PAD4 是一种负责将肽基精氨酸转化为肽基瓜氨酸的酶。PAD4 的失调与多种人类疾病相关。本文描述了一种简便且适用于高通量的基于荧光的 PAD4 检测方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
翻译后蛋白修饰可能通过增加多种蛋白底物侧链上的共价修饰，从而导致蛋白功能状态的改变。组蛋白尾部是所有人源蛋白中修饰程度最高的区域之一。已有研究证明，肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）能够将精氨酸残基转化为非遗传编码的瓜氨酸残基。迄今为止，已报道的检测方法中，操作简便且灵敏度令人满意者甚少。因此，合适的检测方法的缺乏可能在很大程度上导致了强效非共价PAD4抑制剂的缺失。本文介绍了一种新型的基于荧光的检测方法，可用于监测PAD4的酶活性。该方法设计了一种前荧光底物类似物，通过加入蛋白酶胰蛋白酶后释放荧光，从而将PAD4的酶学活性与荧光信号关联起来。结果表明，该检测方法适用于高通量筛选条件，并具有较高的信噪比。此外，该方法也可用于含有过表达PAD4的粗制细胞裂解液样品的检测。
引言
大量哺乳动物蛋白质在核糖体完成蛋白质生物合成后，会受到酶的作用而发生显著修饰。这些翻译后修饰（PTMs）可通过改变蛋白质的大小、电荷、结构和寡聚状态（以及其他特性）极大地增加蛋白质组的功能多样性1-3。因此，蛋白质结构的改变可能导致一系列生理后果，例如蛋白质降解、细胞分化、信号传导、基因表达调控以及蛋白质-蛋白质相互作用。尽管这些修饰在人类蛋白质中普遍存在，但组蛋白的末端却经历了异常高频的共价修饰4。组蛋白是一类结构蛋白，有助于基因组DNA的压缩。无序的组蛋白尾部的共价修饰由一系列酶催化并受到调控，这些酶能够催化残基的共价修饰（书写酶），逆转相同的修饰（擦除酶），并识别组蛋白尾部所携带的修饰变化（阅读器）5-7。事实上，大多数已知的翻译后修饰均可在此段短小的组蛋白区域中观察到，包括甲基化、磷酸化、乙酰化、SUMO化、泛素化和瓜氨酸化8。
瓜氨酸化涉及肽基精氨酸转化为非tRNA编码的肽基瓜氨酸图1A）。负责该侧链中和作用的蛋白质属于PAD（peptide a精氨酸 deiminase）蛋白家族，该家族均为依赖钙离子的酶。9,10迄今为止，已发现五种PAD家族成员（PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6）。该家族的每个成员似乎靶向不同的细胞蛋白，并表现出独特....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. PAD4 的转化、表达与纯化
- 进行PAD4转化时，将含有PAD4 GST融合蛋白的pGEX质粒转入化学感受态的大肠杆菌（E. Coli BL21(DE3)）细胞中，用于蛋白表达，具体操作步骤如下。根据标准操作流程制备化学感受态（氯化钙法）大肠杆菌（E. Coli BL21(DE3)）细胞。
- 将50 μl预先制备好的化学感受态BL21(DE3)细胞置于冰上融化，加入1 μl含有PAD4基因的pGEX质粒，于5 ml离心管中混匀。将混合物置于冰上孵育10分钟，期间每2分钟轻轻振荡一次。
- 将混合物放入42 °C水浴中热激40秒，立即放回冰上孵育2分钟，使细胞恢复。向混合物中加入1 ml无菌LB液体培养基，继续在冰上放置1分钟。
- 将热激后的细胞在37 °C、250 rpm振荡条件下培养1小时。取75 μl转化后的细胞涂布于含氨苄青霉素的琼脂平板，37 °C孵育15小时。孵育后将平板保存于4 °C。
- PAD4表达。
- 从氨苄青霉素琼脂平板上挑取单克隆BL21(DE3)菌落，接种至5 ml含1×氨苄青霉素的LB培养基中，置于37 °C培养箱中振荡过夜 培养。
- 将5 ml LB菌液（种子液）转接至1 L含1×氨苄青霉素三水合物（分子量403.45 g/mol）的无菌LB培养基中，置于37 °C振荡培养箱中培养。监....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
最初，实验表明ZRcoum可在96孔板体系中用于报告PAD4的活性。各孔中加入底物ZRcoum，并分别在有或无PAD4的条件下孵育。在37 °C孵育45分钟后，使用340/40 – 475/15 nm滤光片检测荧光信号（图2A）。如预期所示，由于ZRcoum（或瓜氨酸化后的ZRcoum）中的荧光团仍处于锁定状态，荧光水平保持较低。当向溶液中加入过量胰蛋白酶/EDTA后，荧光团从ZRcoum中释放，而在PAD4存在的情况下荧光信号基本保持不变。添加EDTA的目的是通过螯合PAD4反应所必需的钙离子，从而终止酶促反应。根据这些数据，在PAD4存在条件下观察到荧光信号降低了5.2倍。接下来，验证了新开发的检测方法与高通量筛选平台的兼容性。重点分析了四个对筛选最为关键的反应变量：（1）进一步缩小检测体系的反应体积；（2）在室温（RT）下进行检测的可行性；（3）检测前蛋白与缓冲液混合物的稳定性；（4）有机溶剂/去垢剂可能产生的干扰。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文成功建立了一种基于荧光的检测方法，用于监测PAD4的活性。该方法在多种高通量条件下均表现出极高的稳健性，并且适用于全细胞裂解液37。
组蛋白与周围DNA链之间的亲和力因精氨酸侧链在瓜氨酸化后其正电荷被中和而减弱。人们设想，精氨酸侧链的电荷中和效应也可被类似地用于监测PAD4的活性。PAD4将精氨酸转化为瓜氨酸的反应预计会显著降低其被胰蛋白酶介导水解的敏感性。胰蛋白酶优先水解赖氨酸和精氨酸的C端酰胺键，其最适活性pH范围为7.5至8.5。因此，所有胰蛋白酶溶液均在pH 7.5条件下配制，所有检测均在pH 8.0条件下进行。此外，将荧光团7-氨基-4-甲基香豆素乙酰化连接至精氨酸的C端，可使其荧光处于“关闭”状态（图1C）。经胰蛋白酶处理后，7-氨基-4-甲基香豆素从分子上解离，从而恢复其荧光。在生理pH条件下，荧光的变化可通过其最大激发波长~440 nm在溶液中实时监测。PAD4将精氨酸转化为瓜氨酸的酶活性应能阻止荧光团的暴露，从而降低荧光信号输出。另外，精氨酸的氨基端被乙酰化为羧基苄基结构，以模拟天然肽类底物——后者缺乏带.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由理海大学启动经费支持。我们感谢 Walter Fast 博士提供了用于蛋白质表达的 GST-PAD4 质粒。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB Broth, Miller（LURIA-BERTANI） | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| 氨苄青霉素三水合物（淡黄色粉末），Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG） | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| 所有缓冲液盐类 | Fisher Scientific | 可从 Fisher Scientific、VWR、Acros、Sigma-Aldrich 等公司购买 | |
| Protino 谷胱甘肽（GSH）琼脂糖 | Machery-Nagel | 745500.10 | 4 °C 保存；http://www.mn-net.com/ |
| 氯胺脒 | Cayman Chemical | 10599 | -20 °C 保存；https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell 板（96 孔和 384 孔） | 可从 Corning 或 Sigma-Aldrich 购买 | ||
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control 微孔板读板仪软件 | www.tecan.com | ||
| 铕激发 340/40 发射 475/15 滤光片 | http://www.perkinelmer.com |
参考文献
- Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
- Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
