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Chemistry

एक समर्थक प्रतिदीप्ति सब्सट्रेट एनालॉग के माध्यम से PAD4 गतिविधि के प्रतिदीप्ति आधारित निगरानी

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

स्तनधारी प्रोटीन की एक बड़ी संख्या में भारी राइबोसोम से प्रोटीन के जैवसंश्लेषण निम्नलिखित एन्जाइम की क्रिया द्वारा संशोधित कर रहे हैं. ये बाद translational संशोधनों (PTMs) बहुत प्रोटीन 1-3 (अन्य सुविधाओं के बीच) आकार, प्रभारी, संरचना, और oligomerization राज्य बदलकर proteome के कार्यात्मक विविधता को बढ़ा सकते हैं. नतीजतन, प्रोटीन संरचना में परिवर्तन ऐसे प्रोटीन गिरावट, सेलुलर भेदभाव, सिगनल, जीन अभिव्यक्ति में मॉडुलन, और प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के रूप में शारीरिक परिणामों को जन्म दे सकता है. इन संशोधनों के सभी मानव प्रोटीन का एक बड़ा प्रतिशत में प्रचलित हैं जबकि हिस्टोन प्रोटीन सहसंयोजक संशोधनों 4 की एक असामान्य रूप से उच्च संख्या से गुजरना पर, टर्मिनल समाप्त होता है. हिस्टोन प्रोटीन जीनोमिक डीएनए के संघनन की सुविधा है कि संरचनात्मक प्रोटीन के एक परिवार के हैं. असंरचित हिस्टोन पूंछ के सहसंयोजक संशोधनों के एक वीडियो से बाहर ले गए और विनियमित रहे हैं, अवशेष (लेखकों) के सहसंयोजक संशोधन उत्प्रेरित ही संशोधनों (erasers) रिवर्स, और परिवर्तन के बीच भेद कर सकते हैं कि एंजाइमों के हिस्टोन पूंछ (पाठक) 5-7 पर अंकित किया जा रहा है. वास्तव में, जाना जाता PTMs की सबसे मेथिलिकरण, फास्फारिलीकरण, एसिटिलीकरण, sumoylation, ubiquitination, और citrullination 8 सहित हिस्टोन के इस छोटे खंड के भीतर देखा जा सकता है.

Citrullination गैर टी आरएनए इनकोडिंग peptidyl-citrulline (चित्रा 1 ए) के लिए peptidyl-arginine के रूपांतरण शामिल है. इस पक्ष श्रृंखला निराकरण के लिए जिम्मेदार प्रोटीन, पैड के सदस्य हैं कैल्शियम निर्भर एंजाइमों हैं जो सभी के लिए. 9,10, प्रोटीन परिवार (पी एक rginine डी eiminase eptide). तिथि करने के लिए, पैड परिवार के पांच सदस्यों (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, और PAD6) में वर्णित किया गया है. इस परिवार के प्रत्येक सदस्य अलग सेलुलर प्रोटीन लक्षित करने के लिए प्रकट होता है और भी विश्वविद्यालय को प्रदर्शित करता हैकुए ऊतक वितरण प्रोफाइल. PAD4 एक परमाणु स्थानीयकरण अनुक्रम 11 के माध्यम से नाभिक के भीतर स्थानीयकृत हो जाना इस प्रोटीन परिवार का ही सदस्य है. तदनुसार, यह हिस्टोन H2A arginine अवशेषों 3 के एन टर्मिनल पूंछ पर arginine पक्ष श्रृंखला (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, और H3R26) और एच 4 (H4R3) 12 सहित परमाणु ठिकानों की संख्या, deiminate दिखाया गया है, 13. पैड isozymes के प्रत्येक विशिष्ट और महत्वपूर्ण शारीरिक कार्य किया है, वहीं PAD4 कारण रोगग्रस्त और स्वस्थ कोशिकाओं दोनों में मानव प्रक्रियाओं की एक संख्या में अपनी भूमिका के लिए काफी अधिक ध्यान दिया गया है. हाल ही में, PAD4 pluripotency ट्रांस्क्रिप्शनल नेटवर्क 14 के एक सदस्य होना दिखाया गया था. दोनों PAD4 अभिव्यक्ति के स्तर और गतिविधि चूहों में reprogramming और जमीन राज्य pluripotent राज्यों दौरान ऊंचा होना दिखाया गया. स्टेम सेल जीन के विनियमन को नियंत्रित करके, PAD4 सेलुलर reprogramming दक्षता में एक निर्णायक भूमिका रखने सकता है. PAD4 भी में फंसा दिया गया हैपर रोगजनकों के बंधन जो न्युट्रोफिल कोशिकी जाल, के गठन के अपने सिस्टम निकासी कर सकें. PAD4 द्वारा हिस्टोन प्रोटीन का hypercitrullination इस प्रकार जीवाणु संक्रमण 15,16 बंद warding, कोशिकी जाल से रोगजनक बैक्टीरिया की encapsulation के लिए आधार सामग्री के रूप में कार्य करता है जो क्रोमेटिन के decondensation लाती है.

साथ ही, PAD4 मानव रोगों की संख्या में एक सक्रिय भूमिका निभाने के लिए पाया गया है. यह पहले से PAD4 की न्यायपालिका अभिव्यक्ति रुमेटी गठिया की शुरुआत को और गंभीरता के साथ जुड़ा हुआ है कि दिखाया गया है, अल्जाइमर, पार्किंसंस रोग, और एकाधिक काठिन्य 17. वास्तव में, विरोधी citrullinated प्रोटीन एंटीबॉडी की उपस्थिति संधिशोथ 18 की सबसे विश्वसनीय और निश्चित निदान और शकुन बायोमार्कर से एक है. इसी तरह, dysregulated PAD4 गतिविधि हाल ही में डिम्बग्रंथि, स्तन, फेफड़े, एक सहित मानव कैंसर की एक संख्या में देखा गया हैडी esophageal कैंसर 19-22. PAD4 और कैंसर के बीच लिंक p53 ट्यूमर शमन प्रोटीन 22,23 ELK1 ओंकोजीन के माध्यम से या के माध्यम से मध्यस्थता होना दिखाया गया है और पिछले काम PAD4 एक उपन्यास विरोधी कैंसर चिकित्सकीय लक्ष्य 17,24,25 हो सकता है कि सुझाव दिया गया है. सिद्धांत अध्ययन का एक सबूत के रूप में, कोलोरेक्टल कैंसर कोशिका लाइन HCT116 में shRNA के माध्यम से PAD4 की कमी apoptosis और सेल चक्र गिरफ्तारी 26 उत्प्रेरण के लिए पर्याप्त होने का पता चला था. हाल ही में विकसित अपरिवर्तनीय PAD4 अवरोध चूहों 27 में ट्यूमर जन में एक सत्तर प्रतिशत कमी आई. काफी उल्लेखनीय है, PAD4 निषेध untransformed कोशिकाओं बख्शते जबकि कैंसर कोशिकाओं के चुनिंदा हत्या के परिणामस्वरूप एक लक्षित चिकित्सा के रूप में कार्य करने के लिए दिखाई दिया.

PAD4 का कार्य बंद करने के लिए छोटे अणुओं का उपयोग कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए या मौजूदा कैंसर केमोथेरापी 28 को बढ़ाने के लिए एक शक्तिशाली नई रणनीति साबित हो सकता है. दुर्भाग्य से, एक POतम्बू प्रतिवर्ती PAD4 अवरोध अभी तक की खोज की जा गया है. सहसंयोजक अवरोधकों की संख्या arginine सब्सट्रेट 27,29,30 mimics और स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्य कोशिकाओं दोनों में PAD4 की भूमिका को समझने में व्यावहारिक उपकरण साबित किया है कि क्लोरो / फ्लोरो imidine संभाल का उपयोग कर विकसित किया गया है. हालांकि, इन अणुओं समान शक्ति के साथ सक्रिय पैड के सभी रोकना. इसलिए, PAD4 की गतिविधि पर रिपोर्ट है कि एक सतही परख के लिए जरूरत के लिए महत्वपूर्ण है. तिथि करने के लिए, PAD4 assays के एक वर्णमिति readout के 31 की प्रतिक्रिया से अमोनिया की रिहाई के लिए लिंक है कि वर्णित किया गया है, प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण परख 32 के लिए एक fluorescently लेबल chloroamidine सब्सट्रेट अनुरूप उपयोग glyoxal और citrulline 33 के बीच एसिड की सहायता की प्रतिक्रिया पर निर्भर है, और युगल कदम 34 dequenching एक प्रतिदीप्ति को PAD4 गतिविधि. इनमें से केवल सहसंयोजक संशोधक haloacetamidine रणनीति उच्च throughput scre साथ संगत साबित हो गया हैening प्लेटफार्मों 32,35,36. हम मज़बूती से PAD4 की गतिविधि उपाय है कि एक सतही प्रतिदीप्ति आधारित परख का वर्णन. एक मजबूत संकेत करने वाली शोर अनुपात, विश्लेषण की गति, और माप की मजबूती को प्रदर्शित करता है जो परख, वास्तव में एक शक्तिशाली और चयनात्मक PAD4 अवरोध की खोज करने की क्षमता है.

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Protocol

1. PAD4 परिवर्तन, अभिव्यक्ति, और शोधन

  1. PAD4 परिवर्तन के लिए, रासायनिक सक्षम ई में PAD4 जीएसटी संलयन युक्त pGEX प्लाज्मिड परिणत निम्नलिखित प्रक्रिया का उपयोग प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कोली (BL21 (DE3)) कोशिकाओं. रासायनिक सक्षम (कैल्शियम क्लोराइड) तैयार ई मानक प्रोटोकॉल के अनुसार कोली (BL21 (DE3)) कोशिकाओं.
    1. पहले से तैयार रासायनिक सक्षम BL21 (DE3) बर्फ पर कोशिकाओं के 50 μl पिघलना और एक 5 मिलीलीटर संस्कृति ट्यूब में PAD4 जीन युक्त pGEX प्लाज्मिड की 1 μl के साथ मिश्रण. धीरे हर 2 मिनट मिलाते हुए, जबकि 10 मिनट के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं.
    2. हीट 40 सेकंड के लिए एक 42 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मिश्रण रखकर कोशिकाओं को झटका. इसके तत्काल बाद कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए 2 मिनट के लिए वापस बर्फ पर सेल-प्लाज्मिड मिश्रण रखें. मिश्रण को बाँझ लेग शोरबा के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 1 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है.
    3. 1 के लिए 250 rpm पर मिलाते हुए, 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हैरान गर्मी सेतेघंटा. पिपेट 75 एक एम्पीसिलीन प्रतिरोधी अगर प्लेट पर रूपांतरित कोशिकाओं के μl और 15 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर थाली.
  2. PAD4 अभिव्यक्ति.
    1. 1x एम्पीसिलीन युक्त पौंड की 5 मिलीलीटर में एम्पीसिलीन अगर प्लेट और जगह से BL21 (DE3) कोशिकाओं की 1 कॉलोनी उठाओ. इनक्यूबेटर में प्लेस और 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन हिला.
    2. 1x एम्पीसिलीन trihydrate युक्त बाँझ पौंड (मेगावाट 403.45 छ / mol) का 1 एल में पौंड (स्टार्टर) के 5 मिलीलीटर स्थानांतरण. एक 37 डिग्री सेल्सियस मिलाते इनक्यूबेटर में जगह विकास. विकास के आयुध डिपो 600 मॉनिटर. विकास 600 0.3 के एक आयुध डिपो तक पहुँच जाता है, इनक्यूबेटर मिलाते हुए 16 डिग्री सेल्सियस में वृद्धि के लिए कदम.
    3. एक आयुध डिपो 0.6 की 600, 0.3 मिमी isopropylthiagalactoside (IPTG, मेगावाट 238.30 छ / mol) के साथ कोशिकाओं को उत्पन्न पहुंचने पर. कोशिकाओं 16 डिग्री सेल्सियस पर 15 घंटे के लिए हिला करने की अनुमति दें.
    4. 0 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4000 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं. -80 डिग्री सेल्सियस सतह पर तैरनेवाला और दुकान गोली डालो.
  3. PAD4 शोधन
    1. पुनः निलंबित 50 मिमी NaCl (मेगावाट 58.44 छ / mol) के एक बफर में कोशिकाओं BL21 (DE3) में व्यक्त PAD4 युक्त गोली 300 मिमी नाह 2 पीओ 4 (मेगावाट 119.98 छ / mol), 10 मिमी Imidazole (मेगावाट 68.077 जी / मोल), 0.1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF, मेगावाट 174.94 छ / mol) और 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी, 154.25 छ / mol), पीएच = 8.0.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए sonication के माध्यम Lyse कोशिकाओं. Sonication के बाद, 0 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर सेल lysate अपकेंद्रित्र. बंद डालो और सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए. बैच आरटी पर 30 मिनट के लिए glutathione (GSH) agarose मोती के साथ सतह पर तैरनेवाला.
    3. गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से जीएसटी मोती / स्तंभ से सतह पर तैरनेवाला नाली. आरटी पर 1x पीबीएस (फॉस्फेट बफर खारा, पीएच = 8.0) के 4 एक्स 25 मिलीलीटर के साथ मोती धो लें.
    4. Elute PAD4 2 एक्स 10 मिलीलीटर क्षालन बफर के साथ, 50 मिमी Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris बेस, मेगावाट 121.14 छ / mol), 10 मिमी glutathione (GSH, मेगावाट 307.32 छ / mol), पीएच = 8.0.
    5. 100k मेगावाट कट-ओ का प्रयोग कर PAD4 ध्यान लगाओएफएफ अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4000 XG पर. -80 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य 1.0 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में 200 μl संस्करणों में प्रोटीन और दुकान.

बफ़र के लिए 2. तैयारी स्टॉक समाधान

  1. सोडियम क्लोराइड (NaCl, मेगावाट 58.44 छ / mol) वजन और एक 2 एम समाधान तैयार है. स्पष्ट जब तक समाधान मिलाएं.
  2. Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris बेस, मेगावाट 121.14 छ / mol) वजन और = 8.0 एक 2 एम समाधान, पीएच तैयार करते हैं. स्पष्ट जब तक समाधान मिलाएं.
  3. कैल्शियम क्लोराइड dihydrate (2 CaCl 2H 2 हे, मेगावाट 147.01 छ / mol) वजन और एक 500 मिमी समाधान तैयार करते हैं. स्पष्ट जब तक समाधान मिलाएं.
  4. Tris (2 carboxyethyl) phosphine (TCEP, मेगावाट 250.19 छ / mol) वजन और एक 200 मिमी समाधान तैयार करते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट और दुकान तक समाधान मिलाएं.
  5. Dithiothreitol (डीटीटी, मेगावाट 154.25 छ / mol) वजन और एक 1 एम समाधान तैयार है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट और दुकान तक समाधान मिलाएं.
  6. तैयार करनाट्राइटन X-100 के 0.5% समाधान.
  7. Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, मेगावाट 292.24 छ / mol) वजन और एक 100 मिमी समाधान तैयार है. स्पष्ट जब तक समाधान मिलाएं.
  8. हाइड्रोक्लोराइड (ZRcoum, मेगावाट 621.69 छ / mol) methylcoumarin Z-Arg- Arg- 7- amido- 4- वजन और डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में एक 10 मिमी समाधान तैयार है.

37 डिग्री सेल्सियस पर 3. PAD4 परख

  1. 10 मिमी ZRcoum स्टॉक से, पानी में ZRcoum के 125 माइक्रोन समाधान तैयार है. यह 125 माइक्रोन ZRcoum समाधान समाधान ए हो जाएगा
  2. एक 62.5 मिमी NaCl, 62.5 मिमी Tris, 12.5 मिमी 2 CaCl, 6.25 मिमी डीटीटी का बफर, और 5 माइक्रोन PAD4 (पीएच = 8.0) तैयार करें. यह समाधान बी हो जाएगा
  3. 62.5 मिमी NaCl, 62.5 मिमी Tris, 12.5 मिमी 2 CaCl, और 6.25 मिमी डीटीटी (पीएच = 8.0) के बफर तैयार करें. यह समाधान सी हो जाएगा
  4. (गोजातीय अग्न्याशय से) trypsin, स्फटिक वजन और 100 मिमी EDTA में एक 10 मिलीग्राम / एमएल तैयार करते हैं. स्पष्ट जब तक समाधान मिश्रण और -20 में दुकानडिग्री सेल्सियस. यह समाधान डी हो जाएगा
  5. एक 96 अच्छी तरह से थाली प्राप्त करें और एक नियंत्रण के लिए कुओं की संख्या (कोई PAD4) और परीक्षण कुओं (PAD4) को नामित.
  6. पिपेट परीक्षण कुओं और पिपेट नियंत्रण कुओं में समाधान सी के 160 μl में समाधान बी के 160 μl. 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  7. पिपेट 40 सभी कुओं में समाधान के लिए एक के μl और 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  8. परीक्षण कुओं का नियंत्रण कुओं का आधा और आधा करने के लिए DH 2 हे की पिपेट 10 μl. नियंत्रण कुओं और परीक्षण नियंत्रण, पिपेट 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए समाधान डी सेते के 10 μl के अन्य आधा करने के लिए.
  9. 345 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 465 एनएम का उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक बहुविध पाठक पर पढ़ने एक प्रतिदीप्ति प्राप्त करते हैं.

आरटी पर 4. PAD4 परख

  1. 10 मिमी ZRcoum स्टॉक से, पानी में ZRcoum की एक 50 माइक्रोन समाधान तैयार है. यह 50 माइक्रोन ZRcoum समाधान समाधान ए हो जाएगा
  2. 100 मिमी ना की एक बफर तैयारसीएल, 100 मिमी Tris, 20 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी TCEP, 0.02% ट्राइटन X-100, और 8 माइक्रोन PAD4 (पीएच = 8.0). यह समाधान बी हो जाएगा
  3. 100 मिमी NaCl, 100 मिमी Tris, 20 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी TCEP, और 0.02% ट्राइटन X-100 (पीएच = 8.0) के बफर तैयार करें. यह समाधान सी हो जाएगा
  4. (गोजातीय अग्न्याशय से) trypsin, स्फटिक वजन और 100 मिमी EDTA में एक 10 मिलीग्राम / एमएल तैयार करते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट और दुकान तक समाधान मिलाएं. यह समाधान डी हो जाएगा
  5. एक 384 अच्छी तरह से थाली प्राप्त करें और नियंत्रण (कोई PAD4) और परीक्षण कुओं (PAD4) के लिए कुओं को नामित.
  6. पिपेट परीक्षण कुओं और पिपेट नियंत्रण कुओं में समाधान सी के 25 μl में समाधान बी के 25 μl. आरटी पर 20 मिनट के लिए कुओं में सेते PAD4 बिना साथ / बफर अनुमति दें.
  7. सभी कुओं में समाधान सी के पिपेट 25 μl और आरटी पर 45 मिनट के लिए सेते हैं.
  8. परीक्षण कुओं का नियंत्रण कुओं का आधा और आधा करने के लिए DH 2 हे की पिपेट 10 μl. नियंत्रण कुओं और परीक्षण नियंत्रण के अन्य आधा, pipett करने के लिए10 मिनट के लिए आरटी पर समाधान डी सेते की ई 10 μl.
  9. 345 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 465 एनएम का उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक बहुविध पाठक पर पढ़ने एक प्रतिदीप्ति प्राप्त करते हैं.

37 डिग्री सेल्सियस और आरटी पर 5. PAD4 समय बेशक Assays

  1. 10 मिमी ZRcoum स्टॉक से, पानी में ZRcoum के 125 माइक्रोन समाधान तैयार है. यह 125 माइक्रोन ZRcoum समाधान समाधान ए हो जाएगा
  2. एक 62.5 मिमी NaCl, 62.5 मिमी Tris, 12.5 मिमी 2 CaCl, 6.25 मिमी डीटीटी का बफर, और 5 माइक्रोन PAD4 (पीएच = 8.0) तैयार करें. यह समाधान बी हो जाएगा
  3. (गोजातीय अग्न्याशय से) trypsin, स्फटिक वजन और 100 मिमी EDTA में एक 10 मिलीग्राम / एमएल तैयार करते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट और दुकान तक समाधान मिलाएं. यह समाधान सी हो जाएगा
  4. (कितने समय अंक पर निर्भर करेगा कुओं की #) 2 96 अच्छी तरह प्लेटें और pipet कुओं की # राशि में समाधान बी के 160 μl प्राप्त करते हैं.
  5. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं. आरटी पर अन्य 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं.
  6. रंजette तुरंत 40 दोनों 96 अच्छी तरह प्लेटें सभी कुओं में समाधान के लिए एक के μl और टी = 0 मिनट कुओं में समाधान सी के 10 μl विंदुक. सभी कुओं बुझती किया गया है जब तक विशिष्ट समय बिंदुओं पर समाधान सी के 10 μl जोड़कर आगे बढ़ें.
  7. 345 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 465 एनएम का उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक बहुविध पाठक पर पढ़ने एक प्रतिदीप्ति प्राप्त करते हैं.

आरटी पर 6. PAD4 निषेध परख

  1. 10 मिमी ZRcoum स्टॉक से, पानी में ZRcoum की एक 83 माइक्रोन समाधान तैयार है. यह 83 माइक्रोन ZRcoum समाधान समाधान ए हो जाएगा
  2. सीएल-amidine (मेगावाट 424.8 छ / mol) वजन और एक 100 माइक्रोन स्टॉक समाधान तैयार है. यह समाधान बी हो जाएगा
  3. एक 100 मिमी NaCl, 100 मिमी Tris, 20 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी TCEP, 0.02% ट्राइटन X-100 के बफर, और 8 माइक्रोन PAD4 (पीएच = 8.0) तैयार करें. यह समाधान सी हो जाएगा
  4. 100 मिमी NaCl, 100 मिमी Tris, 20 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी TCEP, और 0.02% ट्राइटन X-100 (पीएच = 8.0) के बफर तैयार करें. गुसमाधान डी हो जाएगा
  5. (गोजातीय अग्न्याशय से) trypsin, स्फटिक वजन और 100 मिमी EDTA में एक 10 मिलीग्राम / एमएल तैयार करते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट और दुकान तक समाधान मिलाएं. यह समाधान ई होगा
  6. एक 384 अच्छी तरह से थाली प्राप्त करें और नियंत्रण के लिए कुओं (कोई PAD4), परीक्षण कुओं (PAD4), और निषेध कुओं (PAD4 + सीएल-amidine) को नामित.
  7. पिपेट परीक्षण कुओं और पिपेट नियंत्रण कुओं में समाधान डी के 25 μl में समाधान सी के 25 μl. आरटी पर 20 मिनट के लिए कुओं में सेते PAD4 बिना साथ / बफर अनुमति दें.
  8. निषेध कुओं में समाधान बी के पिपेट 10 μl और आरटीई पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  9. सभी कुओं में समाधान के लिए एक के पिपेट 15 μl और आरटी पर 45 मिनट के लिए सेते हैं.
  10. पिपेट सभी कुओं के लिए समाधान ई के 10 μl. 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  11. 345 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 465 एनएम का उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ एक बहुविध पाठक पर पढ़ने एक प्रतिदीप्ति प्राप्त करते हैं.

7. क्रूड सेल lysate परखआरटी पर

  1. 50 मिमी Tris, 50 मिमी NaCl, 0.1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (PMSF, मेगावाट 174.94 छ / mol) और 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी, 154.25 छ / mol), पीएच के 10 एमएल में PAD4 1 एल विकास, से resuspend कोशिकाओं कोशिकाओं कटाई के बाद = 8.0.
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए sonication के माध्यम Lyse कोशिकाओं. 0 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 20,000 XG पर सेल lysate अपकेंद्रित्र. 100k मेगावाट कट ऑफ अपकेंद्रित्र ट्यूब का उपयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर 4000 rpm पर centrifugation द्वारा आधी मात्रा को स्पष्ट सतह पर तैरनेवाला ध्यान लगाओ.
  3. 10 मिमी ZRcoum स्टॉक से, पानी में ZRcoum के 250 माइक्रोन समाधान तैयार है. यह 250 माइक्रोन ZRcoum समाधान समाधान ए हो जाएगा
  4. 100 मिमी NaCl, 100 मिमी Tris, 20 मिमी 2 CaCl, और 2 मिमी TCEP (पीएच = 8.0) के बफर तैयार करें. यह समाधान बी हो जाएगा
  5. (गोजातीय अग्न्याशय से) trypsin, स्फटिक वजन और 100 मिमी EDTA में एक 10 मिलीग्राम / एमएल तैयार करते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्पष्ट और दुकान तक समाधान मिलाएं. यह समाधान सी हो जाएगा
  6. एक काले रंग की 384 अच्छी तरह से थाली और डिजाइन प्राप्तनियंत्रण (कोई सेल lysate) और परीक्षण कुओं (सेल lysate) के लिए कुओं खा लिया.
  7. पिपेट परीक्षण कुओं में सभी कुओं और सेल lysate के पिपेट 60 μl में समाधान बी के 100 μl. आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  8. सभी कुओं में समाधान के लिए एक के पिपेट 40 μl और आरटी पर 45 मिनट के लिए सेते हैं.
  9. पिपेट सभी कुओं के लिए समाधान सी के 10 μl. 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  10. 345 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और 465 एनएम का उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ बहुविध पाठक पर पढ़ने एक प्रतिदीप्ति प्राप्त करते हैं.

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Representative Results

प्रारंभ में, यह ZRcoum एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में PAD4 की गतिविधि पर रिपोर्ट कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया गया. वेल्स सब्सट्रेट ZRcoum साथ और PAD4 की उपस्थिति / अनुपस्थिति में incubated रहे थे. 475/15 एनएम फिल्टर (2A चित्रा) - 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट की एक ऊष्मायन अवधि के बाद, प्रतिदीप्ति एक 340/40 साथ मापा गया था. जैसी कि उम्मीद थी, प्रतिदीप्ति स्तरों ZRcoum (या citrullinated ZRcoum) के भीतर फ्लोरोफोरे के रूप में कम रहा बंद राज्य में बने रहे. समाधान के लिए अतिरिक्त / trypsin EDTA के अलावा पर, fluorophores ZRcoum से मुक्त थे लेकिन PAD4 की उपस्थिति में ज्यादातर अपरिवर्तित रहे. EDTA के अलावा कारण आवश्यक कैल्शियम आयनों chelate करने की क्षमता को PAD4 प्रतिक्रिया की समाप्ति में सहायता करने का इरादा है. इन आंकड़ों से, प्रतिदीप्ति उत्पादन में एक 5.2 गुना कमी PAD4 की उपस्थिति में मनाया गया. इसके बाद, कंप्यूटर अनुप्रयोगउच्च throughput स्क्रीनिंग प्लेटफार्म के साथ नव विकसित परख की atibility प्रदर्शन किया गया. यह स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए सबसे अनुकूल होगा कि चार प्रतिक्रिया चर का विश्लेषण करने के लिए प्राथमिक ब्याज का था (1) परख मात्रा के आगे miniaturization (2) आरटी पर प्रोटीन और बफर मिश्रण (3) स्थिरता परख प्रदर्शन की संभावना परख और कार्बनिक सॉल्वैंट्स / डिटर्जेंट (4) संभावित हस्तक्षेप को पूरा करने के लिए पहले.

मध्य या उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रयासों के लिए, उच्च घनत्व अच्छी तरह प्लेटें आमतौर पर छोटे अणु स्क्रीन में उपयोग किया जाता है. यह एक 96 अच्छी तरह से थाली (चित्रा 2B) की तुलना में परख एक 384 अच्छी तरह से थाली में लगभग हूबहू किया जा सकता है कि सत्यापित किया गया था. आगे एक उच्च throughput प्रारूप में परख के लिए काम करने की स्थिति का निर्धारण करने में, यह PAD4 गतिविधि आरटी पर एक उचित समय सीमा में नजर रखी जा सकती है कि क्या जांच करने के लिए महत्वपूर्ण था. नहीं सभी तरल हैंडलिंग उपकरणों के बादएक तापमान नियंत्रक, यह ऊंचा तापमान पर एक ऊष्मायन कदम है करने के लिए बोझिल और महंगा हो सकता है. इसके अलावा, तापमान में उतार-चढ़ाव के लिए लेखांकन प्लेटें और रन के बीच विसंगति के लिए एक कारण हो सकता है. यहाँ वर्णित परख के लिए कम तापमान के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, एक समान परख आरटी पर प्रदर्शन किया गया था. यह संकेत 37 डिग्री सेल्सियस और आर टी (चित्रा 3) के बीच लगभग अपरिवर्तित थे कि पाया गया था. आगे PAD4 और सब्सट्रेट के बीच आवश्यक ऊष्मायन समय कम करके परख प्रदर्शन का अनुकूलन, प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स का विश्लेषण किया गया था. PAD4 गतिविधि आरटी पर और 37 डिग्री सेल्सियस दोनों समय के साथ नजर रखी थी. जैसी कि उम्मीद थी, यह PAD4 20 मिनट से ज्यादातर पूर्ण प्रतिक्रिया के साथ (मानव शारीरिक तापमान के साथ संगत) 37 डिग्री सेल्सियस पर अधिक सक्रिय है कि प्रतीत होता है. Satisfyingly, प्रतिक्रिया दृढ़ता से आर टी करने के लिए नीचे के तापमान में कमी से प्रभावित नहीं है. प्रतिक्रिया में के रूप में लगभग आधा गति आयतापमान ऊपर उठाया और अनिवार्य रूप से पूर्ण 40-45 मिनट पद दीक्षा है. पाठ्यक्रम का विश्लेषण करती है समय से, कैनेटीक्स स्थिरांक की गणना की गई और मानकों (कश्मीर मीटर = 397 माइक्रोन, कश्मीर बिल्ली = 2.98 सेकंड -1, कश्मीर बिल्ली / कश्मीर एम = 7400 सेकंड -1 एम -1) अन्य PAD4 के समान पाए गए substrates के. विशेषता प्रतिक्रिया के कैनेटीक्स के साथ 31, बाद के सभी assays के मापने बात करने के लिए शुरू से 1 घंटे के लिए कम हो गई थी.

समय की एक लम्बी अवधि में प्रतिक्रिया बफर में भंग जब अगला, PAD4 की स्थिरता मूल्यांकन किया गया था. वास्तविक, उच्च throughput स्क्रीनिंग साधन स्क्रीन पूरा कर रहा है, जबकि कई घंटे के लिए आम तौर पर स्थिर हो अभिकर्मकों की आवश्यकता होगी. कुछ अभिकर्मकों मिनट के एक रिश्तेदार शैल्फ जीवन है, तो यह काफी महंगा है और समय ताजा अभिकर्मकों तैयार करने के क्रम में स्क्रीन को समाप्त करने के लिए लगता हो सकता है. परख की स्थिति पर निर्भर करता है, यह नहीं हैकुछ assays के लिए असामान्य यह बहुत ही कारण के लिए उच्च के माध्यम से-डाल स्क्रीनिंग के साथ असंगत होने के लिए. मन में इस विचार के साथ, बफर में PAD4 की स्थिरता कई घंटे से अधिक नजर रखी थी. लगभग enzymatic गतिविधि में कोई नुकसान नहीं है, इस प्रकार प्रोटीन भी 15 से अधिक घंटा (चित्रा -4 ए) के लिए आरटी पर बैठे होने के बाद स्थिर है यह दर्शाता है कि समय अवधि के दौरान मनाया गया. इसके बाद, यह छोटी परिस्थितियों में और आरटी पर चलाने परख अभी भी उचित एक PAD4 की उपस्थिति का जवाब होता है कि क्या मूल्यांकन किया गया था. जाना जाता PAD4 अवरोध, chloroamidine (सीएल-amidine) की ऊष्मायन पर, PAD4 (चित्रा 4 बी) के पूर्ण निषेध के साथ संगत प्रतिदीप्ति संकेत की एक पूर्ण बहाली के लिए नेतृत्व किया. अंत में, यह भी आमतौर पर, अंतिम मात्रा के रूप में 3% तक, छोटे अणुओं का जायजा समाधान में इस्तेमाल जैविक विलायक DMSO के उपस्थिति, परख के साथ हस्तक्षेप नहीं किया है कि सत्यापित किया गया था (नहीं दिखाया डेटा). इसी तरह, 0.01% ट्राइटन X-100 के अलावा सिम में हुईilar प्रतिदीप्ति रुझान (नहीं दिखाया डेटा).

परख आम तौर पर छोटे अणु दवाओं की खोज के प्रयासों में सामना कर रहे हैं कि स्थितियों की एक किस्म के लिए सहिष्णु पता चला है कि करने के बाद, 80 यौगिकों का एक प्रारंभिक जांच का आयोजन किया गया था और 0.71 की एक मजबूत जेड 'मूल्य की पहचान की थी. परख की क्षमता को आगे बढ़ाने में, PAD4 / ZRcoum प्रतिक्रिया के चयनात्मकता कच्चे पूरे सेल lysates में प्रतिक्रिया प्रदर्शन से प्रकाश डाला गया. ई जीएसटी PAD4 अभिव्यक्ति वेक्टर युक्त कोलाई कोशिकाओं जीएसटी PAD4 के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया के समान IPTG, साथ प्रेरित किया गया. Sonication के माध्यम से कोशिका झिल्ली के विघटन के बाद, सेलुलर मलबे एक स्पष्ट सेल lysate वहन करने centrifugation द्वारा अलग हो गया था. PAD4 युक्त सेल lysate शुद्ध जीएसटी PAD4 परख, समाधान में सक्रिय PAD4 की उपस्थिति (के साथ समझौते में विविध प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में ही परख की स्थिति को प्रस्तुत किया गया था > चित्रा 5). सेल lysates संभावित PAD4 की गतिविधि, ZRcoum की फ्लोरोसेंट गुण, और trypsin कदम के साथ हस्तक्षेप कर सकता है कि उच्च सांद्रता में Biomacromolecules की एक संख्या में होते हैं. परख कच्चे सेल lysates में कार्यात्मक था कि खोज PAD4 और ZRcoum के बीच प्रतिक्रिया में एक उच्च चयनात्मकता है कि वहाँ इंगित करता है. आगे कच्चे तेल की सेल lysates की उपस्थिति में संकेत कमी सक्रिय PAD4, सीएल-amidine, एक स्थापित सहसंयोजक PAD4 अवरोध के प्रभाव की उपस्थिति के लिए विशिष्ट था कि प्रदर्शित करने के लिए, मूल्यांकन किया गया था. सीएल-amidine के अलावा प्रतिदीप्ति संकेत में एक बहाली, PAD4 की निष्क्रियता के साथ संगत (चित्रा 5) का नेतृत्व किया. साथ में, यह परख आगे PAD4 गतिविधि की निगरानी के लिए कच्चे तेल की सेल lysates का उपयोग करके सरल किया जा सकता प्रदर्शन किया गया.

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चित्रा 1. PAD4 और उसके प्रतिदीप्ति आधारित परख के डिजाइन. (ए) एक nucleosome की बुनियादी इकाई बनाने वाले हिस्टोन विधानसभाओं के कार्टून प्रतिनिधित्व. PAD4 हिस्टोन प्रोटीन पर arginine अवशेषों की एक संख्या के citrullination उत्प्रेरित. (बी) ZRcoum PAD4 की (स्पष्टता के लिए छिपा हुआ) देशी सब्सट्रेट (परिग्रहण कोड 2DW5) से मढ़ा. एक ठेठ PAD4 परख में कदम (सी) प्रतिनिधित्व. सब्सट्रेट ZRcoum की PAD4 द्वारा Citrullination इस प्रकार प्रतिदीप्ति के स्तर में बदलाव के कारण, ट्रिप्सिन की मध्यस्थता एमाइड हाइड्रोलिसिस के लिए अपनी संवेदनशीलता कम करता है. आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2 96 अच्छी तरह से और 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूपों में चित्रा 2. PAD4 परख. प्रतिदीप्ति मापा गया था (उत्तेजना 345 एनएम / उत्सर्जन 465 एनएम) नामित शर्तों के साथ दोनों एक 96 अच्छी तरह प्रारूप (ए) में और 384 अच्छी तरह प्रारूप (बी) (37 डिग्री सेल्सियस). प्रोटीज trypsin के अलावा PAD4 बिना कुओं में प्रतिदीप्ति स्तर में एक बड़ी वृद्धि की ओर जाता है और PAD4 साथ कुओं के लिए लगभग अपरिवर्तित बनी हुई है. डेटा मतलब + एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं (एन = 3). आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
PAD4 परख. प्रतिदीप्ति की चित्रा 3. टाइम कोर्स विश्लेषण मापा गया था (उत्तेजना 345 एनएम / उत्सर्जन 465 एनएम) समय-समय पर प्रोटीन के साथ 70 मिनट पर एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में या तो 37 में incubated किया जा रहा हैडिग्री सेल्सियस (ए) या ​​आरटी पर (बी). डेटा के रूप में मतलब +/- एसडी प्रतिनिधित्व कर रहे हैं (एन = 3). आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रोटीन स्थिरता और निषेध. (ए) PAD4 की गतिविधि निर्दिष्ट समय अंतराल के बाद मापा गया था. तुलना के लिए, प्रतिदीप्ति स्तरों PAD4 के अभाव में दिखाए जाते हैं. प्रतिदीप्ति का स्तर पहले (लाल) और निम्न (हरा) trypsin के अलावा दिखाए जाते हैं. जाना जाता PAD4 अवरोध सीएल-amidine (100 माइक्रोन) (बी) परिचय आरटी पर एक 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में प्रतिदीप्ति संकेत के बहाली के लिए नेतृत्व किया. प्रतिदीप्ति का स्तर पहले (लाल) और निम्न (हरा) trypsin के अलावा दिखाए जाते हैं. सभी डेटा represe हैंके रूप में मतलब +/- एसडी nted (एन = 3). आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. क्रूड सेल lysate परख. परख आरटी पर एक 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में अनुपस्थिति और कच्चे तेल की सेल lysates की उपस्थिति में प्रदर्शन किया गया था. प्रतिदीप्ति का स्तर पहले (लाल) और निम्न (हरा) trypsin के अलावा दिखाए जाते हैं. सीएल-amidine (100 माइक्रोन) भी इन शर्तों के तहत प्रतिदीप्ति संकेत में वृद्धि के कारण होता है. सभी डेटा के रूप में मतलब +/- एसडी प्रतिनिधित्व (एन = 3). रहे हैं आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

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रसायन विज्ञान अंक 93 PAD4 PADI4 citrullination arginine बाद translational संशोधन एचटीएस परख प्रतिदीप्ति citrulline
एक समर्थक प्रतिदीप्ति सब्सट्रेट एनालॉग के माध्यम से PAD4 गतिविधि के प्रतिदीप्ति आधारित निगरानी
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Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

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