Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Um grande número de proteínas de mamífero são fortemente modificado pela acção de enzimas após a biossíntese de proteínas pelo ribossoma. Estas modificações pós-translacionais (PTMs) pode aumentar significativamente a diversidade funcional do proteoma mudando o tamanho, carga, estrutura, e estado de oligomerização (entre outras características) de proteínas 1-3. Como resultado, a variação na estrutura da proteína podem conduzir a consequências fisiológicas, tais como a degradação das proteínas, a diferenciação celular, a sinalização, a modulação da expressão do gene, e interacções proteína-proteína. Enquanto essas modificações são predominantes em uma grande porcentagem de todas as proteínas humanas, o terminal termina em proteínas histonas passam por um número anormalmente elevado de modificações covalentes 4. Proteínas histona são uma família de proteínas estruturais que facilitam a condensação de ADN genómico. Modificações covalentes das caudas das histonas não estruturados são realizadas e regulado por uma series de enzimas que podem catalisar a modificação covalente de resíduos (escritores), inverter as mesmas modificações (borrachas), e distinguem entre as mudanças que estão sendo impressas para as caudas das histonas (leitores) 5-7. Na verdade, a maioria dos PTMs conhecidos pode ser observado dentro deste segmento curto da histona, incluindo a metilação, fosforilação, acetilação, sumoilação, ubiquitinação, e citrulinação 8.

Citrulinação envolve a conversão de peptidil-arginina para o t ARN não codificado peptidil-citrulina (Figura 1A). As proteínas, responsáveis ​​por esta cadeia lateral de neutralização, são membros da DAP (p eptide um eiminase rginine d) a família de proteínas, todas as quais são enzimas dependentes de cálcio 9,10.. Até à data, cinco membros da família PAD foram descritos (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Cada membro desta família parece alvejar proteínas celulares distintas e também exibe uniperfis de distribuição de tecido Que. PAD4 é o único membro desta família de proteínas conhecida por estar localizada dentro do núcleo através de uma sequência de localização nuclear 11. Deste modo, tem sido demonstrado que deiminate um número de alvos nucleares, incluindo cadeias laterais de arginina sobre as caudas N-terminais das histonas H2A arginina resíduo 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, e H3R26) e H4 (H4R3) 12, 13. Enquanto cada uma das isozimas PAD têm funções fisiológicas específicas e críticos, PAD4 tem recebido bastante mais atenção devido ao seu papel numa série de processos humanos em ambas as células doentes e saudáveis. Recentemente, PAD4 mostrou ser um membro da rede transcricional pluripotência 14. Ambos os níveis de expressão PAD4 e atividade mostraram-se elevados durante a reprogramação e estatais chão estados pluripotentes em camundongos. Ao controlar a regulação de genes de células-tronco, PAD4 pode reter um papel crucial na eficiência de reprogramação celular. PAD4 também tem sido implicado naformação de armadilhas extracelulares de neutrófilos, o qual após a ligação de agentes patogénicos possibilitar a sua recarga do sistema. O hypercitrullination de proteínas histona por PAD4 induz descondensação da cromatina, o que serve como o material de base para o encapsulamento de bactérias patogénicas por a armadilha extracelular, assim, afastar infecções bacterianas 15,16.

Além disso, foi encontrado PAD4 a desempenhar um papel activo num número de doenças humanas. Foi previamente mostrado que a expressão aberrante de PAD4 está associada com o aparecimento e gravidade da artrite reumatóide, a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, e esclerose múltipla 17. Na verdade, a presença de anticorpos anti-citrulinados proteína é um dos biomarcadores de diagnóstico e de prognóstico mais fiáveis ​​e definitivas 18 de artrite reumatóide. Do mesmo modo, a actividade desregulada PAD4 foi recentemente observado num número de cancros humanos incluindo ovário, mama, pulmão, umad cânceres de esôfago 19-22. A ligação entre PAD4 e cancro tem sido mostrado para ser mediada através do oncogene ELK1 ou através da proteína supressora de tumor p53 22,23 e trabalho anterior sugeriu que PAD4 poderia ser um alvo terapêutico anti-cancro da novela 17,24,25. Como prova do princípio do estudo, a depleção de PAD4 através shRNA na linha celular de cancro colo-rectal HCT116 foi revelado para ser suficiente para induzir a apoptose e paragem do ciclo celular 26. Um inibidor irreversível PAD4 recentemente desenvolvido conduziu a uma redução de setenta por cento da massa do tumor em ratos 27. Muito notavelmente, a inibição PAD4 apareceu para actuar como uma terapia-alvo que resultou na morte selectiva de células cancerígenas, enquanto poupando células não transformadas.

O uso de pequenas moléculas para desligar a função de PAD4 pode vir a ser uma nova e poderosa estratégia para atingir as células cancerosas ou para aumentar quimioterápicos de câncer existentes 28. Infelizmente, a potenda inibidor reversível PAD4 tem ainda a ser descoberto. Uma série de inibidores covalentes foram desenvolvidos usando o / alça imidine flúor cloro que imita o substrato arginina 27,29,30 e provaram ser ferramentas práticas para a compreensão do papel da PAD4 em ambas as células estaduais saudáveis ​​e doentes. No entanto, estas moléculas inibem a todos os PADs activos com potência similar. Portanto, a necessidade de um ensaio fácil, que relata sobre a actividade de PAD4 é crucial. Até à data, PAD4 ensaios foram descritos que vincular a liberação de amônia a partir da reação de uma leitura colorimétrica 31, utilizar um análogo do substrato chloroamidine fluorescente etiquetado para teste de polarização fluorescente de 32, contam com a reação assistida por ácido entre glioxal e citrulina 33, e par a actividade PAD4 a um passo de fluorescência dequenching 34. Destes, apenas a estratégia haloacetamidine modificador covalente tem provado ser compatíveis com scre de alto rendimentoplataformas ening 32,35,36. Nós descrevemos um ensaio baseado fluorescência fácil, que mede de forma confiável a atividade de PAD4. O ensaio, que exibe uma forte relação de sinal-para-ruído, a velocidade de análise, e robustez de medição, tem o potencial para descobrir um verdadeiramente potente e selectivo inibidor PAD4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 Transformação, expressão e purificação

  1. Para PAD4 Transformação, transformar o plasmídeo pGEX contendo PAD4 GST fusão em E. quimicamente competente Coli (células BL21 (DE3)), as células para a expressão de proteínas utilizando o seguinte procedimento. Prepare (cloreto de cálcio) quimicamente competentes E. Coli (células BL21 (DE3)), as células de acordo com protocolos padrão.
    1. Descongelar 50 ul de previamente preparada quimicamente competentes BL21 (DE3) células em gelo e misturar com 1 ul do plasmídeo pGEX contendo o gene PAD4 num tubo de cultura de 5 mL. Incubar a mistura em gelo durante 10 minutos, enquanto agitando a cada 2 min.
    2. Calor chocar as células colocando a mistura em um banho de água a 42 C ° durante 40 seg. Colocar imediatamente a mistura de células-plasmídeo para trás em gelo durante 2 min para permitir que as células para recuperar. Adicionar 1 ml de caldo LB estéril à mistura e colocar em gelo durante 1 min.
    3. Incubar o calor células chocados a 37 ° C, agitação a 250 rpm durante 1hr. Pipetar 75 ul das células transformadas numa placa de ágar resistente à ampicilina e incubar a 37 ° C durante 15 h. Placa armazenar a 4 ° C.
  2. PAD4 Expressão.
    1. Picareta 1 colónia de células BL21 (DE3) a partir da placa de ágar e ampicilina-se em 5 ml de LB contendo ampicilina 1x. Colocar na incubadora e agite O / N a 37 ° C.
    2. Transferir os 5 ml de LB (kits) em 1 L de LB estéril contendo 1x tri-hidrato de ampicilina (PM 403,45 g / mol). Ponto de crescimento num incubador com agitação a 37 ° C. Monitorar a OD 600 do crescimento. Quando o crescimento atinge uma DO600 de 0,3, mova o crescimento em 16 ° C agitando incubadora.
    3. Ao atingir uma DO600 de 0,6, induzir as células com 0,3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / mol). Permitir que as células agitar por 15 horas a 16 ° C.
    4. Células colheita por centrifugação a 4000 xg durante 20 min a 0 ° C. Decantar o sobrenadante e pellet loja a -80 ° C.
  3. PAD4 Purificação
    1. Re-suspender o sedimento contendo o PAD4 expressa em BL21 (DE3) células num tampão de NaCl 50 mM (PM 58,44 g / mol), 300 mM de NaH 2 PO 4 (PM 119,98 g / mol), 10 mM de imidazole (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM de ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lisar as células por sonicação durante 15 min a 4 ° C. Após sonicação, centrifugar o lisado celular a 20000 xg durante 20 min a 0 ° C. Deitar fora e salvar sobrenadante. Lote do sobrenadante com glutationa (GSH) esferas de agarose durante 30 minutos à TA.
    3. Drenar o sobrenadante das esferas de GST / coluna por acção da gravidade. Lavar as pérolas com 4 x 25 ml de 1x PBS (solução salina tamponada com fosfato, pH = 8,0) à temperatura ambiente.
    4. Eluir PAD4 com 2 x 10 ml de tampão de eluição, 50 mM de tris (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM de glutationa (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Concentre PAD4 usando 100k MW corte-off tubos de centrífuga e centrifugar a 4000 xg durante 20 min a 4 ° C. Aliquota de proteína em 200 ul volumes de 1,0 ml em tubos de microcentrífuga e armazenar a -80 ° C.

2. Preparar soluções estoque para amortecedores

  1. Pesam-se cloreto de sódio (NaCl, PM 58,44 g / mol) e preparar uma solução 2 M. Misturar a solução até que clara.
  2. Pesar Tris (hidroximetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol) e preparar uma solução 2 M, pH = 8,0. Misturar a solução até que clara.
  3. Pesam-se di-hidrato de cloreto de cálcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) e preparar uma solução 500 mM. Misturar a solução até que clara.
  4. Pesar de Tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP, MW 250,19 g / mol) e preparar uma solução 200 mM. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C.
  5. Pesar ditiotreitol (DTT, MW 154,25 g / mol) e preparar uma solução 1 M. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C.
  6. Prepararuma solução de 0,5% de Triton X-100.
  7. Pesar o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, MW 292,24 g / mol) e preparar uma solução 100 mM. Misturar a solução até que clara.
  8. Pesar Z- Arg-Arg-7- amido- metilcumarina cloridrato de 4- (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) e preparar uma solução a 10 mM em sulfóxido de dimetilo (DMSO).

3. PAD4 Ensaio a 37 ° C

  1. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 125 mM de ZRcoum na água. Esta solução 125 uM ZRcoum será Solução A.
  2. Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, e PAD4 5 uM (pH = 8,0). Este será Solução B.
  3. Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, e 6,25 mM de DTT (pH = 8,0). Este será Solução C.
  4. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20° C. Este será Solução D.
  5. Obter uma placa de 96 poços e designar um número de poços para controlos (sem PAD4) e os poços de ensaio (+ PAD4).
  6. Pipeta 160 mL de solução B para poços de teste e pipeta de 160 mL de solução de C em poços de controlo. Incubar durante 15 min a 37 ° C.
  7. Pipetar 40 ul de solução A em todos os poços e incubar a 37 ° C durante 45 min.
  8. Pipetar 10 ul de dH2O a metade dos poços de controlo e metade dos poços de teste. Para a outra metade dos poços de controlo e controlos de ensaio e pipetas 10 mL de solução de D. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
  9. Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

4. Ensaio PAD4 à TA

  1. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 50 mM de ZRcoum na água. Esta solução ZRcoum 50 uM será Solução A.
  2. Preparar um tampão de Na 100 mMCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, e 8 PAD4 uM (pH = 8,0). Este será Solução B.
  3. Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% e Triton X-100 (pH = 8,0). Este será Solução C.
  4. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução D.
  5. Obter uma placa de 384 poços e poços para designar controles (sem PAD4) e poços de teste (+ PAD4).
  6. Pipetar 25 mL de solução B para poços de teste e pipeta de 25 mL de solução de C em poços de controlo. Permitir tampão com / sem PAD4 a incubar nos poços durante 20 min à TA.
  7. Pipetar 25 ul de solução C em todas as cavidades e incubar durante 45 min à temperatura ambiente.
  8. Pipetar 10 ul de dH2O a metade dos poços de controlo e metade dos poços de teste. Para a outra metade dos poços de controlo e controlos de ensaio, pipetae 10 ul de solução de D. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  9. Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

5. PAD4 tempo do curso ensaios a 37 ° C e RT

  1. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 125 mM de ZRcoum na água. Esta solução 125 uM ZRcoum será Solução A.
  2. Preparar um tampão de NaCl a 62,5 mM, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, e PAD4 5 uM (pH = 8,0). Este será Solução B.
  3. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução C.
  4. Obter duas placas de 96 poços e pipeta de 160 mL de solução B em # quantidade de poços (número de poços vai depender de quantos pontos de tempo).
  5. Incubar uma placa de 96 poços, a 37 ° C. Incubar a outra placa de 96 cavidades, à TA.
  6. Pipette 40 ul de solução A em todos os poços em ambas as placas de 96 poços e imediatamente pipeta 10 ul de solução C em t = 0 o mínimo de poços. Continue a adição de 10 ul de solução C em pontos de tempo específicos até que todos os poços foram temperada.
  7. Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

6. Ensaio de Inibição PAD4 à TA

  1. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução 83 mM de ZRcoum na água. Esta solução ZRcoum 83 uM será Solução A.
  2. Pesar Cl-amidina (MW 424,8 g / mol) e preparar uma solução stock de 100 uM. Este será Solução B.
  3. Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, e 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Este será Solução C.
  4. Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% e Triton X-100 (pH = 8,0). Thé será Solution D.
  5. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução E.
  6. Obter uma placa de 384 poços e poços para designar controles (sem PAD4), poços de teste (+ PAD4) e poços de inibição (PAD4 + Cl-amidina).
  7. Pipetar 25 mL de solução C em poços de teste e pipeta de 25 mL de solução de D em poços de controlo. Permitir tampão com / sem PAD4 a incubar nos poços durante 20 min à TA.
  8. Pipetar 10 ul de solução B em poços de inibição e incubar durante 20 min a RTe.
  9. Pipetar 15 ul de solução A em todos os poços e incubar durante 45 min à temperatura ambiente.
  10. Pipetar 10 mL de solução E para todos os poços. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  11. Obter uma leitura de fluorescência em um leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

7. Ensaio Lisado celular brutoà TA

  1. Após a colheita de células PAD4 crescimento de 1 L, ressuspender as células em 10 ml de 50 mM Tris, 50 mM de NaCl, 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM de ditiotreitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0.
  2. Lisar as células por sonicação durante 15 min a 4 ° C. Centrifuga-se o lisado celular a 20000 xg durante 20 min a 0 ° C. Concentra-se o sobrenadante claro até metade do volume por centrifugação a 4.000 rpm a 4 ° C utilizando 100k MW tubos de centrífuga de corte.
  3. De 10 ações ZRcoum mM, preparar uma solução de 250 mM de ZRcoum na água. Esta solução 250 uM ZRcoum será Solução A.
  4. Preparar um tampão de 100 mM de NaCl, 100 mM Tris, 20 mM de CaCl2, e TCEP 2 mM (pH = 8,0). Este será Solução B.
  5. Pesar tripsina, cristalino (a partir de pâncreas bovino) e preparar um 10 mg / ml em 100 mM de EDTA. Misturar a solução até clara e armazenar a -20 ° C. Este será Solução C.
  6. Obter um preto placa de 384 poços e designcomeu poços para controles (não lisado celular) e poços de teste (+ lisado celular).
  7. Pipetar 100 mL de solução B para todos os poços e pipeta 60 mL de lisado de células nos poços de teste. Incubar durante 20 min à TA.
  8. Pipetar 40 ul de solução A em todos os poços e incubar durante 45 min à temperatura ambiente.
  9. Pipetar 10 ul de solução C a todos os poços. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
  10. Obter uma fluorescência leitura em leitor multimodal com um comprimento de onda de excitação de 345 nm e um comprimento de onda de emissão de 465 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inicialmente, foi demonstrado que ZRcoum pode informar sobre a actividade de PAD4 num formato de placa de 96 poços. Os poços foram incubados com o substrato ZRcoum e na presença / ausência de PAD4. Após um período de incubação de 45 min a 37 ° C, a fluorescência foi medida com um 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Como esperado, os níveis permaneceram baixos de fluorescência como o fluoróforo dentro ZRcoum (ou a citrulina ZRcoum) manteve-se no estado bloqueado. Após a adição de excesso de tripsina / EDTA para a solução, os fluoróforos foram libertados a partir ZRcoum mas permaneceu praticamente inalterado na presença de PAD4. A adição de EDTA destina-se a auxiliar a cessação da reacção PAD4 devido à sua capacidade de quelar os iões de cálcio essenciais. A partir destes dados, uma redução de 5,2 vezes na saída de fluorescência foi observada na presença de PAD4. Em seguida, a amostraFoi demonstrado atibility do ensaio recentemente desenvolvido com plataformas de rastreio de alto rendimento. Era de interesse primário para analisar quatro variáveis ​​de reacção que seriam mais favorável para fins de rastreio de (1) a uma maior miniaturização do volume de ensaio (2) a possibilidade de realizar o ensaio à RT (3) a estabilidade da mistura de proteína e tampão antes de completar o ensaio e (4) a interferência potencial de solventes orgânicos / detergentes.

Para médio ou de alto rendimento esforços de triagem, bem pratos de alta densidade são comumente utilizados em telas pequenas moléculas. Verificou-se que o ensaio pode ser realizado de forma quase idêntica em uma placa de 384 poços, em comparação com uma placa de 96 poços (Figura 2B). Para determinar ainda mais as condições de trabalho para o ensaio num formato de alto rendimento, que era importante para investigar se a actividade PAD4 pode ser monitorizada num intervalo de tempo razoável, à TA. Uma vez que nem todos os instrumentos de manipulação de líquidos têmum controlador de temperatura, isso pode tornar-se difícil e oneroso para ter um passo de incubação a temperatura elevada. Além disso, o que representa variação de temperatura pode ser um motivo de discrepância entre as placas e corridas. A fim de determinar o efeito de temperaturas mais baixas para o ensaio aqui descrito, um ensaio semelhante foi realizada à temperatura ambiente. Verificou-se que os sinais eram praticamente inalterada entre 37 ° C e temperatura ambiente (Figura 3). Para optimizar ainda mais o desempenho do ensaio, minimizando o tempo de incubação necessário entre PAD4 e o substrato, a cinética da reacção foi analisada. PAD4 actividade foi monitorizada ao longo do tempo, tanto a temperatura ambiente e 37 ° C. Como se esperava, verifica-se que é mais activo PAD4 a 37 ° C (de acordo com a temperatura fisiológica humana) com a reacção quase completa em 20 min. Satisfatoriamente, a reacção não é fortemente afectada pela redução da temperatura até à TA. A reacção decorre a cerca de metade da velocidade como naelevada temperatura e é essencialmente completa 40-45 min pós iniciação. A partir do momento analisa claro, constantes cinéticas foram calculados e os parâmetros K (M = 397 uM, kcat = 2,98 seg -1, k cat / K M = 7,400 M -1 seg -1) foram encontrados para ser semelhante a outros PAD4 substratos. 31 Com a cinética da reacção caracterizada, todos os ensaios subsequentes foram reduzidos a 1 hora, mantida desde o início até ao ponto de medição.

Em seguida, a estabilidade de PAD4 foi avaliada quando dissolvido no tampão de reacção ao longo de um período de tempo prolongado. Na realidade, rastreio de alto rendimento requer reagentes para ser geralmente estável por muitas horas, enquanto o instrumento está a completar a tela. Se certos reagentes têm um período de vida útil relativa de minutos, ele pode ser bastante caro e demorado para terminar a blindagem, a fim de preparar reagentes frescos. Dependendo das condições de ensaio, não éincomum para alguns ensaios para ser incompatível com alta de triagem através de colocar-por isso mesmo. Com esta ideia em mente, a estabilidade do PAD4 em tampão foi monitorada ao longo de várias horas. Quase nenhuma perda de actividade enzimática foi observada durante todo o período de tempo, indicando assim que a proteína é estável, mesmo depois de se sentar à temperatura ambiente durante mais de 15 h (Figura 4A). Em seguida, foi avaliado se o ensaio executado sob condições miniaturizados e à TA seria ainda responder adequadamente à presença de um PAD4. Após a incubação do inibidor PAD4 conhecido, chloroamidine (Cl-amidina), conduziu a uma restauração completa do sinal de fluorescência consistente com a inibição completa de PAD4 (Figura 4B). Por fim, também foi verificado que a presença do solvente orgânico DMSO, comumente utilizado em soluções de reserva de moléculas pequenas, até 3% em volume final, não interferem com o ensaio (dados não apresentados). Da mesma forma, a adição de 0,01% de Triton X-100 resultou em SIMtendências homólogos de fluorescência (dados não mostrados).

Tendo mostrado que o ensaio é tolerante para uma variedade de condições que são normalmente encontradas em pequenos esforços de descoberta de drogas de molécula, um rastreio preliminar de 80 compostos foi realizado robusto e um valor Z »de 0,71 foi identificado. Ao prosseguir com o potencial do ensaio, a selectividade da reacção PAD4 / ZRcoum foi destacada realizando a reacção em bruto lisados ​​de células inteiras. E. células de E. coli contendo o GST-PAD4 vector de expressão foi induzida com IPTG, semelhante ao procedimento utilizado para o isolamento da GST-PAD4. Após a ruptura da membrana celular por meio de ultra-sons, os detritos celulares foi separado por centrifugação para produzir um lisado celular clarificado. Quando o lisado celular contendo PAD4 foi submetido às mesmas condições de ensaio como o ensaio de GST-PAD4 purificada, o sinal de fluorescência variou de acordo com a presença de PAD4 activo em solução ( > Figura 5). Os lisados ​​celulares contêm um número de biomacromoléculas em altas concentrações que poderiam potencialmente interferem com a actividade de PAD4, as propriedades fluorescentes de ZRcoum, e o passo de tripsina. A constatação de que o ensaio foi funcional em lisados ​​celulares em bruto indica que existe uma elevada selectividade na reacção entre PAD4 e ZRcoum. Para demonstrar ainda que a diminuição do sinal na presença de lisados ​​celulares em bruto foi específica para a presença de PAD4 activo, o efeito de Cl-amidina, um inibidor covalente PAD4 estabelecida, foi avaliada. A adição de Cl-amidina conduziu a uma restauração no sinal de fluorescência, consistente com a inactivação de PAD4 (Figura 5). Juntos, foi demonstrado que o ensaio pode ser ainda mais simplificada, utilizando lisados ​​celulares em bruto para o monitoramento da atividade PAD4.

2.114 / 52114fig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Figura 1. PAD4 e o desenho do seu ensaio baseado em fluorescência. (A) Representação dos desenhos dos conjuntos de histonas que compõem a unidade básica de um nucleossoma. PAD4 catalisa a citrulinação de um número de resíduos de arginina em proteínas histona. (B) ZRcoum cobertas com o substrato nativo (escondido para maior clareza) de PAD4 (código adesão 2DW5). (C) Representação das etapas em um ensaio típico PAD4. Citrullination por PAD4 do ZRcoum substrato reduz sua suscetibilidade a amida hidrólise mediada pela tripsina, causando, assim, uma mudança nos níveis de fluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.

A Figura 2 Figura 2. PAD4 no ensaio de 96 poços e formatos de 384 poços de placas. A fluorescência foi medida (excitação 345 nm / emissão 465 nm), tanto num formato de 96 poços (A) e formato de 384 poços (B) com as condições designadas (37 ° C). A adição da protease do tipo tripsina leva a um grande aumento nos níveis de fluorescência em poços sem PAD4 e permanece virtualmente inalterada durante os poços com PAD4. Os dados são representados como média + SD (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.

A Figura 3
Figura 3. Análise curso Tempo de PAD4 ensaio. A fluorescência foi medida (excitação 345 nm / emissão 465 nm) periodicamente num formato de placa de 96 poços ao longo de 70 min com a proteína a ser incubadas a 37° C (A) ou à temperatura ambiente (B). Os dados são representados como média +/- SD (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.

Figura 4
Figura 4. A estabilidade proteica e da inibição. (A) A actividade da PAD4 foi medida após os intervalos de tempo designados. Para efeitos de comparação, os níveis de fluorescência são mostrados na ausência de PAD4. Níveis de fluorescência são mostradas antes (vermelho) e a seguir (verde) a adição de tripsina. (B) introdução do inibidor conhecido PAD4 Cl-amidina (100 uM) conduziu a uma restauração do sinal de fluorescência em um formato de placa de 384 poços, à TA. Níveis de fluorescência são mostradas antes (vermelho) e a seguir (verde) a adição de tripsina. Todos os dados são represented como média +/- SD (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.

A Figura 5
Figura 5. ensaio de lisado celular em bruto. O ensaio foi realizado na ausência e na presença de lisados ​​celulares em bruto num formato de placa de 384 poços, à TA. Níveis de fluorescência são mostradas antes (vermelho) e a seguir (verde) a adição de tripsina. Cl-amidina (100 uM) também causou um aumento em sinal de fluorescência sob estas condições. Todos os dados são representados como média +/- SD (n = 3). Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

Chemistry Edição 93 PAD4 PADI4 citrulinação a arginina a modificação pós-translacional HTS ensaio fluorescência citrulina
Monitoramento baseado em fluorescência de PAD4 Atividade através de um substrato Analog Pro-fluorescência
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter