמעט ללא שינוי לבארות עם PAD4. הנתונים מוצגים כממוצעים + SD (n = 3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

איור 3
ניתוח כמובן 3. זמן דמותו של PAD4 assay. הקרינה נמדד (ננומטר 345 עירור / פליטה 465 ננומטר) מעת לעת בפורמט צלחת 96-היטב על דקות 70 עם החלבון שמודגרות גם ב 37מעלות צלזיוס (א) או ב RT (B). הנתונים מוצגים כממוצעים SD +/- (n = 3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

איור 4
איור 4. יציבות חלבון ועיכוב. () הפעילות של PAD4 נמדדו לאחר מרווחי זמן קבועים. לשם השוואה, רמת הקרינה מוצגת בהעדר PAD4. רמות הקרינה מוצגות לפני (אדום) והבא (ירוק) התוספת של טריפסין. (ב) מבוא של מעכב PAD4 הידוע CL-amidine (100 מיקרומטר) הוביל לשיקום של אות הקרינה בפורמט צלחת 384 גם ב RT. רמות הקרינה מוצגות לפני (אדום) והבא (ירוק) התוספת של טריפסין. כל הנתונים הם represented כממוצע SD +/- (n = 3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

איור 5
5. assay lysate תא גולמי איור. Assay בוצע בהיעדר והנוכחות של lysates תא גולמי בפורמט צלחת 384 גם ב RT. רמות הקרינה מוצגות לפני (אדום) והבא (ירוק) התוספת של טריפסין. CL-amidine (100 מיקרומטר) גם גרם לעלייה באות הקרינה בתנאים אלה. כל הנתונים מוצגים כממוצע SD +/- (n = 3). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

כימיה גיליון 93 PAD4 PADI4 citrullination ארגינין שינוי שלאחר translational HTS assay הקרינה Citrulline
ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter