Introduction
大量的哺乳动物蛋白质都很大程度上受到酶的下列蛋白质的核糖体的生物合成中的作用进行修改。这些翻译后修饰（翻译后修饰），可以通过改变蛋白1-3的大小，电荷，结构，和低聚状态（除其他特征），大大提高了蛋白质的功能多样性。其结果是，在蛋白质结构中的改变可以导致生理后果，如蛋白降解，细胞分化，信号传导，调节基因表达，和蛋白质 - 蛋白质相互作用。而这些修改都是在所有人类蛋白质所占的比例很大普及，终端结束对组蛋白进行非常多的共价修饰4。组蛋白是一族结构蛋白，以促进基因组DNA的缩合的。非结构化组蛋白尾巴的共价修饰都进行了规范，并通过意甲酶可以催化残基（刻录机）的共价修饰，反向相同的修改（橡皮擦），以及其中的变化区分号被印记到组蛋白尾部（读卡器）5-7。事实上，大多数已知的翻译后修饰可以在组蛋白包括甲基化，磷酸化，乙酰化，SUMO化，泛素化，和瓜氨酸化8的这个短段内被观察到。
瓜氨酸化涉及肽基精氨酸转化成非吨的RNA编码的肽基-瓜氨酸（ 图1A）。的蛋白质，负责该侧链中和，是PAD的成员（对eptide 一个rginineðeiminase）蛋白家族，所有这些都是钙依赖性酶。9,10。到今天为止，PAD家庭的五名成员已被描述（PAD1，PAD2，PAD3，PAD4和PAD6）。这个家庭的每个成员似乎针对不同的细胞蛋白质，并显示单阙组织分布概况。 PAD4是该蛋白家族已知细胞核内通过一个核定位序列11的局部的唯一成员。因此，它已被证明deiminate若干核目标，包括对组蛋白H2A的精氨酸残基3的N末端 尾部精氨酸侧链（H2R3），H3（H3R2，H3R17和H3R26）和H4（H4R3）12 13。而每个PAD同功酶具有特异性和一些重要的生理功能，PAD4已经获得相当多的关注，因为它在一个数均患病和健康细胞的人性化过程的作用。最近，PAD4被证明是多能性的转录网络14中的一员。既PAD4表达水平和活性示期间小鼠重编程和基态的多潜能状态升高。通过控制干细胞的基因的调节，PAD4可保留在细胞的重编程效率的关键作用。 PAD4也被牵连在形成中性粒细胞胞外的陷阱，对病原体结合后，使他们的系统过关。组蛋白通过PAD4的hypercitrullination诱导染色质，其作为用于病原性细菌的胞外陷阱的封装基体材料的解聚，从而抵挡细菌感染15,16。
此外，PAD4已经发现了一些人类疾病方面发挥积极作用。先前已证明，PAD4的异常表达与类风湿性关节炎的发病和严重程度相关联，阿尔茨海默氏症，帕金森氏病和多发性硬化17。事实上，抗瓜氨酸化蛋白的抗体的存在是类风湿性关节炎18的最可靠的和明确的诊断和预后标志物之 一。同样的，失调的PAD4的活性最近已经在许多人类癌症中，包括卵巢癌，乳腺癌，肺癌，被观察ð食管癌19-22。 PAD4和癌症之间的联系已经显示出通过ELK1癌基因或经由p53肿瘤抑制蛋白22,23介导的和以前的工作已经表明，PAD4可能是一个新的抗癌治疗靶17,24,25。原则研究证明，PAD4通过的shRNA在结肠癌细胞株HCT116枯竭显露足以诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞26。最近发展不可逆转的PAD4抑制剂导致肿块的小鼠27减少70％左右。很明显，PAD4抑制似乎充当靶向治疗，导致选择性杀伤癌细胞的同时保留未转化的细胞。
使用小分子来关闭PAD4的功能可能被证明是一个强大的新策略，以靶向癌细胞或以增加现有的癌症化学治疗剂28。不幸的是，一个PO10吨可逆PAD4抑制剂尚未被发现。使用氯/氟imidine手柄模仿精氨酸基板27,29,30和已被证明是实用的工具，理解健康和患病状态的细胞PAD4的作用已经开发了一些共价抑制剂。但是，这些分子抑制它们都具有类似功效的活性垫。因此，需要有一种简便的测定上PAD4的活性，报告是至关重要的。迄今为止，PAD4测定法已描述了从反应的比色读出31连结氨的释放，利用荧光标记的chloroamidine底物类似物为荧光偏振测定法32，依靠乙二醛和瓜氨酸33之间的酸-促进反应，并夫妇PAD4活性荧光脱猝灭步骤34。其中，只有共价修饰haloacetamidine策略已被证明是与高通量SCRE兼容效果图创作平台32,35,36。我们描述一个浅显的基于荧光检测的可靠测量PAD4的活性。该测定法中，其显示很强的信号 - 噪声比，分析速度，和测量的鲁棒性，具有以发现真正有效的和选择性PAD4抑制剂的潜力。
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Protocol
1. PAD4改造，表达和纯化
- 对于PAD4改造，改造PAD4含GST融合到化学感受态中的pGEX质粒大肠杆菌 （BL21（DE3））细胞，使用以下过程蛋白质表达。准备化学感受（氯化钙）E.根据标准方法， 大肠杆菌 （BL21（DE3））的细胞。
- 解冻加入50μl预先制备的化学感受态大肠杆菌BL21（DE3）细胞在冰上，并用1微升含有PAD4基因中有5毫升培养管中的质粒pGEX质粒混合。在冰上孵育混合物10分钟，同时轻轻摇动，每2分钟。
- 热量通过在42℃水浴中放置该混合物40秒电击细胞。立即将细胞质粒混合物回在冰上2分钟以使细胞恢复。加入1毫升无菌LB肉汤中的混合物中，并置于冰上1分钟。
- 孵育震惊细胞的热量，在37℃下，以250rpm振荡1小时。移液器75微升转化细胞上的氨苄青霉素抗性琼脂平板孵育在37℃下搅拌15小时。商店板在4℃下。
- PAD4表达。
- 挑1菌落大肠杆菌BL21（DE3）细胞中从氨苄青霉素琼脂平板上，并装在5ml的LB中含有1x氨苄青霉素。发生在孵化器和动摇O / N在37℃。
- 转移到1升的无菌LB含有1x氨苄青霉素三水酸（MW403.45克/摩尔）的5ml的LB（首发）的。地方生长在37℃下振荡培养箱。监测生长的OD 600。当增长达到了OD 600 0.3的移动增长到16℃，振荡培养箱。
- 一旦达到的OD 600为0.6，诱导的细胞用0.3毫isopropylthiagalactoside（IPTG，MW238.30克/摩尔）。让细胞在16℃振摇15小时。
- 收获细胞，离心，在4000×g离心20分钟，在0℃下。倒出上清液并储存沉淀在-80℃下。
- PAD4净化
- 重悬含有表达PAD4在大肠杆菌BL21（DE3）细胞中的50mM NaCl中（分子量58.44克/摩尔），缓冲剂粒料300毫米的NaH 2 PO 4（分子量119.98克/摩尔），10毫咪唑（分子量68.077克/摩尔），0.1毫摩尔苯甲基磺酰氟（PMSF，MW174.94克/摩尔）和1mM二硫苏糖醇（DTT，154.25克/摩尔），pH值= 8.0。
- 裂解通过超声处理15分钟，将细胞在4℃下。下面的超声处理，离心分离细胞裂解物在20,000×g离心20分钟，在0℃下。倒掉并保存上清。料与谷胱甘肽（GSH）的琼脂糖珠的上清液30分钟，在RT。
- 通过重力排水上清GST珠/列。用4×25毫升的1×PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH值= 8.0）在室温洗珠。
- 洗脱PAD4用2×10毫升的洗脱缓冲液，50mM的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱，分子量121.14克/摩尔），10毫摩尔还原型谷胱甘肽（GSH，MW307.32克/摩尔），pH值= 8.0。
- 精矿10万兆瓦切邻PAD4FF离心管中，离心分离机，在4000×g离心20分钟，在4℃下。等分的蛋白在200微升体积的1.0 ml微量离心管并储存于-80℃。
为缓冲区2.准备联合解决方案
- 称取氯化钠（NaCl的，MW58.44克/摩尔），并准备一个2M的解决方案。混合解决方案，直到清楚。
- 称取三（羟甲基）氨基甲烷（Tris碱，分子量121.14克/摩尔）和制备2M的溶液，pH = 8.0。混合解决方案，直到清楚。
- 称取二水氯化钙（氯化钙2·2H 2 O，MW147.01克/摩尔），并准备了500毫米的解决方案。混合解决方案，直到清楚。
- 称出三（2-羧乙基）膦（TCEP，MW250.19克/摩尔）和制备200mM的溶液。混合解决方案，直到明确并储存在-20℃。
- 称出二硫苏糖醇（DTT，MW154.25克/摩尔）和制备1M溶液。混合解决方案，直到明确并储存在-20℃。
- 准备的Triton X-100的0.5％的溶液。
- 称出乙二胺四乙酸（EDTA，分子量292.24克/摩尔）和制备100mM的溶液。混合解决方案，直到清楚。
- 称出Z-Arg- Arg- 7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐（ZRcoum，MW621.69克/摩尔）和制备的二甲亚砜（DMSO）中的10mM溶液。
3. PAD4测定在37℃下
- 从10mM ZRcoum股票，准备ZRcoum在水中的125微米的解决方案。这125微米ZRcoum解决方案将成为解决方案A.
- 制备的缓冲液62.5 mM氯化钠，62.5毫摩尔Tris，12.5毫摩尔氯化钙 ，6.25毫摩尔DTT，和5μM的PAD4（pH值= 8.0）。这将溶液B
- 准备62.5毫米氯化钠，62.5毫米的Tris，12.5毫米氯化钙和6.25毫摩尔DTT（pH值= 8.0）的缓冲。这将溶液C.
- 称取胰蛋白酶，结晶（从牛胰腺）和制备10毫克/毫升的100mM的EDTA。混合解决方案，直到清晰，保存于-20℃。这将解决方案D.
- 得到的96孔板，并指定数目的孔为对照（无PAD4）和测试孔（+ PAD4）。
- 吸取160微升的溶液B为测试井和吸160微升溶液C为对照孔。孵育15分钟，在37℃。
- 移液管加入40μl溶液A到所有孔中，并孵育在37℃下45分钟。
- 移取10微升的dh 2 O的一半控制井的试验井的一半。向对照孔和测试控制，移液管加入10μl溶液D的孵育10分钟，在37℃的另一半。
- 获得荧光读数上的多峰阅读器的345纳米的激发波长和465nm的发射波长。
4. PAD4试验在室温
- 从10mM ZRcoum股票，准备ZRcoum在水中的50μM的溶液。这50微米ZRcoum解决方案将成为解决方案A.
- 准备的100毫米钠缓冲液氯，100毫摩尔Tris，20mM的氯化钙 ，2mM的TCEP，0.02％的Triton X-100，和8微米的PAD4（pH值= 8.0）。这将溶液B
- 备的100 mM氯化钠，100毫摩尔Tris，20mM的氯化钙 ，2mM的TCEP和0.02％的Triton X-100（pH值= 8.0）的缓冲液。这将溶液C.
- 称取胰蛋白酶，结晶（从牛胰腺）和制备10毫克/毫升的100mM的EDTA。混合解决方案，直到明确并储存在-20℃。这将解决方案D.
- 得到384孔板和指定井对照（无PAD4）和测试孔（+ PAD4）。
- 吸取25微升的溶液B为测试井和吸管25微升溶液C为对照孔。允许缓冲带/不带PAD4在孔温育20分钟，在室温。
- 移液管加入25μl溶液C的向所有孔中并孵育在室温下45分钟。
- 移取10微升的dh 2 O的一半控制井的试验井的一半。向对照孔和测试控制的另一半，pipettE-10微升溶液D的孵育在室温下进行10分钟。
- 获得荧光读数上的多峰阅读器的345纳米的激发波长和465nm的发射波长。
5. PAD4时间扫描测定法，在37℃和室温
- 从10mM ZRcoum股票，准备ZRcoum在水中的125微米的解决方案。这125微米ZRcoum解决方案将成为解决方案A.
- 制备的缓冲液62.5 mM氯化钠，62.5毫摩尔Tris，12.5毫摩尔氯化钙 ，6.25毫摩尔DTT，和5μM的PAD4（pH值= 8.0）。这将溶液B
- 称取胰蛋白酶，结晶（从牛胰腺）和制备10毫克/毫升的100mM的EDTA。混合解决方案，直到明确并储存在-20℃。这将溶液C.
- 获得2 96孔板和吸管160微升溶液B的进＃量孔（＃井将取决于多少时间点）。
- 孵育1 96孔板中，在37℃。孵育另一96孔板中于室温。
- 果仁ETTE 40微升溶液A的成在两个96孔板的所有孔中，并立即吸取10微升溶液C的进t = 0的最小的孔。继续加入10μl的溶液C中的特定时间点，直到所有的孔都被淬灭。
- 获得荧光读数上的多峰阅读器的345纳米的激发波长和465nm的发射波长。
6. PAD4抑制试验在室温
- 从10mM ZRcoum股票，准备ZRcoum在水中的83微米的解决方案。这83微米ZRcoum解决方案将成为解决方案A.
- 称取CL-脒（MW424.8克/摩尔），并准备了100微米的原液。这将溶液B
- 制备的缓冲液中的100mM的NaCl，100毫摩尔Tris，20mM的氯化钙 ，2mM的TCEP，0.02％的Triton X-100，和8微米的PAD4（pH值= 8.0）。这将溶液C.
- 备的100 mM氯化钠，100毫摩尔Tris，20mM的氯化钙 ，2mM的TCEP和0.02％的Triton X-100（pH值= 8.0）的缓冲液。日是将液D.
- 称取胰蛋白酶，结晶（从牛胰腺）和制备10毫克/毫升的100mM的EDTA。混合解决方案，直到明确并储存在-20℃。这将解决方案E.
- 得到384孔板和指定井对照（无PAD4），测试孔（+ PAD4），和抑制井（PAD4 +氯脒）。
- 吸取25μL溶液C到测试井和吸管25微升D液为对照孔。允许缓冲带/不带PAD4在孔温育20分钟，在室温。
- 移液管加入10μl溶液B的成抑制孔，孵育20分钟，在RTE。
- 吸取15微升溶液A到所有孔，并培育在室温下45分钟。
- 移取10微升溶液E的所有井。在室温下孵育10分钟。
- 获得荧光读数上的多峰阅读器的345纳米的激发波长和465nm的发射波长。
7.粗细胞裂解液测定在室温
- 后从PAD4 1L的增长，在10ml的50mM Tris，50 mM氯化钠，0.1 mM的苯基甲基磺酰氟（PMSF，MW174.94克/摩尔）和1mM二硫苏糖醇（DTT，154.25克/摩尔），pH值收获的细胞重悬细胞= 8.0。
- 裂解通过超声处理15分钟，将细胞在4℃下。离心细胞裂解物在20,000×g离心20分钟，在0℃下。使用100k的分子量截止离心管中浓缩该澄清的上清液至一半通过离心的体积以4,000rpm在4℃下。
- 从10mM ZRcoum股票，准备ZRcoum在水中的250微米的解决方案。这250微米ZRcoum解决方案将成为解决方案A.
- 备的100 mM氯化钠，100毫摩尔Tris，20mM的氯化钙 ，和2mM TCEP（pH值= 8.0）的缓冲液。这将溶液B
- 称取胰蛋白酶，结晶（从牛胰腺）和制备10毫克/毫升的100mM的EDTA。混合解决方案，直到明确并储存在-20℃。这将溶液C.
- 得到黑色384孔板和设计吃井控制（无细胞裂解液）和试验井（+细胞裂解液）。
- 吸取100微升的溶液B向所有孔和吸管60微升的细胞裂解液进入试验井。孵育20分钟，在RT。
- 吸取40微升溶液A到所有孔，并培育在室温下45分钟。
- 移取10微升溶液C到所有的孔。在室温下孵育10分钟。
- 获得荧光读数上多峰读者的345纳米的激发波长和465nm的发射波长。
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Representative Results
最初，它被证明ZRcoum可以在96孔板形式的PAD4的酶活性的报告。孔用基板ZRcoum并在存在/不存在PAD4的。以下的45分钟，在37℃温育期间，荧光用一个四十〇分之三百四十零测定-一十五分之四百七十五纳米过滤器（ 图2A）。正如所料，荧光水平保持最低值内ZRcoum（或瓜氨酸ZRcoum）的荧光团保持在锁定状态。一旦加入过量的胰蛋白酶/ EDTA的溶液中，所述荧光团是从ZRcoum释出但仍然大致不变的PAD4的存在。加入EDTA的目的是协助在PAD4反应的停止，由于其以螯合的必要的钙离子的能力。从这些数据中，在荧光输出一个5.2倍的下降，观察PAD4的存在。其次，补偿新开发的测定法与高通量筛选平台atibility证实。这是主要感兴趣的分析4反应变量，这将是最有利的筛选目的（1）在测定体积的进一步的小型化（2）在室温下进行测定的蛋白质和缓冲液的混合物（3）的稳定性的可能性之前完成测定和有机溶剂/去污剂（4）的潜在干扰。
对于中或高通量筛选的努力，高密度井板被普遍使用在小分子筛选。它证实了该测定可相比于96孔板中（ 图2B）几乎相同进行在384孔板中。在进一步确定所述工作条件的高通量形式的测定中，重要的是要调查是否PAD4活性可在室温合理的时间范围进行监控。由于不是所有的液体处理仪器有一个温度控制器，它可以成为麻烦和昂贵的具有在升高的温度下的温育步骤。此外，占波动的温度可以为板材和运行之间差异的原因。为了确定较低的温度对此处描述的测定的效果，类似的试验在室温下进行。人们发现，这些信号分别为间37℃和RT（ 图3）大致维持不变。以通过最小化PAD4和基板之间所需的温育时间，可以进一步优化该方法的性能，该反应的动力学进行了分析。 PAD4的活性都在室温和37℃下随时间监测。正如预期的那样，似乎PAD4是在37℃（与人的生理温度一致）与反应20分钟基本完成更活跃。令人满意的，该反应不强烈影响的温度降低至室温。该反应在大约一半的速度在高温和基本完成40〜45分钟后启动。从过程分析时，动力学常数分别计算和参数（K，M = 397微米的中，k 猫 = 2.98秒-1中，k 猫 / k的M = 7400秒-1 M -1），被认为是相似的其他PAD4基板31随着其特征在于该反应的动力学，所有随后的实验中，从开始到测量点减少到1小时。
接着，PAD4的稳定性溶解在反应缓冲液中在延长的时间周期时进行评价。实际上，高通量筛选，需要的试剂为许多小时一般是稳定的，而在仪器完成屏幕。如果某些试剂有几分钟的相对保质期，它可以是相当昂贵和耗时的，终止在屏幕中以制备新鲜的试剂。根据不同的测定条件下，它是不不寻常的某些测定法，以不兼容的高通量筛选这个原因。以这种想法的，PAD4的在缓冲液中的稳定性进行了监测若干小时。几乎观察整个时间段中的酶活性没有损失，因此表明，即使坐在在RT在15小时（ 图4A）之后，该蛋白质是稳定的。接着，将它评价是否在小型化的条件，并在RT下运行试验仍会适当地向一个PAD4的存在下反应。根据已知的PAD4抑制剂，chloroamidine（氯脒）的温育时，导致与全抑制PAD4（ 图4B）的一致的荧光信号的一个完整的修复。最后，还证实了有机溶剂的DMSO的存在下，常用于储备溶液的小分子，高达3％的最终体积，未与测定干扰（数据未示出）。同样，在加入0.01％的Triton X-100的导致卡ILAR荧光趋势（数据未显示）。
已证明该测定是耐受的各种各样的通常遇到的小分子药物发现努力的条件下，为80的化合物的初步筛选进行和0.71健壮Z'的值被确定。在进一步分析的潜力，PAD4 / ZRcoum反应的选择性是强调通过在粗全细胞裂解物反应; E.含有GST-PAD 4表达载体的大肠杆菌细胞，用IPTG诱导，类似于用于GST-PAD4的分离的过程。以下细胞膜通过超声处理破坏，细胞碎片，离心分离，得到一澄清的细胞裂解物。当含PAD4细胞裂解物提交给相同的测定条件所纯化的GST-PAD4测定中，改变在协议与活性PAD4在溶液中的存在（荧光信号
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图1. PAD4和基于荧光检测的设计。（A）组蛋白组件组成核小体的基本单元的卡通代表。 PAD4催化许多精氨酸残基上的组蛋白的瓜氨酸化。 （B）中ZRcoum覆盖有PAD4的天然底物（隐藏为清楚起见）（登录码2DW5）。 （C）表示在一个典型的PAD4测定的步骤。瓜氨酸通过基板ZRcoum的PAD4降低其敏感性胰蛋白酶介导的酰胺的水解，从而导致荧光水平的变化。 请点击这里查看图的放大版本。
在96孔和384孔板格式的图2 PAD4测定。测定荧光（激发345nm处/发射465纳米）与所指定的条件在两个96孔格式（A）和384孔板格式（B）的（37℃）。在加入蛋白酶胰蛋白酶导致不PAD4在井的大量增加荧光水平和几乎保持不变井PAD4。数据表示为平均值±标准差（n = 3）。 请点击这里查看图的放大版本。
测定PAD4测定。荧光的图3的时间过程分析 （激发345纳米/发射465纳米）周期性地在超过70分钟，与该蛋白质的96孔板格式孵育或者在37°C（A），或在室温（B）。数据表示为平均值+/-标准差（n = 3）。 请点击这里查看图的放大版本。
图4.蛋白质稳定性和抑制。（A）的 PAD4的活性，在指定的时间间隔后进行测定。为了比较，荧光水平表示在没有PAD4的。荧光水平示之前（红色）和下述（绿色）添加胰蛋白酶。已知PAD4抑制剂氯脒（100μM）（B）的介绍导致了在RT 384孔板格式的恢复的荧光信号。荧光水平示之前（红色）和下述（绿色）添加胰蛋白酶。所有的数据都represented为平均值+/-标准差（n = 3）。 请点击这里查看图的放大版本。
图5的粗细胞裂解物测定法。在不存在和粗制细胞裂解物存在下在室温至384孔板形式中进行的测定法。荧光水平示之前（红色）和下述（绿色）添加胰蛋白酶。以Cl - 脒（100μM）也引起了在这些条件下的增加的荧光信号。所有的数据被表示为平均值+/-标准差（n = 3）。 请点击这里查看图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. | |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich | ||
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | www.tecan.com | ||
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | http://www.perkinelmer.com |
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