Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

يتم تعديل عدد كبير من البروتينات الثدييات بشكل كبير بفعل الإنزيمات التالية الحيوي من البروتينات التي الريبوسوم. ويمكن لهذه التعديلات بعد متعدية (PTMs) زيادة كبيرة في التنوع الوظيفي للبروتيوم عن طريق تغيير حجم، وتهمة، وهيكل، والدولة oligomerization (من بين الميزات الأخرى) البروتينات 1-3. ونتيجة لذلك، فإن التغيير في بنية البروتين يمكن أن يؤدي إلى عواقب فيزيولوجية، مثل تدهور البروتين، التمايز الخلوي، مما يشير، في تعديل التعبير الجيني، وتفاعلات البروتين البروتين. في حين أن هذه التعديلات هي السائدة في نسبة كبيرة من جميع البروتينات البشرية، ومحطة تنتهي في البروتينات هيستون الخضوع لعدد كبير بشكل غير عادي من التعديلات التساهمية 4. البروتينات هيستون هي عائلة من البروتينات الهيكلية التي تسهل التكثيف من الحمض النووي الجيني. وتجرى التعديلات التساهمية من ذيول هيستون غير منظم بها وينظمها دوري الدرجة الاولى الايطاليS من الانزيمات التي يمكن أن تحفز تعديل التساهمية المخلفات (الكتاب)، عكس نفس التعديلات (المحايات)، والتمييز بين التغييرات التي مطبوع على الذيول هيستون (القراء) 5-7. في الواقع، فإن معظم PTMs معروفة يمكن ملاحظتها ضمن هذه الشريحة قصيرة من هيستون بما مثيلة، الفسفرة، أستلة، sumoylation، ubiquitination، وcitrullination 8.

Citrullination ينطوي على تحويل ببتيديل أرجينين إلى غير المشفرة ببتيديل ر RNA-سيترولين (الشكل 1A). البروتينات المسؤولة عن هذه السلسلة تحييد الجانب، هم أعضاء في PAD (ص eptide على rginine د eiminase) عائلة بروتين، وكلها تعتمد على الانزيمات الكالسيوم. 9،10. حتى الآن، وقد وصفت خمسة أفراد من عائلة PAD (PAD1، PAD2، PAD3، PAD4، وPAD6). يبدو أن كل عضو من أعضاء هذه الأسرة لاستهداف البروتينات الخلوية متميزة وأيضا يعرض أحاديكيو ملامح توزيع الأنسجة. PAD4 هو العضو الوحيد من هذه العائلة البروتين المعروف أن تكون مترجمة داخل النواة عبر تسلسل توطين النووية 11. تبعا لذلك، فقد تبين أن deiminate عددا من الأهداف النووية، بما في ذلك السلاسل الجانبية أرجينين على ذيول N-الطرفية من الهستونات H2A أرجينين بقايا 3 (H2R3)، H3 (H3R2، H3R17، وH3R26) وH4 (H4R3) 12، 13. في حين أن كل من isozymes PAD لها وظائف فسيولوجية معينة وحاسمة، تلقت PAD4 إيلاءها مزيدا من الاهتمام نظرا لدوره في عدد من العمليات الإنسانية في كل الخلايا المريضة والسليمة. في الآونة الأخيرة، وقد تبين PAD4 أن تكون عضوا في شبكة النسخي تعدد القدرات 14. وعرضت كل من مستويات التعبير PAD4 والنشاط لتكون مرتفعة خلال إعادة برمجة وللدولة الارض الدول المحفزة في الفئران. عن طريق التحكم في تنظيم جينات الخلايا الجذعية، قد PAD4 الاحتفاظ دورا محوريا في كفاءة إعادة برمجة الخلايا. PAD4 كما تم المتورطين فيتشكيل الفخاخ خارج الخلية المتعادلة، التي تقوم عليها ملزمة من مسببات الأمراض تمكين إزالة النظام الخاص بهم. وhypercitrullination من البروتينات هيستون من قبل PAD4 يدفع decondensation من لونين، والتي هي بمثابة المادة الأساسية للتغليف من البكتيريا المسببة للأمراض من فخ خارج الخلية، وبالتالي درء العدوى البكتيرية 15،16.

بالإضافة إلى ذلك، تم العثور PAD4 للعب دور نشط في عدد من الأمراض التي تصيب الإنسان. وقد تبين سابقا أن التعبير المنحرف من PAD4 يرتبط مع بداية وشدة التهاب المفاصل الروماتويدي، مرض الزهايمر، مرض باركنسون، والتصلب المتعدد 17. في الواقع، فإن وجود الأجسام المضادة بروتين مكافحة citrullinated هو واحد من المؤشرات الحيوية التشخيصية والنذير الأكثر موثوقية ونهائية من التهاب المفاصل الروماتويدي 18. وبالمثل، فقد لوحظ مؤخرا نشاط PAD4 dysregulated في عدد من السرطانات البشرية بما في ذلك المبيض والثدي والرئة، وسرطان المريء د 19-22. وقد تبين الصلة بين PAD4 والسرطان إلى أن توسطت من خلال الجين الورمي ELK1 أو عبر الورم البروتين p53 البروتين القامع 22،23، واقترح العمل السابق الذي PAD4 يمكن أن تكون مضادة للسرطان الهدف العلاجي رواية 17،24،25. كدليل على دراسة المبدأ، تم الكشف عن نضوب PAD4 عبر shRNA في القولون والمستقيم خط الخلايا السرطانية HCT116 أن تكون كافية لإحداث موت الخلايا المبرمج ودورة الخلية اعتقال 26. أدى ضعت مؤخرا لا رجعة فيه PAD4 المانع إلى انخفاض سبعين في المئة في كتلة الورم في الفئران (27). بشكل ملحوظ جدا، ويبدو PAD4 تثبيط لتكون بمثابة العلاج المستهدفة التي أسفرت عن مقتل الانتقائي للخلايا السرطانية في حين أن يجنب الخلايا untransformed.

استخدام جزيئات صغيرة لإيقاف وظيفة PAD4 قد يثبت أنه استراتيجية جديدة وقوية لاستهداف الخلايا السرطانية أو لزيادة مبحث المعالجة الكيميائية السرطانية الموجودة 28. للأسف، صوبعد أن اكتشف خيمة PAD4 عكسها المانع. وقد تم تطوير عدد من مثبطات التساهمية باستخدام الكلور / مقبض imidine الفلوري الذي يحاكي الركيزة أرجينين 27،29،30 وأثبتت أنها أدوات عملية في فهم دور PAD4 في كل خلايا الدولة السليمة والمريضة. ومع ذلك، هذه الجزيئات تمنع كل من منصات نشطة مع قوة مماثلة. وبالتالي، فإن الحاجة لفحص سطحي التي تفيد عن نشاط PAD4 أمر بالغ الأهمية. حتى الآن، وقد وصفت PAD4 المقايسات التي تربط الإفراج عن الأمونيا من رد الفعل إلى قراءات اللونية 31، الاستفادة من التناظرية chloroamidine الركيزة fluorescently المسمى لمضان الاستقطاب فحص 32، تعتمد على رد فعل حمض بمساعدة بين الجليوآسال وسيترولين 33، و زوجان النشاط PAD4 إلى مضان dequenching خطوة 34. من هذه، وقد أثبتت هذه الاستراتيجية haloacetamidine معدل التساهمية فقط لتكون متوافقة مع scre عالية الإنتاجيةمنصات ملمسه 32،35،36. نحن تصف فحص سطحي مضان القائم الذي يقيس موثوق نشاط PAD4. الفحص، الذي يعرض نسبة قوية إشارة إلى الضجيج، وسرعة تحليلها، وقياس متانة، لديه القدرة على اكتشاف قوية وانتقائية حقا PAD4 المانع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 التحول، والتعبير، وتنقية

  1. لPAD4 التحول، وتحويل البلازميد pGEX تحتوي PAD4 GST الانصهار داخل المختصة كيميائيا E. القولونية (BL21 (DE3)) خلايا للتعبير البروتين باستخدام الإجراء التالي. إعداد المختصة كيميائيا (كلوريد الكالسيوم) E. القولونية (BL21 (DE3)) الخلايا وفقا للبروتوكولات القياسية.
    1. ذوبان الجليد 50 ميكرولتر من معدة مسبقا BL21 المختصة كيميائيا (DE3) الخلايا على الجليد وتخلط مع 1 ميكرولتر من البلازميد pGEX تحتوي PAD4 الجينات في أنبوب ثقافة 5 مل. احتضان الخليط على الجليد لمدة 10 دقيقة في حين تهز بلطف كل 2 دقيقة.
    2. حرارة صدمة الخلايا عن طريق وضع الخليط في 42 ° C حمام الماء لمدة 40 ثانية. ضع الخليط على الفور خلية بلازميد مرة أخرى على الجليد لمدة 2 دقيقة للسماح للخلايا لاسترداد. إضافة 1 مل من معقم LB مرق إلى الخليط ووضعه على الجليد لمدة 1 دقيقة.
    3. احتضان حرارة الخلايا صدمت عند 37 درجة مئوية، والهز في 250 دورة في الدقيقة ل1ساعة. ماصة 75 ميكرولتر من الخلايا تحولت إلى لوحة آغار مقاومة الأمبيسلين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 ساعة. متجر لوحة في 4 درجات مئوية.
  2. PAD4 التعبير.
    1. 1 اختيار مستعمرة BL21 (DE3) خلايا من لوحة الأمبيسلين أجار ومكان في 5 مل من LB تحتوي على 1X الأمبيسلين. مكان في الحاضنة ويهز O / N عند 37 درجة مئوية.
    2. نقل 5 مل من LB (كاتب) في 1 لتر من LB العقيمة التي تحتوي على 1X الأمبيسلين هيدرات (MW 403.45 جم / مول). نمو مكان في هز حاضنة 37 درجة مئوية. مراقبة OD 600 من النمو. عندما يصل النمو إلى OD 600 من 0.3، تحرك النمو إلى 16 درجة مئوية تهز الحاضنة.
    3. على التوصل الى OD 600 من 0.6، لحث الخلايا مع 0.3 ملي isopropylthiagalactoside (IPTG، MW 238.30 جم / مول). السماح للخلايا ليهز لمدة 15 ساعة على 16 درجة مئوية.
    4. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 0 درجة مئوية. تخلصي من طاف وتخزين بيليه في -80 درجة مئوية.
  3. PAD4 تنقية
    1. إعادة تعليق بيليه الذي يحتوي على PAD4 أعرب في BL21 (DE3) الخلايا في منطقة عازلة من 50 ملي مول كلوريد الصوديوم (MW 58.44 غرام / مول)، و 300 ملي ناه 2 ص 4 (MW 119.98 جم / مول)، 10 ملي إيميدازول (MW 68.077 ز / مول)، 0.1 ملي phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF، MW 174.94 جم / مول) و 1 ملي dithiothreitol (DTT، 154.25 جم / مول)، ودرجة الحموضة = 8.0.
    2. ليز الخلايا عبر صوتنة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. بعد صوتنة، جهاز طرد مركزي لالمحللة خلية في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 0 درجة مئوية. تخلصي وحفظ طاف. دفعة طاف مع الجلوتاثيون (GSH) حبات الاغاروز لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. استنزاف طاف من الخرز GST / عمود عن طريق الجاذبية. تغسل حبات مع 4 × 25 مل من 1X PBS (الفوسفات مخزنة المالحة، ودرجة الحموضة = 8.0) في RT.
    4. أزل PAD4 مع 2 × 10 مل شطف العازلة، 50 ملي تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس قاعدة، MW 121.14 جم / مول)، 10 ملي الجلوتاثيون (GSH، MW 307.32 جم / مول)، ودرجة الحموضة = 8.0.
    5. التركيز PAD4 باستخدام 100K ميغاواط قطع سأنابيب الطرد المركزي وما يليها والطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. البروتين قسامة في 200 ميكرولتر في حجم 1.0 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية.

2. إعداد حلول للسهم المخازن

  1. تزن من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم، MW 58.44 غرام / مول) وإعداد الحل 2 M. مزيج حتى حل واضح.
  2. تزن من تريس (hydroxymethyl) aminomethane (تريس قاعدة، MW 121.14 جم / مول) وإعداد 2 M حل، ودرجة الحموضة = 8.0. مزيج حتى حل واضح.
  3. تزن خارج ثنائي الهيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl 2 2H 2 O، MW 147.01 جم / مول) وإعداد 500 ملي حل. مزيج حتى حل واضح.
  4. تزن من تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP، MW 250.19 جم / مول) وإعداد 200 ملي حل. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  5. تزن خارج dithiothreitol (DTT، MW 154.25 جم / مول) وإعداد محلول 1 M. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  6. إعدادحل 0.5٪ من تريتون X-100.
  7. تزن من حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA، MW 292.24 جم / مول) وإعداد 100 ملي حل. مزيج حتى حل واضح.
  8. تزن خارج Z- Arg- Arg- 7- جذر الأميدو 4- methylcoumarin هيدروكلوريد (ZRcoum، MW 621.69 جم / مول) وإعداد حل 10 ملم في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO).

3. PAD4 الفحص عند 37 درجة مئوية

  1. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 125 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل 125 ميكرومتر ZRcoum يكون الحل A.
  2. تعد منطقة عازلة من 62.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 62.5 ملي تريس، 12.5 ملي CaCl 2، 6.25 ملي DTT، و 5 ميكرومتر PAD4 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل B.
  3. تعد منطقة عازلة من 62.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 62.5 ملي تريس، 12.5 ملي CaCl 2، و 6.25 ملي DTT (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل C.
  4. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20° C. سوف يكون هذا الحل D.
  5. الحصول على لوحة 96-جيدا وتعيين عدد من الآبار لضوابط (أي PAD4) واختبار الآبار (+ PAD4).
  6. ماصة 160 ميكرولتر من الحل ب في آبار الاختبار وماصة 160 ميكرولتر من محلول C في آبار المراقبة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. ماصة 40 ميكرولتر من الحل وإلى جميع الآبار واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  8. ماصة 10 ميكرولتر من 2 O درهم إلى نصف آبار المراقبة ونصف من آبار الاختبار. إلى النصف الآخر من آبار المراقبة وضوابط الاختبار، ماصة 10 ميكرولتر من الحل D. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  9. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

4. PAD4 الفحص في RT

  1. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 50 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل ZRcoum 50 ميكرومتر يكون الحل A.
  2. تعد منطقة عازلة من 100 ملي ناCL 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، 2 مم TCEP، 0.02٪ تريتون X-100، و 8 ميكرومتر PAD4 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل B.
  3. تعد منطقة عازلة من 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، 2 مم TCEP، و 0.02٪ تريتون X-100 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل C.
  4. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية. سوف يكون هذا الحل D.
  5. الحصول على 384 لوحة جيدا وتعيين آبار للضوابط (لا PAD4) واختبار الآبار (+ PAD4).
  6. ماصة 25 ميكرولتر من الحل ب في آبار الاختبار وماصة 25 ميكرولتر من الحل C في آبار المراقبة. السماح عازلة مع / بدون PAD4 لاحتضان في الآبار لمدة 20 دقيقة في RT.
  7. ماصة 25 ميكرولتر من الحل C في جميع الآبار واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT.
  8. ماصة 10 ميكرولتر من 2 O درهم إلى نصف آبار المراقبة ونصف من آبار الاختبار. إلى النصف الآخر من آبار المراقبة وضوابط الاختبار، pipettه 10 ميكرولتر من الحل D. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  9. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

5. PAD4 الوقت فحوصات دورة في 37 درجة مئوية وRT

  1. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 125 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل 125 ميكرومتر ZRcoum يكون الحل A.
  2. تعد منطقة عازلة من 62.5 ملي مول كلوريد الصوديوم، 62.5 ملي تريس، 12.5 ملي CaCl 2، 6.25 ملي DTT، و 5 ميكرومتر PAD4 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل B.
  3. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية. سوف يكون هذا الحل C.
  4. 2 الحصول على لوحات 96-جيدا والماصة 160 ميكرولتر من محلول B في كمية # الآبار (آبار # سوف يعتمد على مدى العديد من النقاط الزمنية).
  5. احتضان لوحة واحدة 96-جيدا عند 37 درجة مئوية. احتضان الأخرى 96 لوحة جيدا في RT.
  6. بذرةETTE 40 ميكرولتر من الحل وإلى جميع الآبار في كل من لوحات 96-جيدا وعلى الفور ماصة 10 ميكرولتر من الحل C في الآبار ر = 0 دقيقة. الاستمرار بإضافة 10 ميكرولتر من الحل C في نقطة زمنية محددة حتى يتم تطفئ جميع الآبار.
  7. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

6. PAD4 تثبيط الفحص في RT

  1. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 83 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل ZRcoum 83 ميكرومتر يكون الحل A.
  2. تزن خارج CL-أميدين (MW 424.8 غرام / مول) وإعداد محلول المخزون 100 ميكرومتر. سوف يكون هذا الحل B.
  3. تعد منطقة عازلة من 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، 2 مم TCEP، 0.02٪ تريتون X-100، و 8 ميكرومتر PAD4 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل C.
  4. تعد منطقة عازلة من 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، 2 مم TCEP، و 0.02٪ تريتون X-100 (الرقم الهيدروجيني = 8.0). عشرهو سيكون الحل D.
  5. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية. سوف يكون هذا الحل E.
  6. الحصول على 384 لوحة جيدا وتعيين آبار للضوابط (لا PAD4)، آبار اختبار (+ PAD4)، والآبار تثبيط (PAD4 + CL-أميدين).
  7. ماصة 25 ميكرولتر من الحل C في آبار الاختبار وماصة 25 ميكرولتر من الحل D في آبار المراقبة. السماح عازلة مع / بدون PAD4 لاحتضان في الآبار لمدة 20 دقيقة في RT.
  8. ماصة 10 ميكرولتر من الحل ب في آبار تثبيط واحتضان لمدة 20 دقيقة في RTE.
  9. ماصة 15 ميكرولتر من الحل وإلى جميع الآبار واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT.
  10. ماصة 10 ميكرولتر من الحل E لجميع الآبار. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  11. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

7. خلية الخام المحللة الفحصفي RT

  1. بعد حصاد الخلايا من النمو PAD4 1 لتر، وخلايا resuspend في 10 مل من 50 ملي تريس، 50 مم كلوريد الصوديوم، 0.1 ملي phenylmethylsulfonyl الفلورايد (PMSF، MW 174.94 جم / مول) و 1 ملي dithiothreitol (DTT، 154.25 جم / مول)، ودرجة الحموضة = 8.0.
  2. ليز الخلايا عبر صوتنة لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الخلية المحللة في 20000 x ج لمدة 20 دقيقة عند 0 درجة مئوية. تركيز طاف واضحة إلى نصف حجم بواسطة الطرد المركزي عند 4000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية باستخدام 100K ميغاواط قطع أنابيب الطرد المركزي.
  3. من 10 ملي ZRcoum الأوراق المالية، وإعداد حل 250 ميكرومتر من ZRcoum في الماء. وهذا الحل 250 ميكرومتر ZRcoum يكون الحل A.
  4. تعد منطقة عازلة من 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 100 ملي تريس و 20 ملي CaCl 2، و 2 ملي TCEP (الرقم الهيدروجيني = 8.0). سوف يكون هذا الحل B.
  5. تزن خارج التربسين، البلورية (من البنكرياس البقري) وإعداد 10 ملغ / مل في 100 ملي EDTA. مزيج حتى حل واضح وتخزينها في -20 درجة مئوية. سوف يكون هذا الحل C.
  6. الحصول السوداء لوحة 384 جيدا والتصميمأكل الآبار للضوابط (لا المحللة الخلية) واختبار الآبار (+ المحللة الخلية).
  7. ماصة 100 ميكرولتر من الحل ب في جميع الآبار وماصة 60 ميكرولتر من المحللة خلية في آبار الاختبار. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT.
  8. ماصة 40 ميكرولتر من الحل وإلى جميع الآبار واحتضان لمدة 45 دقيقة في RT.
  9. ماصة 10 ميكرولتر من الحل C لجميع الآبار. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  10. الحصول على مضان القراءة على قارئ متعدد الوسائط مع الطول الموجي من 345 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 465 نانومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في البداية، وقد تبين أن ZRcoum يمكن أن تقدم تقريرا عن نشاط PAD4 في شكل لوحة 96-جيدا. حضنت الآبار مع ZRcoum الركيزة وحضور / غياب PAD4. بعد فترة حضانة المرض من 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وقد تم قياس مضان مع 340/40 - 475/15 نانومتر مرشح (الشكل 2A). كما هو متوقع، ظلت مستويات منخفضة مضان كما fluorophore داخل ZRcoum (أو citrullinated ZRcoum) ظلت في حالة تأمين. عند إضافة فائض التربسين / EDTA إلى حل، كانت fluorophores المحررة من ZRcoum لكن ظلت دون تغيير في الغالب في وجود PAD4. والمقصود إضافة EDTA للمساعدة في وقف رد الفعل PAD4 نظرا لقدرته على خلابة أيونات الكالسيوم الضرورية. من هذه المعطيات، لوحظ وجود انخفاض 5.2 أضعاف في الناتج مضان في وجود PAD4. المقبلة، شركاتوقد تجلى atibility للمقايسة وضعت حديثا مع منصات الفرز الفائق الإنتاجية. كان من مصلحة الأولية لتحليل أربعة متغيرات ردود الفعل التي ستكون الأكثر ملاءمة لأغراض الفحص (1) التصغير مزيد من حجم فحص (2) إمكانية إجراء الفحص في RT (3) استقرار البروتين وعازلة الخليط قبل الانتهاء من فحص و(4) أي تشويش محتمل من المذيبات العضوية / المنظفات.

لمنتصف أو جهود الفرز الفائق الإنتاجية، وتستخدم عالية الكثافة لوحات جيدة عادة في شاشات جزيء صغير. تم التحقق من أن الفحص يمكن إجراء مماثل تقريبا في لوحة 384 كذلك مقارنة لوحة 96-جيدا (الشكل 2B). في مواصلة تحديد ظروف العمل للفحص في شكل عالية الإنتاجية، كان من المهم للتحقيق في ما إذا كان النشاط PAD4 يمكن رصدها في إطار زمني معقول في RT. منذ ليس كل أدوات التعامل مع السائل لهاوحدة تحكم في درجة الحرارة، فإنه يمكن أن تصبح مرهقة ومكلفة أن يكون خطوة حضانة في درجة حرارة مرتفعة. وعلاوة على ذلك، وهو ما يمثل تذبذب في درجات الحرارة يمكن أن تكون سببا للاختلاف بين لوحات وأشواط. من أجل تحديد تأثير درجات الحرارة المنخفضة للمقايسة الموصوفة هنا، تم إجراء فحص مماثل في RT. وقد وجد أن الإشارات لم تتغير فعليا بين 37 درجة مئوية و RT (الشكل 3). لزيادة تحسين أداء الفحص عن طريق التقليل من فترة حضانة المطلوب بين PAD4 والركيزة، تم تحليل حركية التفاعل. وتم رصد النشاط PAD4 على مر الزمن سواء في RT و 37 درجة مئوية. كما هو متوقع، يبدو أن PAD4 هي أكثر نشاطا عند 37 درجة مئوية (بما يتفق مع درجة حرارة الفيزيولوجية البشرية) مع رد فعل معظمها قبل 20 دقيقة كاملة. ساتيسفيينجلي، لا يتأثر رد فعل قوي من الانخفاض في درجة الحرارة إلى RT. رد فعل العائدات في حوالي نصف السرعة كما فيارتفاع درجة الحرارة وهي في جوهرها الكامل بعد 40-45 دقيقة بدء. من وقت يحلل بالطبع، تم حساب الثوابت الحركية وعثر المعلمات (K M = 397 ميكرومتر، ك القط = 2.98 ثانية -1، ك القط / ك M = 7400 ثانية -1 م -1) لتكون مشابهة لغيرها PAD4 ركائز. 31 مع حركية رد فعل يتسم، تم تخفيض جميع فحوصات لاحقة ل1 ساعة من البداية إلى نقطة القياس.

بعد ذلك، تم تقييم استقرار PAD4 عندما يذوب في المخزن المؤقت رد فعل على مدى فترة طويلة من الزمن. واقعيا، فإن الفرز الفائق الإنتاجية تتطلب الكواشف أن تكون مستقرة بشكل عام لعدة ساعات بينما الصك واستكمال الشاشة. إذا كان بعض الكواشف لها النسبية العمر الافتراضي للدقيقة، ويمكن أن تكون مكلفة للغاية وتستغرق وقتا طويلا لإنهاء الشاشة من أجل إعداد الكواشف جديدة. تبعا للظروف الفحص، فإنه ليسغير عادية لبعض المقايسات لتكون متوافقة مع ارتفاع الفحص من خلال وضع لهذا السبب بالذات. مع هذه الفكرة في الاعتبار، تم رصد استقرار PAD4 في المخزن لعدة ساعات. تقريبا لم يلاحظ أي خسارة في النشاط الأنزيمي طوال الفترة الزمنية، مما يشير إلى أن البروتين هو مستقر حتى بعد الجلوس في RT لأكثر من 15 ساعة (الشكل 4A). بعد ذلك، تم تقييم ما إذا كان الفحص تعمل تحت ظروف المنمنمة وعلى RT لا تزال الاستجابة بشكل ملائم لوجود PAD4. على حضانة المانع PAD4 معروف، chloroamidine (CL-أميدين)، أدت إلى استعادة كاملة للإشارة مضان تتفق مع التثبيط الكامل للPAD4 (الشكل 4B). أخيرا، تم التحقق أيضا من أن وجود المذيب DMSO العضوي، وتستخدم عادة في حلول الأوراق المالية من الجزيئات الصغيرة، وتصل إلى 3٪ حيث الحجم النهائي، لم تتدخل مع مقايسة (لا تظهر البيانات). وبالمثل، أدت إضافة 0.01٪ تريتون X-100 في سيمالاتجاهات مضان ILAR (لا تظهر البيانات).

بعد أن أظهرت أن الاختبار هو متسامح لمجموعة متنوعة من الظروف التي واجهت عادة في جهود الصغيرة اكتشاف جزيء المخدرات، أجري الفحص الأولي ل80 مركبات وتم تحديد Z 'قيمة قوية من 0.71. في تعزيز إمكانات الفحص، تم تسليط الضوء على الانتقائية من رد فعل PAD4 / ZRcoum بتنفيذ رد فعل في لست] خلية كاملة الخام. E. وقد حثت خلايا القولونية التي تحتوي على GST-PAD4 التعبير ناقلات مع IPTG، على غرار الإجراءات المتبعة لعزل GST-PAD4. بعد تعطيل غشاء الخلية عبر صوتنة، تم فصل البقايا الخلوية بواسطة الطرد المركزي لتحمل المحللة خلية توضيح. عندما قدمت الخلية المحللة التي تحتوي على PAD4 للشروط الفحص نفس النقي فحص GST-PAD4، إشارة مضان تختلف في اتفاق مع وجود نشط في حل PAD4 ( > الشكل 5). لست] خلية تحتوي على عدد من الجزيئات الكبيرة الحيوية بتركيزات عالية التي يمكن أن تتدخل مع نشاط PAD4، خصائص فلوري من ZRcoum، والخطوة التربسين. والنتيجة أن الفحص كان ظيفية في الخلية لست] الخام يشير إلى أن هناك انتقائية عالية في التفاعل بين PAD4 وZRcoum. لتثبت كذلك أن انخفاض إشارة بحضور لست] خلية بدائية كان محددا لوجود PAD4 نشطة، وتأثير CL-أميدين، وأنشئت التساهمية PAD4 المانع، تم تقييمها. إضافة CL-أميدين أدى إلى ترميم في إشارة مضان، بما يتفق مع تثبيط PAD4 (الشكل 5). معا، وقد تجلى ذلك الفحص يمكن تبسيطها من خلال استخدام مزيد من النفط الخام لست] خلية لرصد النشاط PAD4.

2114 / 52114fig1highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الشكل 1. PAD4 وتصميم الفحص القائم على مضان لها. (A) كارتون تمثيل الجمعيات هيستون التي تشكل الوحدة الأساسية للجسيم نووي. PAD4 يحفز citrullination عدد من بقايا أرجينين على البروتينات هيستون. (ب) ZRcoum مضافين مع الركيزة الأم (الخفية لوضوح) من PAD4 (رمز الانضمام 2DW5). (C) تمثيل الخطوات في PAD4 فحص نموذجي. Citrullination بواسطة PAD4 من ZRcoum الركيزة يقلل من قابليته للبوساطة التربسين أميد التحلل، وبالتالي التسبب في إحداث تغيير في مستويات مضان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2 الشكل 2. PAD4 فحص في 96 جيدا و384-جيدا لوحة الأشكال. وقد تم قياس الإسفار (345 نانومتر الإثارة / الانبعاث 465 نانومتر) في كل شكل 96-جيدا (A) وشكل 384-جيدا (ب) مع الشروط المعينة (37 درجة مئوية). إضافة البروتيني التربسين يؤدي إلى زيادة كبيرة في مستويات مضان في الآبار دون PAD4 وتبقى دون تغيير تقريبا للآبار مع PAD4. يتم تمثيل البيانات كما يعني + SD (ن = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
تم قياس الرقم 3. وقت تحليل مسار PAD4 الفحص. الإسفار (345 نانومتر الإثارة / انبعاث 465 نانومتر) بشكل دوري في شكل لوحة 96-جيدا أكثر من 70 دقيقة مع بروتين يتم تحضين إما في 37° C (A) أو على RT (B). يتم تمثيل البيانات كما يعني +/- SD (ن = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
وقد تم قياس الرقم 4. الاستقرار وتثبيط البروتين (أ) نشاط PAD4 بعد فترات زمنية معينة. للمقارنة، تظهر مستويات مضان في غياب PAD4. وتظهر مستويات مضان مسبق (الأحمر) وبعد (الخضراء) إضافة التربسين. بقيادة (ب) مقدمة من المعروف المانع PAD4 CL-أميدين (100 ميكرومتر) لاستعادة إشارة مضان في شكل لوحة 384 جيدا في RT. وتظهر مستويات مضان مسبق (الأحمر) وبعد (الخضراء) إضافة التربسين. جميع البيانات represented كما يعني +/- SD (ن = 3). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. خلية الخام المحللة الفحص. وقد أجريت الفحص في حال عدم وجود لست] خلية النفط الخام في شكل لوحة 384-جيدا في RT. وتظهر مستويات مضان مسبق (الأحمر) وبعد (الخضراء) إضافة التربسين. تسبب CL-أميدين (100 ميكرومتر) أيضا زيادة في إشارة مضان في ظل هذه الظروف. يتم تمثيل جميع البيانات كما يعني +/- SD (ن = 3). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

الكيمياء، العدد 93، PAD4، PADI4، citrullination، أرجينين، وتعديل ما بعد متعدية، HTS، الفحص، مضان، سيترولين
رصد القائم على مضان آخر PAD4 عبر برو-مضان الركيزة النظير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter