Introduction
포유 동물 단백질의 다수 무겁게 리보솜에 의한 단백질의 생합성 다음 효소의 작용에 의해 변성된다. 이러한 번역 후 변형 (PTMS)는 크게 단백질 1-3 (다른 기능 사이)의 크기, 전하, 구조 및 올리고머 상태를 변경하여 프로테옴의 기능적 다양성을 증가시킬 수있다. 그 결과, 단백질 구조의 변화는 단백질 분해, 세포 분화, 시그널링, 유전자 발현의 조절, 및 단백질 - 단백질 상호 작용과 같은 생리 학적 결과로 이어질 수있다. 이러한 수정은 인간의 모든 단백질의 큰 비율에 널리 퍼져 있지만 히스톤 단백질이 공유 수정 4의 비정상적으로 높은 숫자를 받아야에 터미널이 종료됩니다. 히스톤 단백질은 게놈 DNA의 응축을 촉진 구조 단백질의 패밀리이다. 구조화되지 않은 히스톤 꼬리의 공유 수정 세리 의해 수행 및 규제, 잔류 (작가)의 공유 변형을 촉진 같은 수정 (지우개), 역 및 변경을 구별 할 수 효소의 S는 히스톤 꼬리 (독자) 5-7에 각인된다. 실제로, 공지 PTMS 대부분 메틸화, 인산화, 아세틸, sumoylation, 유비퀴틴 및 citrullination 8 포함한 히스톤이 짧은 세그먼트 내에서 관찰 할 수있다.
Citrullination는 비 t의 RNA 부호화 펩 티딜 - 시트룰린 (도 1a)에 펩 티딜 - 아르기닌의 변환을 수반한다. 이 측쇄 중화에 책임 단백질, PAD의 구성원 칼슘 의존적 효소이다 모두. 9,10이 단백질 군 (p는 rginine d를 eiminase eptide)를. 현재까지, 패드 가족의 다섯 멤버는 (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 및 PAD6)를 설명 하였다. 이 가족의 각 구성원은 별개의 세포 단백질을 대상으로 나타나고 또한 유니 표시가야 조직 분포 프로필. PAD4 핵 지역화 시퀀스 (11)를 통해 핵 내에서 지역화 된 것으로 알려진이 단백질 가족의 유일한 구성원입니다. 따라서,이 히스톤의 H2A 아르기닌 잔기 (3)의 N 말단 꼬리에서 아르기닌 측쇄 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 및 H3R26) 및 H4 (H4R3) (12)를 포함하여 핵 대상 번호를 deiminate 것으로 밝혀졌다, 13. PAD 동위 효소의 각 특정 중요한 생리 기능을 가지고 있지만, PAD4 인해 병에 걸린와 건강한 세포 모두에서 인간의 프로세스의 수의 역할에 훨씬 더 많은 관심을 받고있다. 최근 PAD4가 능성 전사 네트워크 (14)의 구성원이 될 것으로 나타났다. 두 PAD4 발현 수준과 활성 마우스에서 리 프로그래밍 및 접지 상태 능성 상태 동안 상승되는 것으로 도시 하였다. 줄기 세포 유전자의 조절을 제어함으로써, PAD4 세포 리 프로그래밍 효율의 중추적 인 역할을 유지할 수있다. PAD4도에 연루되었는지에 병원균의 결합 호중구 세포 트랩의 형성은 자신의 시스템 정리를 할 수 있습니다. PAD4 의한 히스톤 단백질의 hypercitrullination 따라서 세균 감염 15,16 떨어져 병동, 트랩에 의한 세포 외 병원균의 캡슐화 용 기재로서 기능 염색질의 decondensation을 유도한다.
또한 PAD4 인간 질병의 수가 활성 역할을하는 것으로 밝혀졌다. 것은 이미 PAD4의 비정상적 발현은 류마티스 관절염의 발병과 중증도와 연관되어 있음을 보여왔다, 알쯔하이머, 파킨슨 병 및 다발성 경화증 17. 실제로, 안티 - 시트룰린 단백질 항체의 존재는 류마티스 관절염 (18)의 가장 안전하고 확실한 진단 및 예후 바이오 마커이다. 마찬가지로, 조절 곤란 PAD4 활성은 최근 난소, 유방, 폐, 포함한 인간 암의 다수 관찰되었다D 식도암 19-22. PAD4과 암 사이의 링크는 p53 종양 억제 단백질 22, 23 ELK1 종양 유전자를 통해 또는 통해 매개되는 것으로 나타났다 이전 작업은 PAD4가 새로운 항암 치료 표적 17,24,25이 될 수 있다고 제안했다. 원리 연구의 증거로, 대장 암 세포주 HCT116에 shRNA를 통해 PAD4의 고갈은 세포 사멸과 세포주기 정지 (26)을 유도하기에 충분한 것으로 밝혀졌다. 최근에 개발 돌이킬 수 PAD4 억제제 쥐 27 종양 질량의 70 % 감소되었다. 아주 현저하게, PAD4 억제는 변형되지 않은 세포를 살려주는 동안 암 세포를 선택적으로 죽이는 결과 표적 치료의 역할을 한 것으로 보입니다.
PAD4의 기능을 해제하는 작은 분자의 사용은 암 세포를 대상으로 또는 기존의 암 화학 요법 (28)을 증가시키기 위해 강력하고 새로운 전략으로 증명할 수 있습니다. 불행하게도, 포십t 가역 PAD4 억제제는 아직 발견해야합니다. 공유 억제제의 수는 아르기닌 기판 27,29,30 모방 건강 및 질병 상태 모두에서 세포 PAD4의 역할을 이해하는데 실질적인 도구적일 수 클로로 / 플루오 imidine 핸들을 사용하여 개발되어왔다. 그러나, 이들 분자는 유사한 효능을 가진 활성 패드 모두 억제한다. 따라서 PAD4의 활성에 대해보고 용이 한 분석에 대한 필요성이 매우 중요하다. 현재까지 PAD4 분석법 비색 판독 31 반응으로부터 암모니아의 방출을 연결하는 설명되었지만, 형광 편광 분석법 (32) 형광 표지 chloroamidine 기질 유사체를 이용하는 글리 옥살과 시트룰린 (33) 사이의 산 - 보조 반응에 의존하고, 몇 단계 34 dequenching 형광에 PAD4 활동. 이들 중에서, 단지 공유 개질제 haloacetamidine 전략은 높은 처리량 scre와 호환되도록 입증개로 인한 플랫폼 32,35,36. 우리는 확실 PAD4의 활성을 측정 손쉬운 형광 계 분석을 설명한다. 강한 신호 대 잡음비, 분석 속도 및 측정의 견고성을 표시 분석은, 진정으로 강력하고 선택 PAD4 억제제를 발견 할 가능성이있다.
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Protocol
1. PAD4 변환, 발현, 및 정제
- PAD4 변환의 경우, 화학적으로 유능한 E. PAD4의 GST 융합을 포함하는 플라스미드를 pGEX 변환 다음 절차를 사용하여 단백질 발현 대장균 (BL21 (DE3)) 세포. 화학적 유능한 (염화 칼슘)를 준비 E. 표준 프로토콜에 따라 대장균 (BL21 (DE3)) 세포.
- 미리 제조 한 화학적 유능한 BL21 (DE3) 세포를 얼음에 50㎕의 해동 및 5 ㎖의 배양 관에 PAD4 유전자를 포함하는 플라스미드를 pGEX 1 μL와 혼합한다. 부드럽게 매 2 분 흔들어 섞으면 서 10 분 동안 얼음 혼합물을 품어.
- 열은 40 초 동안 42 ° C의 물을 용기에 혼합물을 배치하여 셀을 충격. 즉시 세포가 복구 할 수 있도록 2 분 동안 다시 얼음에 세포 플라스미드 혼합물을 배치합니다. 혼합물에 멸균 된 LB 액체 배지 1 ㎖를 추가하고 1 분 동안 얼음에 배치합니다.
- 1 250 rpm으로 흔들어, 37 ° C에서 세포 충격 열을 품어시간. 피펫 (75) 암피실린 내성 한천 접시에 형질 전환 세포의 μL, 15 시간 동안 37 ° C에서 품어. 4 ℃에서 보관 판.
- PAD4 식입니다.
- 1x를 앰피 실린을 함유하는 LB 5 ml의 암피실린 한천 플레이트와 장소에서 BL21 (DE3) 세포의 콜로니 하나를 선택. 인큐베이터에 넣어 37 ℃에서 O / N를 흔들.
- 1x를 암피실린 수화물을 함유하는 멸균 LB (MW 403.45 g / mol)를 1 L로 LB (스타터)의 5 ml의 전송. 37 ° C 진탕 배양기에 넣어 성장. 성장의 OD (600)를 모니터링합니다. 성장 (600) 0.3의 OD에 도달하면, 인큐베이터을 흔들어 16 ° C로 성장 이동합니다.
- OD 0.6 600 0.3 밀리미터 isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238.30 g / mol)을 가진 세포를 유도 도달하면. 세포가 16 ℃에서 15 시간 동안 흔들 수 있습니다.
- 0 ° C에서 20 분 동안 4,000 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. -80 ° C에서 상등액 및 저장 펠렛을 붓고.
- PAD4 정화
- 다시 일시의 50 mM의 NaCl (MW 58.44 g / 몰)의 버퍼에 세포를 BL21 (DE3)에서 발현 PAD4 함유 펠렛을 300 mM의의 NaH 2 PO 4 (MW 119.98 g / mol)을 10 mM의 이미 다졸 (MW 68.077 g / 몰), 0.1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, MW 174.94 g / mol) 및 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.25 g / 몰)의 pH = 8.0.
- 4 ° C에서 15 분 동안 초음파 처리를 통해를 Lyse은 세포. 초음파 처리 후, 0 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리. 붓고 및 상층 액을 저장합니다. 일괄 RT에서 30 분 동안 글루타치온 (GSH), 아가 로스 비드와 상청.
- 중력을 통해 GST 비즈 / 열에서 상층 액을 배출합니다. 실온에서 1X PBS (인산염 완충 식염수, pH는 8.0)의 4 × 25 ml로 구슬을 씻으십시오.
- 용출 PAD4 2 × 10 ml의 용출 버퍼와, 50 mM의 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스 자료, MW 121.14 g / mol)을 10 mM의 글루타치온 (GSH, MW 307.32 g / 몰), pH가 8.0.
- 10 만 MW 컷-O를 사용하여 PAD4을 집중FF 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 4 ° C에서 20 분 동안 4,000 XG에. -80 ° C에서 나누어지는 1.0 ml의 마이크로 원심 튜브에 200 μL의 볼륨으로 단백질 및 저장.
버퍼 2. 준비 원액
- 염화나트륨 (NaCl을, MW 58.44 g / 몰) 칭량하고 2 M 용액을 제조 하였다. 명확 때까지 솔루션을 섞는다.
- 트리스 (히드 록시 메틸) 아미노 메탄 (트리스 자료, MW 121.14 g / 몰) 밖으로 달아 = 8.0 2 M 용액의 pH를 준비합니다. 명확 때까지 솔루션을 섞는다.
- 염화칼슘 이수화 물 (CaCl2를 2H 2 O, MW 147.01 g / 몰) 칭량하고 500 mM의 용액을 조제. 명확 때까지 솔루션을 섞는다.
- 트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP, MW 250.19 g / 몰) 칭량하고 200 mM의 용액을 조제. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다.
- 디티 오 트레이 톨 (DTT, MW 154.25 g / 몰) 밖으로 무게와 1 M 용액을 제조. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다.
- 준비트리톤 X-100의 0.5 % 용액.
- 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, MW 292.24 g / 몰) 칭량하고 100 mM의 용액을 조제. 명확 때까지 솔루션을 섞는다.
- 염산염 (ZRcoum, MW 621.69 g / mol)의 methylcoumarin Z- Arg- Arg- 7- amido- 4-을 달아 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 10 mM의 용액을 조제.
37 ° C에서 3 PAD4 분석
- 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 125 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 125 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다
- 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 CaCl2를, 6.25 mM의 DTT의 버퍼, 5 μM의 PAD4 (PH = 8.0)를 준비합니다. 이 솔루션 B. 될 것입니다
- 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 염화칼슘 2, 6.25 mM의 DTT (PH = 8.0)의 버퍼를 준비합니다. 이 솔루션 C. 될 것입니다
- (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. 명확 때까지 솔루션을 혼합하고 -20 ℃에 저장° C. 이 솔루션 D.됩니다
- 96 웰 플레이트를 확보하고 컨트롤 우물의 수 (NO PAD4) 및 테스트 우물 (+ PAD4)를 지정합니다.
- 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 C의 160 μL에 솔루션 B의 160 μL. 37 ° C에서 15 분 동안 품어.
- 피펫 (40) 모든 우물에 솔루션의 μL와 45 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 테스트 우물의 제어 우물의 절반과 절반 dH보다 2 O의 피펫 10 μL. 대조군 웰 및 테스트 제어, 피펫 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션 D. 용액 10 μL의 다른 절반.
- 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다.
RT 4. PAD4 분석
- 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 50 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 50 μM의 ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다
- 100 mM의 나 버퍼를 준비CL, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100, 8 μM의 PAD4 (pH가 = 8.0). 이 솔루션 B. 될 것입니다
- 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100 (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 이 솔루션 C. 될 것입니다
- (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 D.됩니다
- 384 웰 플레이트를 취득 및 제어 (NO PAD4) 및 테스트 우물 (+ PAD4)에 대한 우물을 지정합니다.
- 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 C의 25 μL에 솔루션 B의 25 μL. 실온에서 20 분 동안 우물에서 부화 PAD4 / 없음 버퍼를 허용합니다.
- 모든 우물에 솔루션 C의 피펫 25 μL와 실온에서 45 분 동안 품어.
- 테스트 우물의 제어 우물의 절반과 절반 dH보다 2 O의 피펫 10 μL. 대조군 웰 및 테스트 제어의 다른 절반에 pipett실온에서 10 분 동안 솔루션 D. 품어의 전자 10 μL.
- 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다.
37 ° C 및 실온에서 5 PAD4 시간 코스 분석 실험
- 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 125 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 125 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다
- 62.5 mM의 NaCl을, 62.5 mM 트리스, 12.5 mM의 CaCl2를, 6.25 mM의 DTT의 버퍼, 5 μM의 PAD4 (PH = 8.0)를 준비합니다. 이 솔루션 B. 될 것입니다
- (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 C. 될 것입니다
- (얼마나 많은 시점에 따라 달라집니다 우물 #)이 96 웰 플레이트 및 피펫 우물 # 금액에 솔루션 B의 160 μl를 얻습니다.
- 37 ° C에서 한 96 웰 플레이트를 품어. RT에서 다른 96 웰 플레이트를 품어.
- 삐악 삐악 울다ette 즉시 (40) 모두 96 웰 플레이트의 모든 우물에 솔루션의 μL과는 t = 0 분 우물에 솔루션 C의 10 μl를 피펫. 모든 우물이 침묵 할 때까지 특정 시점에서 솔루션 C의 10 μl를 계속 추가합니다.
- 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다.
실온에서 6 PAD4 저해 분석
- 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 83 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 83 μM의 ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다
- 된 C1-아미 딘 (MW 424.8 g / 몰) 칭량하고 100 μM 스톡 용액을 준비한다. 이 솔루션 B. 될 것입니다
- 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100의 완충액, 8 μM의 PAD4 (하여 pH = 8.0)을 준비한다. 이 솔루션 C. 될 것입니다
- 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP, 0.02 % 트리톤 X-100 (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 목솔루션 D. 될 것입니다
- (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 E. 될 것입니다
- 384 웰 플레이트를 확보하고 컨트롤 우물 (NO PAD4), 시험 우물 (+ PAD4) 및 억제 우물 (PAD4 + CL-아미 딘)을 지정합니다.
- 피펫 테스트 우물과 피펫 제어 우물에 솔루션 D의 25 μL에 솔루션 C의 25 μL. 실온에서 20 분 동안 우물에서 부화 PAD4 / 없음 버퍼를 허용합니다.
- 억제의 우물에 솔루션 B의 피펫 10 μL 및 RTE에서 20 분 동안 품어.
- 모든 우물에 솔루션의 피펫 15 μL와 실온에서 45 분 동안 품어.
- 피펫 모든 우물에 솔루션 E의 10 μL. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션.
- 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다.
7. 원유 세포 용 해물 분석RT에서
- 50 mM 트리스, 50 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF, MW 174.94 g / mol) 및 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.25 g / mol)을, pH를 10 ㎖의 PAD4 1 L 성장에서 재현 탁 된 세포를 세포를 수확 한 후 = 8.0.
- 4 ° C에서 15 분 동안 초음파 처리를 통해를 Lyse은 세포. 0 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에서 세포 용 해물을 원심 분리기. 10 만 MW 차단 원심 분리기 튜브를 사용하여 4 ° C에서 4,000 rpm으로 원심 분리하여 절반 볼륨에 맑은 상층 액을 집중한다.
- 10 mM의 ZRcoum 재고에서 물에 ZRcoum의 250 μm의 솔루션을 준비합니다. 이 250 μM ZRcoum 솔루션은 솔루션 A. 될 것입니다
- 100 mM의 NaCl을, 100 mM 트리스, 20 mM의 CaCl2를, 2 mM의 TCEP (하여 pH = 8.0)의 버퍼를 준비한다. 이 솔루션 B. 될 것입니다
- (소의 췌장에서) 트립신, 결정을 달아 100 mM의 EDTA에서 10 ㎎ / ㎖를 준비합니다. -20 ° C에서 명확하고 저장까지 솔루션을 섞는다. 이 솔루션 C. 될 것입니다
- 블랙 384 웰 플레이트 및 설계를 얻컨트롤 (NO 세포 용 해물) 및 테스트 우물 (+ 세포 용 해물)에 대한 우물을 먹었다.
- 피펫 시험의 우물에 모든 우물과 세포 용 해물의 피펫 60 μL에 B 액 100 ㎕. 실온에서 20 분 동안 품어.
- 모든 우물에 솔루션의 피펫 40 μL와 실온에서 45 분 동안 품어.
- 피펫 모든 우물에 솔루션 C의 10 μL. 10 분 동안 RT에서 인큐베이션.
- 345 나노 미터의 여기 파장 465 나노 미터의 발광 파장 복합 리더기에 읽어 형광을 얻습니다.
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Representative Results
처음에, 그것은 ZRcoum는 96- 웰 플레이트 형식으로 PAD4의 활성에보고 할 수 있음을 입증 하였다. 웰은 상기 기판과 함께 ZRcoum PAD4의 존재 / 부재 하에서 배양 하였다. 15분의 475 nm의 필터 (도 2A) - 37 ° C에서 45 분의 인큐베이션 기간 후, 형광 40분의 340로 측정 하였다. 예상 한 바와 같이, 형광 레벨은 ZRcoum (또는 시트룰린 ZRcoum) 내의 형광 낮게 유지 잠긴 상태로 남아 있었다. 용액에 과량의 트립신 / EDTA를 첨가하면, 형광 물질은 ZRcoum로부터 해방 있었지만 PAD4의 존재 하에서 거의 변하지 않았다. EDTA의 첨가로 인해 필수적인 칼슘 이온을 킬레이트 화하는 능력에 PAD4 반응의 중단을 지원하기위한 것이다. 이들 데이터로부터, 형광 출력의 5.2 배의 감소 PAD4의 존재가 관찰되었다. 다음, 완높은 처리량 스크리닝 플랫폼과 새로 개발 된 분석의 atibility이 증명되었다. 이 스크리닝 목적을 위해 가장 유리한 것 네 반응 변수를 분석하는 주요 관심사였다 (1) 분석 체적의 소형화 (2) RT에서 단백질 및 완충액 혼합물 (3)의 안정성을 분석을 수행 할 가능성 분석과 유기 용매 / 계면 활성제 (4) 잠재적 인 간섭을 완료하기 전에.
중간 또는 높은 처리량 스크리닝 노력 들어 고밀도 웰 플레이트는 일반적 소분자 스크린에 이용된다. 이 96- 웰 플레이트 (도 2B)에 비해 분석법 384- 웰 플레이트에서 거의 동일하게 수행 될 수 있음을 확인 하였다. 상기 고 스루풋 포맷의 분석을위한 작업 조건을 결정하는 단계에서는, PAD4 활성을 RT에서 적당한 시간 프레임에서 모니터링 될 수 있는지 여부를 조사하는 것이 중요했다. 모든 액체 처리 기기가 가지고 있기 때문에온도 제어기는, 그 상승 된 온도에서 배양하는 단계를 갖는 것이 번거롭고 비용이 많이들 수있다. 또한, 온도 변동에 대한 회계 처리 판과 실행 사이의 불일치의 원인이 될 수 있습니다. 여기에 기재된 분석에 대한 낮은 온도의 영향을 결정하기 위해 유사한 분석은 RT에서 수행 하였다. 이 신호는 37 ° C 및 RT (그림 3) 사이에 거의 변화가 없었다하였습니다. 상기 PAD4과 기판 사이에 필요한 배양 시간을 최소화하여 분석 성능을 최적화하기 위해, 반응의 동력학을 분석 하였다. PAD4 활성을 RT에서 37 ° C 두 시간에 걸쳐 모니터링 하였다. 예상대로 PAD4가 20 분으로 대부분 완전한 반응을 (인간의 생리적 온도와 일치) 37 ° C에서 더 활성화되어 나타납니다. 만족스럽게, 반응물을 RT까지 강하게 다운 온도 감소에 의해 영향을받지 않는다. 반응로에서 약 절반의 속도를 진행온도 상승과 본질적으로 완전한 40 ~ 45 분 후 시작합니다. 물론 분석 시간에서 반응 속도 상수를 계산하고 매개 변수 (K M = 397 μM, K 고양이 = 2.98 초 -1, K 고양이 / K의 M = 7400 초 -1 M -1) 다른 PAD4 유사한 것으로 밝혀졌다 기판.있어서 반응의 동역학과 함께 (31)는, 모든 후속 분석법 측정점 처음부터 1 시간으로 감소되었다.
장기간에 걸쳐 반응 완충액에 용해 될 때 다음 PAD4의 안정성을 평가 하였다. 현실적으로, 높은 처리량 검사는 장비가 화면을 완료하는 동안 많은 시간 동안 일반적으로 안정되어 시약을 필요로한다. 특정 시약 분의 상대적인 저장 수명을 가지고 있다면, 꽤 많은 비용과 시간이 신선한 시약을 준비하기 위해 화면을 종료 소모적 일 수있다. 분석 조건에 따라서는 아니다일부 분석에 대한 특별한이 매우 이유로 높은 관통 넣어 심사와 호환되지 않을 수 있습니다. 이를 염두에 개념에서, 버퍼 내의 PAD4의 안정성은 수 시간에 걸쳐 모니터링 하였다. 대부분의 효소 활성의 손실 따라서 단백질 심지어 15 시간 (도 4A)에 대한 RT 앉아 후에 안정임을 나타내는 시간 기간 동안 관찰되지 않았다. 다음에, 소형화 조건과 RT에 실행 분석이 여전히 적절 PAD4의 존재에 응답할지 여부를 평가 하였다. 공지 PAD4 억제제, chloroamidine (CL-아미 딘)의 배양시 PAD4 (도 4b)의 완전 억제와 일치 형광 신호의 완벽한 복원되었다. 마지막으로, 또한 일반적으로, 최종 부피로 3 %까지, 작은 분자의 원액에 사용되는 유기 용매 DMSO의 존재는, 상기 분석에 방해가되지 않은 것이 확인되었다 (데이터는 미도시). 마찬가지로, 0.01 % 트리톤 X-100의 첨가는 시뮬레이션 결과ILAR 형광 동향 (데이터 미기재).
분석은 일반적으로 작은 분자 약물 발견 노력에서 발생하는 다양한 조건에 내성이 있음을 표시하는 데, 80 화합물의 심사가 실시되었다 0.71의 강력한 Z '값이 확인되었다. 분석의 가능성을 발전에서 PAD4 / ZRcoum 반응의 선택성 조 전체 세포 용 해물에서의 반응을 수행하여 강조 하였다. E. GST-PAD4 발현 벡터를 포함하는 대장균 세포를 GST-PAD4의 분리를 위해 사용 된 절차와 유사한 IPTG로 유도 하였다. 초음파 처리를 통해 세포막의 파괴에 이어, 세포 파편을 명확히 세포 용 해물을 수득 원심 분리 하였다. PAD4 함유하는 세포 용 해물은 정제 된 GST-PAD4 분석법, 용액 중의 활성 PAD4의 존재 (변화와 일치 형광 신호와 동일한 분석 조건에 제출되었을 때
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그림 1. PAD4하고 형광 기반의 분석의 설계. (A) 뉴 클레오의 기본 단위를 구성하는 히스톤 어셈블리의 만화 표현입니다. PAD4은 히스톤 단백질의 아르기닌 잔기의 수의 citrullination을 촉매. (B) ZRcoum은 PAD4의 (명확성을 위해 숨겨진) 기본 기판 (가입 코드 2DW5)과 중첩. 전형적인 PAD4 분석의 단계 (C) 표현입니다. 기판 ZRcoum의 PAD4로 Citrullination 따라서 형광 수준의 변화를 일으키는 트립신 매개 아미드 가수 분해의 감수성을 감소시킨다. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
96- 웰 및 384- 웰 플레이트 포맷에서도 2 PAD4 분석 방법. 형광을 측정 하였다 (여기 345 nm의 / 방출 465 ㎚) 지정된 조건 모두 96- 웰 포맷 (A) 및 384- 웰 포맷 (B) (37 ° C에서). 단백질 분해 효소 트립신의 추가는 PAD4없이 우물에 형광 수준의 큰 증가로 연결하고 PAD4와 우물 거의 변경되지 않습니다. 데이터는 평균 + 표준 편차로 표시됩니다 (N = 3). 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PAD4 분석. 형광의도 3 시간 코스 분석 측정 하였다 (345 nm의 여기 / 방출 465 ㎚) 주기적 단백질과 70 분에 걸쳐 96- 웰 플레이트 형식으로 어느 37 인큐베이션° C (A) 또는 RT에서 (B). 데이터는 평균 ± 표준 편차를 나타낸다 (N = 3). 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4. 단백질 안정성 및 억제. (A) PAD4의 활성은 지정된 시간 간격 후에 측정 하였다. 비교를 위해, 형광 레벨은 PAD4의 부재에 나타낸다. 형광 레벨은 이전 (적색)과 다음 (녹색) 트립신의 첨가를 나타낸다. 공지 PAD4 억제제 된 C1-아미 딘 (100 μM)의 (B) 용도 RT에서 384- 웰 플레이트 포맷에서 형광 신호의 복원되었다. 형광 레벨은 이전 (적색)과 다음 (녹색) 트립신의 첨가를 나타낸다. 모든 데이터는 represe 있습니다으로 평균 ± 표준 편차를 nted (N = 3). 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 조 세포 용 해물 분석법. 분석은 RT에서 384- 웰 플레이트 포맷 부재와 조 세포 용 해물의 존재하에 수행 하였다. 형광 레벨은 이전 (적색)과 다음 (녹색) 트립신의 첨가를 나타낸다. CL-아미 딘 (100 μM)은 이러한 조건 하에서 형광 신호의 증가를 일으켰다. 모든 데이터는 평균 ± 표준 편차를 표시 (N = 3). 아르 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. | |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich | ||
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | www.tecan.com | ||
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | http://www.perkinelmer.com |
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