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Chemistry

Monitoreo basado en la fluorescencia de PAD4 actividad a través de un sustrato Analog Pro-fluorescencia

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Un gran número de proteínas de mamíferos son muy modificada por la acción de enzimas después de la biosíntesis de proteínas por el ribosoma. Estas modificaciones post-traduccionales (PTMs) pueden aumentar en gran medida la diversidad funcional del proteoma cambiando el tamaño, carga, estructura y estado de oligomerización (entre otras características) de las proteínas 1-3. Como resultado, el cambio en la estructura de la proteína puede conducir a consecuencias fisiológicas, tales como la degradación de proteínas, la diferenciación celular, la señalización, la modulación en la expresión génica, y las interacciones proteína-proteína. Mientras que estas modificaciones son frecuentes en un gran porcentaje de todas las proteínas humanas, los extremos terminales de las proteínas histonas se someten a un número inusualmente alto de modificaciones covalentes 4. Las proteínas histonas son una familia de proteínas estructurales que facilitan la condensación del ADN genómico. Las modificaciones covalentes de las colas de las histonas no estructurados se llevan a cabo y regulados por una series de enzimas que pueden catalizar la modificación covalente de residuos (escritores), revertir las mismas modificaciones (borradores), y distinguir entre los cambios que se imprime en las colas de las histonas (lectores) 5-7. De hecho, la mayoría de los PTM conocidos se puede observar dentro de este segmento corto de la histona incluyendo la metilación, fosforilación, acetilación, sumoylation, ubiquitinación, y citrullination 8.

Citrullination implica la conversión de peptidil-arginina a la no t RNA peptidil-citrulina codificada (Figura 1A). Las proteínas, responsables de esta cadena de neutralización lado, son miembros de la PAD (p eptide un d eiminase rginine) familia de proteínas, todos los cuales son enzimas dependientes de calcio. 9,10. Hasta la fecha, cinco miembros de la familia PAD se han descrito (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, y PAD6). Cada miembro de esta familia aparece a proteínas diana celulares distintas y también muestra uniperfiles de distribución en tejidos Que. PAD4 es el único miembro de esta familia de proteínas conocida por ser localizada dentro del núcleo a través de una secuencia de localización nuclear 11. Por consiguiente, se ha demostrado que deiminate una serie de objetivos nucleares, incluyendo cadenas laterales de arginina en las colas N-terminales de las histonas H2A residuo de arginina 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, y H3R26) y H4 (H4R3) 12, 13. Mientras que cada una de las isoenzimas PAD tienen funciones fisiológicas específicas y críticas, PAD4 ha recibido mucha más atención debido a su papel en un número de procesos humanos en ambas células enfermas y sanas. Recientemente, PAD4 se demostró que era un miembro de la red transcripcional pluripotencia 14. Ambos niveles de expresión y actividad PAD4, se mostró a ser elevados durante la reprogramación y en estado fundamental estados pluripotentes en ratones. Mediante el control de la regulación de los genes de células madre, PAD4 puede retener un papel fundamental en la eficiencia de la reprogramación celular. PAD4 también ha sido implicado en laformación de trampas extracelulares de neutrófilos, que tras la unión de patógenos permitir su depuración de sistema. El hypercitrullination de proteínas histonas por PAD4 induce descondensación de la cromatina, que sirve como material de base para la encapsulación de bacterias patógenas por la trampa extracelular, por lo tanto alejar las infecciones bacterianas 15,16.

Además, PAD4 se ha encontrado para desempeñar un papel activo en un número de enfermedades humanas. Se ha demostrado previamente que la expresión aberrante de PAD4 se asocia con la aparición y severidad de la artritis reumatoide, la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, y esclerosis múltiple 17. De hecho, la presencia de anticuerpos anti-proteína citrulinados es uno de los biomarcadores diagnósticos y pronósticos más confiables y definitivas de la artritis reumatoide 18. Asimismo, la actividad PAD4 dysregulated recientemente se ha observado en un número de cánceres humanos incluyendo ovario, mama, pulmón, unad cánceres esofágicos 19-22. El vínculo entre PAD4 y el cáncer se ha demostrado que ser mediada a través de la oncogén ELK1 o a través de la proteína supresora de tumores p53 22,23 y el trabajo previo ha sugerido que PAD4 podría ser un anti-cáncer de nueva diana terapéutica 17,24,25. Como prueba de principio estudio, el agotamiento de los PAD4 través shRNA en la línea celular de cáncer colorrectal HCT116 fue revelado a ser suficiente para inducir la apoptosis y la detención del ciclo celular 26. Un inhibidor irreversible PAD4 desarrollado recientemente condujo a una reducción del setenta por ciento de la masa tumoral en ratones 27. Muy notablemente, la inhibición PAD4 parecía actuar como una terapia dirigida que resultó en la destrucción selectiva de las células cancerosas sin dañar las células no transformadas.

El uso de moléculas pequeñas para desactivar la función de PAD4 puede llegar a ser una nueva y poderosa estrategia para dirigirse a las células cancerosas o para aumentar quimioterapéuticos de cáncer existentes 28. Por desgracia, un pocarpa inhibidor reversible PAD4 aún no se ha descubierto. Una serie de inhibidores covalentes se han desarrollado utilizando la / mango imidina flúor cloro que imita el sustrato arginina 27,29,30 y han demostrado ser herramientas prácticas para comprender el papel de PAD4 tanto en las células sanas y enfermas estatales. Sin embargo, estas moléculas inhiben todos los PAD activos con potencia similar. Por lo tanto, la necesidad de un ensayo fácil de que informa sobre la actividad de PAD4 es crucial. Hasta la fecha, PAD4 ensayos se han descrito que enlazan la liberación de amoníaco a partir de la reacción a una lectura colorimétrica 31, utilizar un análogo de sustrato chloroamidine marcado con fluorescencia para el ensayo de polarización de fluorescencia 32, se basan en la reacción de ácido asistida entre glioxal y citrulina 33, y par la actividad PAD4 a una fluorescencia desatenuación paso 34. De estos, sólo la estrategia haloacetamidine modificador covalente ha demostrado ser compatible con scre de alto rendimientoplataformas Ening 32,35,36. Se describe un ensayo basado en la fluorescencia superficial que mide de forma fiable la actividad de PAD4. El ensayo, que muestra una fuerte relación señal-ruido, la velocidad de análisis, y la robustez de la medición, tiene el potencial de descubrir un inhibidor de PAD4 verdaderamente potente y selectivo.

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Protocol

1. PAD4 Transformación, Expresión y Purificación

  1. Para PAD4 Transformación, transformar el plásmido pGEX que contiene GST fusión PAD4 en E. químicamente competente Coli (BL21 (DE3)) las células para la expresión de proteínas utilizando el siguiente procedimiento. Preparar (cloruro de calcio) químicamente competente E. Células de E. coli (BL21 (DE3)) de acuerdo con protocolos estándar.
    1. Descongelar 50 l de preparado previamente químicamente competentes BL21 (DE3) células en hielo y se mezcla con 1 l de la plásmido pGEX que contiene el gen PAD4 en un tubo de cultivo de 5 ml. Incubar la mezcla en hielo durante 10 min mientras se agitaba suavemente cada 2 min.
    2. Choque térmico de las células mediante la colocación de la mezcla en un baño de agua de 42 ° C durante 40 segundos. Inmediatamente colocar la mezcla de células-plásmido de nuevo en hielo durante 2 min para permitir que las células se recuperen. Añadir 1 ml de caldo LB estéril a la mezcla y colocar en hielo durante 1 min.
    3. Incubar el calor conmocionado células a 37 ° C, agitando a 250 rpm durante 1hora Pipetear 75 l de las células transformadas en una placa de agar resistente a la ampicilina y se incuba a 37 ° C durante 15 hr. Placa Almacenar a 4 ° C.
  2. Expresión PAD4.
    1. Escoja 1 colonia de células BL21 (DE3) de la placa de agar ampicilina y lugar en 5 ml de LB que contienen ampicilina 1x. Colocar en incubadora y agitar O / N a 37 ° C.
    2. La transferencia de los 5 ml de LB (arranque) en 1 L de LB estéril que contiene trihidrato de ampicilina 1x (MW 403.45 g / mol). Place crecimiento en un incubador con agitación 37 ° C. Supervisar el OD 600 del crecimiento. Cuando el crecimiento llega a un OD 600 de 0,3, mueva el crecimiento en 16 ° C agitando incubadora.
    3. Al llegar a un OD 600 de 0,6, inducir a las células con isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238.30 g / mol). Permitir que las células se dan durante 15 horas a 16 ° C.
    4. Las células de la cosecha por centrifugación a 4000 xg durante 20 min a 0 ° C. Retirar el sobrenadante y tienda de pellets a -80 ° C.
  3. PAD4 Purificación
    1. Vuelva a suspender el sedimento que contiene el PAD4 expresado en BL21 (DE3) las células en un tampón de 50 mM de NaCl (PM 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (PM 119,98 g / mol), 10 mM de imidazol (MW 68.077 g / mol), 0,1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174.94 g / mol) y ditiotreitol 1 mM (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lisar las células a través de sonicación durante 15 min a 4 ° C. Después de la sonicación, centrifugar el lisado celular a 20.000 xg durante 20 min a 0 ° C. Retirar y guardar el sobrenadante. Lotes del sobrenadante con el glutatión (GSH) perlas de agarosa durante 30 min a RT.
    3. Escurrir sobrenadante de GST cuentas / columna a través de la gravedad. Lavar los granos con 4 x 25 ml de 1x PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH = 8,0) a TA.
    4. Eluir PAD4 con 2 x 10 ml de tampón de elución, tris 50 mM (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121.14 g / mol), glutatión 10 mM (GSH, MW 307.32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Concéntrese PAD4 usando 100k MW corte-otubos de centrífuga ff y centrifugar a 4000 xg durante 20 min a 4 ° C. Alícuota de proteínas en 200 l volúmenes de 1,0 ml tubos de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C.

2. Preparación de las soluciones de archivo para tampones

  1. Pesar de cloruro de sodio (NaCl, MW 58,44 g / mol) y preparar una solución 2 M. Mezcle la solución hasta que se aclare.
  2. Pesar Tris (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121.14 g / mol) y preparar una solución 2 M, pH = 8,0. Mezcle la solución hasta que se aclare.
  3. Pesar dihidrato de cloruro de calcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) y preparar una solución de 500 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare.
  4. Pesar Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, MW 250.19 g / mol) y preparar una solución de 200 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C.
  5. Pesar ditiotreitol (DTT, PM 154,25 g / mol) y preparar una solución de 1 M. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C.
  6. Prepararuna solución al 0,5% de Triton X-100.
  7. Pesar el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, MW 292.24 g / mol) y preparar una solución de 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare.
  8. Pesar Z- Arg Arg 7- amido 4- metilcumarina clorhidrato (ZRcoum, MW 621.69 g / mol) y preparar una solución 10 mM en dimetilsulfóxido (DMSO).

3. Ensayo PAD4 a 37 ° C

  1. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 125 mM de ZRcoum en agua. Esta solución 125 mM ZRcoum será Solución A.
  2. Preparar un tampón de NaCl 62,5 mM, 62,5 mM Tris, 12.5 mM CaCl 2, DTT 6,25 mM, y 5 PAD4 M (pH = 8,0). Esta será la solución B.
  3. Preparar un tampón de NaCl 62,5 mM, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, y 6,25 mM TDT (pH = 8,0). Esta será la solución C.
  4. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y almacenar a -20° C. Este será Solución D.
  5. Obtener una placa de 96 pocillos y designar un número de pozos para los controles (sin PAD4) y ​​pocillos de ensayo (+ PAD4).
  6. Pipetear 160 l de solución B en los pocillos de ensayo y pipeta de 160 l de solución C en los pocillos de control. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C.
  7. Pipetear 40 l de la solución A en todos los pocillos y se incuba a 37 ° C durante 45 min.
  8. Pipeta de 10 l de dH 2 O a la mitad de los pozos de control y la mitad de los pozos de prueba. Para la otra mitad de los pocillos de control y los controles de ensayo, pipetas de 10 l de solución de D. Incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
  9. Obtener una lectura de fluorescencia en un lector de multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

4. Ensayo PAD4 a TA

  1. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 50 mM de ZRcoum en agua. Esta solución ZRcoum 50 M será Solución A.
  2. Preparar un tampón de Na 100 mMCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% de Triton X-100, y 8 PAD4 M (pH = 8,0). Esta será la solución B.
  3. Preparar un tampón de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, y 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Esta será la solución C.
  4. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C. Este será Solución D.
  5. Obtener una placa de 384 pocillos y designar pozos para los controles (sin PAD4) y ​​pozos de prueba (+ PAD4).
  6. Pipetear 25 l de solución B en los pocillos de ensayo y pipeta de 25 l de solución C en los pocillos de control. Permitir tampón con / sin PAD4 incubar en los pocillos durante 20 min a RT.
  7. Pipeta 25 l de solución C en todos los pocillos e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  8. Pipeta de 10 l de dH 2 O a la mitad de los pozos de control y la mitad de los pozos de prueba. Para la otra mitad de los pocillos de control y controles de prueba, pipeteee 10 l de solución de D. Incubar a TA durante 10 min.
  9. Obtener una lectura de fluorescencia en un lector de multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

5. PAD4 Tiempo Ensayos del curso a 37 ° C y RT

  1. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 125 mM de ZRcoum en agua. Esta solución 125 mM ZRcoum será Solución A.
  2. Preparar un tampón de NaCl 62,5 mM, 62,5 mM Tris, 12.5 mM CaCl 2, DTT 6,25 mM, y 5 PAD4 M (pH = 8,0). Esta será la solución B.
  3. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C. Esta será la solución C.
  4. Obtener 2 placas de 96 pocillos y pipeta de 160 l de solución B en # cantidad de pozos (# de pozos dependerá de cuántos puntos de tiempo).
  5. Incubar una placa de 96 pocillos a 37 ° C. Incubar la otra placa de 96 pocillos a TA.
  6. Pepitaette 40 l de la solución A en todos los pocillos en ambas placas de 96 pocillos e inmediatamente pipeta de 10 l de solución de C en los pocillos t = 0 min. Continuar la adición de 10 l de solución de C en los puntos de tiempo específicos hasta que todos los pozos han sido templado.
  7. Obtener una lectura de fluorescencia en un lector de multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

6. PAD4 ensayo de inhibición a RT

  1. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 83 mM de ZRcoum en agua. Esta solución ZRcoum 83 M será Solución A.
  2. Pesar Cl-amidina (MW 424.8 g / mol) y preparar una solución madre 100 mM. Esta será la solución B.
  3. Preparar un tampón de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, 0,02% de Triton X-100, y 8 M PAD4 (pH = 8,0). Esta será la solución C.
  4. Preparar un tampón de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 mM TCEP, y 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Thes que será la solución D.
  5. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C. Este será Solución E.
  6. Obtener una placa de 384 pocillos y designar pozos para los controles (sin PAD4), pozos de prueba (+ PAD4), y pozos de inhibición (PAD4 + Cl-amidina).
  7. Pipetear 25 l de solución C en los pocillos de ensayo y pipeta de 25 l de solución D en los pocillos de control. Permitir tampón con / sin PAD4 incubar en los pocillos durante 20 min a RT.
  8. Pipeta de 10 l de solución B en pozos de inhibición y se incuban durante 20 minutos a Rte.
  9. Pipeta 15 l de solución A en todos los pocillos e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  10. Pipetear 10 l de solución E a todos los pocillos. Incubar a TA durante 10 min.
  11. Obtener una lectura de fluorescencia en un lector de multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

7. Ensayo de lisado celular brutoa TA

  1. Después de cosechar las células de crecimiento PAD4 1 L, Resuspender las células en 10 ml de Tris 50 mM, NaCl 50 mM, 0,1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174.94 g / mol) y ditiotreitol 1 mM (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
  2. Lisar las células a través de sonicación durante 15 min a 4 ° C. Se centrifuga el lisado celular a 20.000 xg durante 20 min a 0 ° C. Se concentra el sobrenadante claro a la mitad del volumen mediante centrifugación a 4000 rpm a 4 ° C utilizando 100k MW tubos de centrífuga de corte.
  3. Del 10 mM ZRcoum acciones, preparar una solución de 250 mM de ZRcoum en agua. Esta solución 250 mM ZRcoum será Solución A.
  4. Preparar un tampón de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, y 2 mM TCEP (pH = 8,0). Esta será la solución B.
  5. Pesar tripsina, cristalino (de páncreas bovino) y preparar una 10 mg / ml en EDTA 100 mM. Mezcle la solución hasta que se aclare y se almacena a -20 ° C. Esta será la solución C.
  6. Obtener una placa de 384 pocillos negro y diseñocomió pozos para los controles (sin lisado celular) y pocillos de ensayo (+ lisado celular).
  7. Pipetear 100 l de solución B en todos los pozos y las pipetas de 60 l de lisado celular en los pocillos de ensayo. Incubar durante 20 min a TA.
  8. Pipeta 40 l de solución A en todos los pocillos e incubar durante 45 minutos a temperatura ambiente.
  9. Pipetear 10 l de la solución C a todos los pocillos. Incubar a TA durante 10 min.
  10. Obtener una lectura de fluorescencia en el lector multimodal con una longitud de onda de excitación de 345 nm y una longitud de onda de emisión de 465 nm.

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Representative Results

Inicialmente, se demostró que ZRcoum puede informar sobre la actividad de PAD4 en un formato de placa de 96 pocillos. Los pocillos se incubaron con el sustrato ZRcoum y en presencia / ausencia de PAD4. Tras un período de incubación de 45 min a 37 ° C, la fluorescencia se midió con un 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Como era de esperar, los niveles de fluorescencia se mantuvo bajo como fluoróforo en ZRcoum (o el citrulinado ZRcoum) permanecieron en el estado bloqueado. Después de la adición de un exceso de tripsina / EDTA a la solución, los fluoróforos fueron liberados de ZRcoum pero permanecieron prácticamente sin cambios en presencia de PAD4. La adición de EDTA está destinado a ayudar en el cese de la reacción PAD4 debido a su capacidad para quelar los iones de calcio esenciales. A partir de estos datos, se observó una disminución de 5,2 veces en la salida de la fluorescencia en presencia de PAD4. A continuación, el borradoratibility del ensayo recién desarrollado con plataformas de cribado de alto rendimiento se demostró. Fue de interés primario para analizar cuatro variables de reacción que serían más favorable para propósitos de selección (1) la miniaturización del volumen de ensayo (2) la posibilidad de realizar el ensayo a temperatura ambiente (3) la estabilidad de la mezcla de proteína y tampón antes de completar el ensayo y (4) la interferencia potencial de disolventes orgánicos / detergentes.

Para mediados de los esfuerzos o cribado de alto rendimiento, y placas de alta densidad se utilizan comúnmente en las pequeñas pantallas de moléculas. Se verificó que el ensayo puede llevarse a cabo de manera casi idéntica en una placa de 384 pocillos en comparación con una placa de 96 pocillos (Figura 2B). En la determinación de las condiciones de trabajo más para el ensayo en un formato de alto rendimiento, es importante investigar si la actividad PAD4 se puede controlar en un plazo razonable a RT. Dado que no todos los instrumentos de manejo de líquidos tienenun controlador de temperatura, puede llegar a ser engorroso y costoso tener una etapa de incubación a temperatura elevada. Por otra parte, lo que representa la fluctuación de la temperatura puede ser un motivo de discrepancia entre las placas y se ejecuta. Con el fin de determinar el efecto de temperaturas más bajas para el ensayo se describe aquí, un ensayo similar se llevó a cabo a temperatura ambiente. Se encontró que las señales eran prácticamente sin cambios entre 37 ° C y RT (Figura 3). Para optimizar aún más el rendimiento del ensayo al minimizar el tiempo de incubación requerido entre PAD4 y el sustrato, se analizó la cinética de la reacción. PAD4 actividad se monitorizó con el tiempo tanto a temperatura ambiente y 37 ° C. Como era de esperar, parece que PAD4 es más activa a 37 ° C (de conformidad con la temperatura fisiológica humana) con la reacción casi completo por 20 min. Satisfactoriamente, la reacción no se ve fuertemente afectado por la reducción de la temperatura a TA. La reacción transcurre en aproximadamente la mitad de la velocidad que en eltemperatura elevada y es esencialmente completa posterior iniciación 40-45 min. Desde el momento analiza supuesto, se calcularon las constantes cinéticas y se encontraron los parámetros (K M = 397 M, k cat = 2,98 seg-1, k cat / k M = 7400 seg -1 M -1) para ser similar a otra PAD4 sustratos. 31 Con la cinética de la reacción que se caracteriza, todos los ensayos posteriores se redujeron a 1 hr desde el principio hasta el punto de medición.

A continuación, se evaluó la estabilidad de PAD4 cuando se disuelve en el tampón de reacción durante un período prolongado de tiempo. Siendo realistas, cribado de alto rendimiento se requiere de reactivos para ser generalmente estable durante muchas horas mientras el instrumento está completando la pantalla. Si ciertos reactivos tienen un tiempo de conservación relativa de minutos, puede ser muy costoso y requiere mucho tiempo para terminar la pantalla con el fin de preparar reactivos frescos. Dependiendo de las condiciones de ensayo, no esinusual para algunos ensayos para ser incompatible con alta proyección a través de poner-por esta misma razón. Con esta idea en mente, la estabilidad de PAD4 en tampón se controló durante varias horas. Casi no hay pérdida de actividad enzimática se observó en todo el período de tiempo, lo que indica que la proteína es estable incluso después de estar sentado a TA durante más de 15 h (Figura 4A). A continuación, se evaluó si el ensayo de funcionar bajo condiciones miniaturizados y a TA todavía responder apropiadamente a la presencia de un PAD4. Tras la incubación del inhibidor de PAD4 conocido, chloroamidine (Cl-amidina), condujo a una restauración completa de la señal de fluorescencia coherente con la inhibición completa de PAD4 (Figura 4B). Por último, también se verificó que la presencia del disolvente DMSO orgánico, comúnmente utilizado en las soluciones madre de moléculas pequeñas, hasta un 3% como el volumen final, no interfirió con el ensayo (datos no mostrados). Del mismo modo, la adición de 0,01% de Triton X-100 dio lugar a simtendencias de fluorescencia ILAR (datos no presentados).

Después de haber demostrado que el ensayo es tolerante a una variedad de condiciones que se encuentran típicamente en pequeños esfuerzos de descubrimiento de fármacos de molécula, se llevó a cabo una selección preliminar de 80 compuestos y se identificó un valor robusto Z 'de 0,71. Al promover el potencial del ensayo, la selectividad de la reacción PAD4 / ZRcoum se puso de manifiesto mediante la realización de la reacción en crudo lisados ​​de células enteras. E. células de E. coli que contienen el vector de expresión de GST-PAD4 se indujeron con IPTG, similar al procedimiento usado para el aislamiento de GST-PAD4. Tras la ruptura de la membrana celular a través de sonicación, los restos celulares se separó por centrifugación para producir un lisado celular clarificado. Cuando el lisado celular que contiene PAD4-fue sometido a las mismas condiciones de ensayo como el ensayo de GST-PAD4 purificada, la señal de fluorescencia variaba de acuerdo con la presencia de PAD4 activo en solución ( > Figura 5). Los lisados ​​celulares contienen un número de biomacromoléculas a altas concentraciones que potencialmente podrían interferir con la actividad de PAD4, las propiedades fluorescentes de ZRcoum, y la etapa de tripsina. El hallazgo de que el ensayo era funcional en los lisados ​​celulares en bruto indica que existe una alta selectividad en la reacción entre PAD4 y ZRcoum. Para demostrar aún más que la disminución de la señal en presencia de lisados ​​de células de crudo era específico para la presencia de PAD4 activo, el efecto de Cl-amidina, un inhibidor covalente PAD4 establecido, se evaluó. La adición de Cl-amidina condujo a una restauración en la señal de fluorescencia, de conformidad con la inactivación de PAD4 (Figura 5). Juntos, se demostró el ensayo puede simplificarse aún más mediante la utilización de lisados ​​de células de crudo para el seguimiento de la actividad PAD4.

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Figura 1. PAD4 y el diseño de su ensayo basado en fluorescencia. (A) Representación de la historieta de los conjuntos de histonas que componen la unidad básica de un nucleosoma. PAD4 cataliza la citrullination de un número de residuos de arginina en las proteínas histonas. (B) ZRcoum superpone con el sustrato nativo (oculto para mayor claridad) de PAD4 (código adhesión 2DW5). (C) Representación de los pasos de un ensayo típico PAD4. Citrullination por PAD4 del ZRcoum sustrato reduce su susceptibilidad a la tripsina mediada por hidrólisis amida, lo que provoca un cambio en los niveles de fluorescencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 2 Figura 2. PAD4 ensayo en 96 pocillos y 384 pocillos formatos de placas se midió la fluorescencia. (Excitación 345 nm / emisión 465 nm) tanto en un formato de 96 pocillos (A) y el formato de 384 pocillos (B) con las condiciones designadas (37 ° C). La adición de tripsina proteasa conduce a un gran aumento en los niveles de fluorescencia en los pocillos sin PAD4 y se mantiene prácticamente sin cambios para pozos con PAD4. Los datos se representan como media ± SD (n = 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 3
Se midió la Figura 3. Tiempo de análisis del curso de PAD4 ensayo. Fluorescencia (excitación 345 nm / emisión 465 nm) periódicamente en un formato de placa de 96 pocillos durante 70 min con la proteína se incubaron ya sea en 37° C (A) o al RT (B). Los datos se representan como media +/- SD (n = 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 4
Figura 4. estabilidad de la proteína y la inhibición. (A) La actividad de PAD4 se midió después de los intervalos de tiempo designados. Para la comparación, los niveles de fluorescencia se muestran en la ausencia de PAD4. Niveles de fluorescencia se muestran antes (rojo) y siguiente (verde) la adición de tripsina. (B) Introducción del inhibidor PAD4 conocido Cl-amidina (100 M) condujo a una restauración de la señal de fluorescencia en un formato de placa de 384 pocillos a RT. Niveles de fluorescencia se muestran antes (rojo) y siguiente (verde) la adición de tripsina. Todos los datos son represented como media +/- SD (n = 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

Figura 5
Figura 5. ensayo de lisado celular bruto. El ensayo se realizó en ausencia y presencia de los lisados ​​celulares en bruto en un formato de placa de 384 pocillos a RT. Niveles de fluorescencia se muestran antes (rojo) y siguiente (verde) la adición de tripsina. Cl-amidina (100 mM) también causó un aumento en la señal de fluorescencia en estas condiciones. Todos los datos se representan como media +/- SD (n = 3). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de la figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

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Química Número 93 PAD4 PADI4 citrullination arginina modificación post-traduccional HTS el ensayo la fluorescencia la citrulina
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Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

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