Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Fluorescentie gebaseerde Monitoring van PAD4 activiteit via een Pro-fluorescentie Substrate Analog

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Een groot aantal zoogdiereiwitten worden sterk veranderd door de werking van enzymen na de biosynthese van eiwitten door het ribosoom. Deze post-translationele modificaties (PTM) kan verhogen de functionele diversiteit van het proteoom door de grootte, lading, structuur en oligomerisatie toestand (naast andere functionaliteiten) van eiwitten 1-3. Hierdoor kan de verandering in eiwitstructuur leiden tot fysiologische gevolgen, zoals proteïne afbraak, cellulaire differentiatie, signalering, modulatie van genexpressie en eiwit-eiwit interacties. Hoewel deze wijzigingen heersen in een groot percentage van alle menselijke eiwitten, de uiteinden van histon eiwitten ondergaan een ongewoon hoog aantal covalente 4 modificaties. Histon eiwitten zijn een familie van structurele eiwitten die de condensatie van genomisch DNA te vergemakkelijken. Covalente modificaties van de ongestructureerde histon staarten worden uitgevoerd en gereguleerd door een series van enzymen die de covalente modificatie van residuen (schrijvers) kan katalyseren, reverse dezelfde modificaties (gummen), en onderscheid te maken tussen de veranderingen die zijn bedrukt op de histon staarten (lezers) 5-7. De meeste van de bekende PTMs mogelijk binnen dit korte segment van de histon zoals methylatie, fosforylatie, acetylatie, sumoylation, ubiquitinatie en citrullinatie 8.

Citrullinatie Daarbij worden peptidyl-arginine aan de niet t RNA gecodeerde peptidyl-citrulline (figuur 1A). De eiwitten, die verantwoordelijk is voor deze zijketen neutralisatie, lid van de PAD (p eptide een rginine d eiminase) eiwitfamilie, die allemaal calciumafhankelijke enzymen. 9,10. Tot op heden hebben vijf leden van de PAD familie beschreven (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 en PAD6). Ieder lid van deze familie lijkt te onderscheiden cellulaire eiwitten richten en toont ook unique weefsel distributie profielen. PAD4 is het enige lid van deze eiwitfamilie bekende gelokaliseerd in de kern via een nucleaire lokalisatie sequentie 11. Dienovereenkomstig is aangetoond dat een aantal nucleaire doelen, waaronder arginine zijketens op de N-terminale staarten van histonen H2A arginine residu 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 en H3R26) en H4 (H4R3) 12 deiminate, 13. Terwijl elk van de PAD isozymen specifieke en kritische fysiologische functies heeft PAD4 veel meer aandacht gekregen vanwege zijn rol in een aantal menselijke processen zowel zieke en gezonde cellen. Recent PAD4 bleek een lid van de pluripotentie transcriptionele netwerk 14 zijn. Beide PAD4 expressie en activiteit werden getoond tijdens de herprogrammering en de grondtoestand pluripotent staten bij muizen te worden verheven. Door regeling van de regulatie van stamcellen genen kan PAD4 een cruciale rol in de cellulaire herprogrammering efficiency behouden. PAD4 is ook geïmpliceerd in devorming van neutrofiele extracellulaire vallen, die na binding van pathogenen in staat hun systeem klaring. De hypercitrullination histon eiwitten door PAD4 induceert decondensatie van het chromatine, dat als grondstof voor de inkapseling van pathogene bacteriën door de extracellulaire val, waardoor afweren bacteriële infecties 15,16.

Daarnaast is gebleken PAD4 een actieve rol in een aantal menselijke ziekten. Eerder is aangetoond dat afwijkende expressie van PAD4 geassocieerd met het begin en de ernst van reumatoïde artritis, ziekte van Alzheimer, ziekte van Parkinson en multiple sclerose 17. In feite is de aanwezigheid van anti-eiwit antilichamen gecitrullineerde is een van de meest betrouwbare en definitieve diagnostische en prognostische biomarkers van reumatoïde artritis 18. Evenzo heeft ontregelde activiteit PAD4 recent waargenomen in een aantal menselijke tumoren zoals eierstok-, borst-, long-, eend slokdarm kanker 19-22. Het verband tussen PAD4 en kanker een gemedieerd via ELK1 oncogen of via het p53 tumor suppressor eiwit 22,23 en eerder werk heeft gesuggereerd dat PAD4 een nieuwe anti-kanker therapeutische target 17,24,25 kunnen zijn. Als proof of principle studie, de uitputting van PAD4 via shRNA in de colorectale kanker cellijn HCT116 werd geopenbaard voldoende voor het induceren van apoptose en celcyclus 26 te zijn. Een recent ontwikkelde PAD4 irreversibele remmer tot een zeventig procent reductie in tumormassa bij muizen 27. Opmerkelijk genoeg PAD4 remming bleek als een doelgerichte therapie die resulteerde in selectieve doden van kankercellen terwijl spaarde ongetransformeerde cellen.

Het gebruik van kleine moleculen de functie van PAD4 uitschakelen kan blijken een krachtige nieuwe strategie om kankercellen richten of bestaande chemotherapieën 28 vergroten zijn. Helaas, een potent omkeerbare PAD4 remmer moet nog worden ontdekt. Een aantal covalente remmers zijn ontwikkeld met behulp van de chloor / fluor imidine handvat dat de arginine substraat 27,29,30 nabootst en hebben bewezen praktische hulpmiddelen zijn in het begrijpen van de rol van PAD4 bij zowel gezonde als zieke toestand cellen. Echter, deze moleculen remmen alle actieve PADS met gelijke potentie. Daarom is de behoefte aan een gemakkelijke test die rapporteert over de activiteit van PAD4 cruciaal. Tot op heden zijn PAD4 assays beschreven die de afgifte van ammoniak verbinden van de reactie op een colorimetrische uitlezing 31, uitgerust met een fluorescent gemerkt chloroamidine substraat analoog voor fluorescentie polarisatie assay 32 gebruikmaken van de zuur-ondersteunde reactie tussen glyoxal en citrulline 33, en koppel de PAD4 activiteit om een fluorescentie dequenching stap 34. Hiervan alleen de covalente modifier haloacetamidine strategie gebleken geschikt high-throughput sch tetanen platforms 32,35,36. We beschrijven een facile fluorescentie gebaseerde test die betrouwbaar meet de activiteit van PAD4. De test, die een sterk signaal-ruisverhouding, analysesnelheid en robuustheid van meting toont, heeft het potentieel om een ​​echt krachtige en selectieve remmer PAD4 ontdekken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 Transformatie, Expressie en zuivering

  1. Voor PAD4 Transformatie, transformeren de pGEX plasmide dat PAD4 GST fusie in chemisch competente E. Coli (BL21 (DE3)) cellen voor eiwitexpressie met de volgende procedure. Bereid chemisch bevoegde (calciumchloride) E. Coli (BL21 (DE3)) -cellen volgens standaard protocollen.
    1. Dooi 50 ul van eerder chemisch competente BL21 (DE3) cellen op ijs en meng met 1 ul van het plasmide met pGEX PAD4 gen in een 5 ml kweek tube. Incubeer het mengsel op ijs gedurende 10 minuten onder zacht schudden om de 2 min.
    2. Heat shock de cellen door het plaatsen van het mengsel in een 42 ° C waterbad gedurende 40 sec. Plaats onmiddellijk cel-plasmide mengsel opnieuw op ijs gedurende 2 minuten om de cellen te herstellen. Voeg 1 ml steriel LB-medium aan het mengsel en plaats op ijs gedurende 1 minuut.
    3. Incubeer de hitteschok cellen bij 37 ° C, onder schudden bij 250 rpm gedurende 1hr. Pipetteer 75 ul van de getransformeerde cellen op een ampicilline resistente agar plaat en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 uur. Store plaat staan ​​bij 4 ° C.
  2. PAD4 Expression.
    1. Pick 1 kolonie van BL21 (DE3) cellen van de ampicilline agarplaat en plaats in 5 ml LB met ampicilline 1x. Plaats in incubator en schud O / N bij 37 ° C.
    2. Breng de 5 ml LB (starter) in 1 L van steriele LB dat 1x ampicillinetrihydraat (MW 403,45 g / mol). Plaats groei in een 37 ° C incubator schudden. Bewaken van de OD 600 van de groei. Wanneer de groei een OD 600 van 0,3 bereikt, bewegen de groei naar 16 ° C schudincubator.
    3. Bij het ​​bereiken van een OD 600 van 0,6, induceren de cellen met 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Laat cellen schudden gedurende 15 uur bij 16 ° C.
    4. Oogst de cellen door centrifugatie bij 4000 xg gedurende 20 min bij 0 ° C. Giet supernatant en bewaar pellet bij -80 ° C.
  3. PAD4 Zuivering
    1. Resuspendeer de pellet dat het tot expressie PAD4 in BL21 (DE3) cellen in een buffer van 50 mM NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM NaH 2PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM imidazool (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, MW 174,94 g / mol) en 1 mM dithiothreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8.0.
    2. Lyseren de cellen via sonicatie gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Na sonicatie, gecentrifugeerd cellysaat bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 0 ° C. Giet af en bewaar supernatant. Batch de supernatant met glutathion (GSH) agarose parels gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
    3. Tap supernatans van GST kralen / kolom via de zwaartekracht. Was kralen met 4 x 25 ml 1x PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH = 8,0) bij kamertemperatuur.
    4. Elueer PAD4 met 2 x 10 ml elutiebuffer, 50 mM tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8.0.
    5. Concentreer PAD4 behulp 100k MW cut-off centrifugebuizen en centrifugeer bij 4000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Aliquot eiwit in 200 gl volumes in 1,0 ml microcentrifuge buizen en bewaar bij -80 ° C.

2. Voorbereiden van Stock Solutions voor Buffers

  1. Weeg natriumchloride (NaCl, MW 58,44 g / mol) en bereidt een 2 M oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk.
  2. Weeg Tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris Base, MW 121,14 g / mol) en stelt een 2 M oplossing, pH = 8,0. Meng de oplossing totdat duidelijk.
  3. Weeg calciumchloridedihydraat (CaCl2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) en bereiden een 500 mM oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk.
  4. Weeg Tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP, MW 250,19 g / mol) en bereiden een 200 mM oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C.
  5. Weeg dithiothreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) en voor te bereiden op een 1 M oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C.
  6. Bereideneen oplossing van 0,5% Triton X-100.
  7. Weeg ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA, MW 292,24 g / mol) en bereiden een 100 mM oplossing. Meng de oplossing totdat duidelijk.
  8. Weeg Z- Arg-Arg-7- amido 4- methylcumarine hydrochloride (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) en bereiden een 10 mM oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO).

3. PAD4 Assay bij 37 ° C

  1. Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 125 uM oplossing van ZRcoum in water. Deze 125 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn
  2. Bereid een buffer van 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT, en 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dit zal Solution B.
  3. Bereid een buffer van 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2 en 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Dit zal Solution C.
  4. Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20° C. Dit zal Solution D.
  5. Verkrijgen van een 96-well plaat en wijst een aantal putten voor controles (geen PAD4) en testputten (+ PAD4).
  6. Pipetteer 160 ul van oplossing B in testputten en pipet 160 ul van Solution C in controle putten. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
  7. Pipetteer 40 ul oplossing A in ieder putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 45 min.
  8. Pipetteer 10 ul van dH 2 O helft van de controleputjes en de helft van de test wells. De andere helft van controleputjes en testcontroles Pipetteer 10 ul van oplossing D. gedurende 10 min bij 37 ° C.
  9. Verkrijgen van een fluorescentieaflezing op een multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm.

4. PAD4 Assay bij RT

  1. Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 50 pM oplossing van ZRcoum in water. Deze 50 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn
  2. Bereid een buffer van 100 mM Na-Cl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100, en 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dit zal Solution B.
  3. Bereid een buffer van 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP en 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Dit zal Solution C.
  4. Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. Dit zal Solution D.
  5. Verkrijgen van een 384-wells plaat en aanwijzen putten voor de controles (geen PAD4) en testputten (+ PAD4).
  6. Pipetteer 25 ul van oplossing B in testputten en pipet 25 ul van Solution C in controle putten. Laat buffer met / zonder PAD4 geïncubeerd in putjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Pipetteer 25 ul van oplossing C in ieder putje en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Pipetteer 10 ul van dH 2 O helft van de controleputjes en de helft van de test wells. De andere helft van controleputjes en testcontroles, pipette 10 pl van oplossing D. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  9. Verkrijgen van een fluorescentieaflezing op een multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm.

5. PAD4 Time Cursus Testen bij 37 ° C en RT

  1. Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 125 uM oplossing van ZRcoum in water. Deze 125 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn
  2. Bereid een buffer van 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl2, 6,25 mM DTT, en 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Dit zal Solution B.
  3. Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. Dit zal Solution C.
  4. Verkrijgen 2 platen met 96 putjes en pipet 160 ul van oplossing B in # hoeveelheid putjes (# putten afhankelijk van het aantal tijdstippen).
  5. Incubeer een 96-puts plaat bij 37 ° C. Incubeer de andere plaat met 96 putjes bij kamertemperatuur.
  6. Pipette 40 pl van oplossing A in alle putjes in zowel 96-well platen en direct pipet 10 ul van oplossing C in de t = 0 min putten. Verder toevoegen van 10 pl van oplossing C op specifieke tijdstippen tot alle putjes werden gedoofd.
  7. Verkrijgen van een fluorescentieaflezing op een multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm.

6. PAD4 Remming Assay bij KT

  1. Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 83 pM oplossing van ZRcoum in water. Deze 83 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn
  2. Weeg Cl-amidine (MW 424,8 g / mol) en bereiden een 100 uM stockoplossing. Dit zal Solution B.
  3. Bereid een buffer van 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP, 0,02% Triton X-100, en 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Dit zal Solution C.
  4. Bereid een buffer van 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2, 2 mM TCEP en 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). This zal Oplossing D.
  5. Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. Dit zal Solution E.
  6. Verkrijgen van een 384-wells plaat en aanwijzen putten voor de controles (geen PAD4), testputten (+ PAD4), en remming putten (PAD4 + Cl-amidine).
  7. Pipetteer 25 ul van Solution C in testputten en pipet 25 ul van Solution D in controle putten. Laat buffer met / zonder PAD4 geïncubeerd in putjes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Pipetteer 10 ul van oplossing B in remming putjes en incubeer gedurende 20 minuten bij RTE.
  9. Pipetteer 15 ul oplossing A in ieder putje en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
  10. Pipetteer 10 ul van oplossing E aan alle putjes. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  11. Verkrijgen van een fluorescentieaflezing op een multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm.

7. ruwe cellysaat Assaybij KT

  1. Na het oogsten van cellen van PAD4 1 L groei, resuspendeer cellen in 10 ml van 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF, MW 174,94 g / mol) en 1 mM dithiothreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8.0.
  2. Lyseren de cellen via sonicatie gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Centrifugeer het cellysaat bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 0 ° C. Concentreer de heldere supernatant helft van het volume door centrifugatie bij 4000 rpm bij 4 ° C met 100k MW cut-off centrifugebuizen.
  3. Van 10 mM ZRcoum voorraad, bereiden een 250 uM oplossing van ZRcoum in water. Deze 250 uM ZRcoum oplossing zal Oplossing A. zijn
  4. Bereid een buffer van 100 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM CaCl2 en 2 mM TCEP (pH = 8,0). Dit zal Solution B.
  5. Weeg Trypsine kristallijn (van bovine pancreas) en stelt een 10 mg / ml in 100 mM EDTA. Meng de oplossing totdat duidelijk en bewaar bij -20 ° C. Dit zal Solution C.
  6. Verkrijgen van een zwarte 384-well plaat en designaten putten voor de controles (geen cellysaat) en testputten (+ cellysaat).
  7. Pipetteer 100 ul van oplossing B in ieder putje en pipet 60 ul cellysaat in testputjes. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Pipetteer 40 ul oplossing A in ieder putje en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Pipetteer 10 ul van oplossing C aan alle putjes. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
  10. Verkrijgen van een fluorescentieaflezing van multimodale reader met een excitatiegolflengte van 345 nm en een emissiegolflengte van 465 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aanvankelijk werd aangetoond dat ZRcoum kunnen over de activiteit van PAD4 in een 96-well plaat formaat. Putjes werden geïncubeerd met het substraat ZRcoum en in de aanwezigheid / afwezigheid van PAD4. Na een incubatieperiode van 45 min bij 37 ° C, werd de fluorescentie gemeten met een 340/40 - 475/15 nm filter (Figuur 2A). Zoals verwacht bleven fluorescentie vanaf de fluorofoor binnen ZRcoum (of citrullinated ZRcoum) bleef in de vergrendelde toestand. Na toevoeging van overmaat trypsine / EDTA oplossing, de fluoroforen zijn bevrijd van ZRcoum maar bleven grotendeels onveranderd in aanwezigheid van PAD4. De toevoeging van EDTA is bedoeld om te helpen bij de beëindiging van de reactie PAD4 vanwege zijn vermogen om de noodzakelijke calcium cheleren. Uit deze gegevens werd een 5,2-voudige afname in fluorescentie productie waargenomen in aanwezigheid van PAD4. Vervolgens, de compatibility van de nieuw ontwikkelde test met high-throughput screening platforms aangetoond. Het was vooral aan vier reactie variabelen die het meest gunstig zijn voor screening zou (1) en de verdere miniaturisatie van het testvolume (2) de mogelijkheid van het uitvoeren van de test bij kamertemperatuur (3) de stabiliteit van het eiwit en buffermengsel voorafgaand aan het invullen van de test en (4) de mogelijke storing van organische oplosmiddelen / reinigingsmiddelen.

Voor mid- of high-throughput screening inspanningen worden hoge dichtheid putjes gewoonlijk gebruikt in kleine molecule schermen. Geverifieerd werd dat de test bijna identiek kunnen worden uitgevoerd in een 384-well plaat in vergelijking met een 96-well plaat (Figuur 2B). Verder bepalen van de werkomstandigheden voor de test in een high-throughput formaat, was het belangrijk om te onderzoeken of PAD4 kan worden geregistreerd in een redelijke termijn bij kamertemperatuur. Aangezien niet alle vloeistofverwerking instrumenteneen temperatuurregelaar, kan het lastig en kostbaar om een ​​incubatiestap bij verhoogde temperatuur zijn geworden. Bovendien, goed voor schommelingen in de temperatuur kan een oorzaak zijn voor de discrepantie tussen de platen en de runs zijn. Om het effect van de lagere temperaturen voor de hier beschreven test bepalen, werd een vergelijkbare analyse uitgevoerd bij kamertemperatuur. Gevonden werd dat de signalen nagenoeg onveranderd tussen 37 ° C en kamertemperatuur (Figuur 3). Om de assay prestatie verder optimaliseren door het minimaliseren van de vereiste incubatietijd tussen PAD4 en het substraat, de kinetiek van de reactie werd geanalyseerd. PAD4 activiteit werd in de tijd gevolgd, zowel bij kamertemperatuur en 37 ° C. Zoals verwacht blijkt dat PAD4 actiever bij 37 ° C (met de menselijke fysiologische temperatuur) met de reactie bijna compleet door 20 min. Bevredigende wordt de reactie niet sterk beïnvloed door de afname van temperatuur tot kamertemperatuur. De reactie verloopt bij ongeveer de halve snelheid in hetverhoogde temperatuur en in hoofdzaak volledig 40-45 minuten na initiatie. Van het tijdsverloop analyses werden kinetiek constanten berekend en de parameters (K M = 397 uM, k cat = 2,98 sec -1, k cat / K M = 7400 sec -1 M -1) bleken vergelijkbaar met andere PAD4 zijn substraten. 31 Met de kinetiek van de reactie gekenmerkt werden alle volgende assays verminderd tot 1 uur van het begin tot het meetpunt.

Vervolgens stabiliteit van PAD4 werd geëvalueerd toen opgelost in de reactiebuffer gedurende een langdurige tijdsperiode. Realistisch zal high-throughput screening vereisen reagentia algemeen stabiel gedurende vele uren terwijl het instrument voltooit het scherm. Indien bepaalde reagentia relatief houdbaarheid minuten, kan het vrij duur en tijdrovend om het scherm te beëindigen teneinde een nieuwe reagentia te bereiden. Afhankelijk van de testomstandigheden is nietongebruikelijk voor sommige testen onverenigbaar zijn met high-throughput screening om deze reden. Met dit voor ogen, werd de stabiliteit van PAD4 in buffer gevolgd gedurende meerdere uren. Bijna geen verlies van enzymatische activiteit werd waargenomen gedurende de periode, daarmee aangevend dat het eiwit stabiel zelfs na zitten bij kamertemperatuur gedurende 15 uur (Figuur 4A). Vervolgens werd onderzocht of de test uitgevoerd onder geminiaturiseerde omstandigheden en bij kamertemperatuur nog steeds adequaat zou bij de aanwezigheid van een PAD4. Na de incubatie van de bekende PAD4 inhibitor, chloroamidine (Cl-amidine), leidde tot een volledig herstel van het fluorescentiesignaal in overeenstemming met de volledige remming van PAD4 (figuur 4B). Tenslotte werd ook vastgesteld dat de aanwezigheid van het organische oplosmiddel DMSO, gewoonlijk in voorraadoplossingen van kleine moleculen tot 3% als eindvolume niet interfereren met de assay (data niet getoond). Ook de toevoeging van 0,01% Triton X-100 resulteerde in similar fluorescentie trends (gegevens niet getoond).

Heeft aangetoond dat de test tolerant voor verschillende aandoeningen die typisch worden aangetroffen in kleine molecule drug discovery activiteiten werd een eerste screening van 80 verbindingen uitgevoerd en een stabielere Z "waarde van 0,71 werd geïdentificeerd. Het bevorderen van de mogelijkheid van de test, de selectiviteit van de PAD4 / ZRcoum reactiemengsel werd benadrukt door het uitvoeren van de reactie in ruwe lysaten van gehele cellen. E. coli-cellen die het GST-PAD4 expressievector werd geïnduceerd met IPTG, vergelijkbaar met de procedure voor de isolatie van GST-PAD4. Na de verstoring van het celmembraan via sonicatie werd de celresten door centrifugeren om een ​​geklaarde cellysaat verkregen. Wanneer de PAD4 bevattende cellysaat dezelfde testomstandigheden voorgesteld, als gezuiverde GST-PAD4 assay, het fluorescentiesignaal gevarieerd in overeenstemming met de aanwezigheid van actieve PAD4 in oplossing ( > Figuur 5). Cellysaten bevatten een aantal biomacromoleculen bij hoge concentraties die mogelijk zou kunnen interfereren met de activiteit van PAD4, de fluorescerende eigenschappen van ZRcoum, en de trypsine stap. De bevinding dat de assay was functioneel in ruwe cellysaten geeft aan dat er een hoge selectiviteit in de reactie tussen PAD4 en ZRcoum. Om verder aan te tonen dat het signaal daling in aanwezigheid van ruwe cellysaten specifiek was voor de aanwezigheid van actieve PAD4, het effect van Cl-amidine, een gevestigde covalente PAD4 remmer, werd geëvalueerd. De toevoeging van Cl-amidine tot een herstel in het fluorescentiesignaal, in overeenstemming met de inactivatie van PAD4 (figuur 5). Samen werd aangetoond de test kan verder worden vereenvoudigd door gebruik ruwe cellysaten voor het toezicht PAD4 activiteit.

2114 / 52114fig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 1. PAD4 en het ontwerp van zijn fluorescentie gebaseerde test. (A) Cartoon afbeelding van de histon-assemblages die deel uitmaken van de basiseenheid van een nucleosomen. PAD4 katalyseert de citrullinatie van een aantal arginine residuen op histon eiwitten. (B) ZRcoum bedekt met de inheemse substraat (verborgen voor de duidelijkheid) van PAD4 (toetreding code 2DW5). (C) Weergave van de stappen in een typisch PAD4 assay. Citrullinatie door PAD4 van het substraat ZRcoum vermindert de gevoeligheid voor trypsine-gemedieerde amidehydrolyse, waardoor een verandering in de fluorescentie niveaus. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Figuur 2 Figuur 2. PAD4 assay 96-wells en 384-well plaat formaat. De fluorescentie werd gemeten (excitatie 345 nm / emissie 465 nm) zowel een 96-well formaat (A) en 384 putjes (B) bij de aangegeven voorwaarden (37 ° C). De toevoeging van protease trypsine leidt tot een grote toename in fluorescentie niveaus waterloze PAD4 en blijft vrijwel onveranderd voor putten met PAD4. De gegevens zijn weergegeven als gemiddelde + SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. Tijdsverloop analyse van PAD4 assay. De fluorescentie werd gemeten (excitatie 345 nm / emissie 465 nm) periodiek in een 96-well plaat formaat over 70 min met het eiwit wordt geïncubeerd ofwel bij 37° C (A) of bij kamertemperatuur (B). De gegevens zijn weergegeven als gemiddelde +/- SD (n = 3). Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Eiwit stabiliteit en remming. (A) Activiteit van PAD4 werd gemeten na de aangegeven tijdsintervallen. Ter vergelijking worden de fluorescentie niveaus die in de afwezigheid van PAD4. Fluorescentieniveaus weergegeven stand (rood) en na (groene) toevoeging van trypsine. (B) Introductie van de bekende PAD4 remmer Cl-amidine (100 uM) leidde tot een herstel van het fluorescentiesignaal in een 384-well plaat formaat bij kamertemperatuur. Fluorescentieniveaus weergegeven stand (rood) en na (groene) toevoeging van trypsine. Alle gegevens zijn VERTEGEnted als gemiddelde +/- SD (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. ruwe cellysaat assay. De test werd uitgevoerd in de afwezigheid en aanwezigheid van ruwe cellysaten in een 384-well plaat formaat bij kamertemperatuur. Fluorescentieniveaus weergegeven stand (rood) en na (groene) toevoeging van trypsine. Cl-amidine (100 uM) veroorzaakte ook een toename in fluorescentie signaal onder deze omstandigheden. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde +/- SD (n = 3). Klik hier voor een grotere versie van de afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

Chemie PAD4 PADI4 citrullinatie arginine post-translationele modificatie HTS assay fluorescentie citrulline
Fluorescentie gebaseerde Monitoring van PAD4 activiteit via een Pro-fluorescentie Substrate Analog
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter