Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Флуоресценции основе Контроль PAD4 деятельности через Pro-флуоресцентной субстрата Analog

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Большое количество белков млекопитающих в значительной степени изменены под действием ферментов следующей биосинтеза белков рибосомой. Эти пост-трансляционные модификации (PTMs) может значительно увеличить функциональное разнообразие протеоме, изменяя размер, заряд, структуру и состояние олигомеризации (среди других особенностей) белков 1-3. В результате, изменение в структуре белка может привести к физиологических последствий, таких как деградации белка, клеточной дифференцировки, сигнализации, в модуляции экспрессии гена, и белок-белковых взаимодействий. В то время как эти модификации распространены в большом проценте всех белков человека, терминал заканчивается на гистоновых белков пройти необычно высокое число ковалентных модификаций 4. Гистоновых белков представляют собой семейство структурных белков, которые способствуют конденсации геномной ДНК. Ковалентные модификации неструктурированных гистонов осуществляется и регулируется серииы ферментов, которые могут катализировать ковалентной модификации остатков (писатели), обратного те же изменения (ластики), и различие между изменениями импринтируемые на гистонов (читателей) 5-7. В самом деле, большинство известных PTMs можно наблюдать в течение этого короткого отрезка гистона включая метилирование, фосфорилирование, ацетилирование, SUMOylation, убиквитинирования, и citrullination 8.

Citrullination включает конверсию пептидил-аргинина к не-т РНК кодируется пептидил-цитруллин (Фигура 1А). Белки, отвечающие за этот боковой цепи нейтрализации, являются членами ОП (р eptide в rginine D eiminase) семейства белков, все из которых являются кальций-зависимых ферментов. 9,10. На сегодняшний день, пять членов семьи PAD были описаны (PAD1, pad2, PAD3, PAD4 и PAD6). Каждый член этого семейства появляется целевой различных клеточных белков, а также отображает UNIQue распределительные ткани профили. PAD4 является единственным членом этого семейства белков как известно, локализованный в ядре с помощью последовательности ядерной локализации 11. Соответственно, было показано, что deiminate ряд ядерных мишеней, в том числе аргинина боковых цепей на N-концевых хвостов гистонов H2A остатка аргинина 3 (H2R3), Н3 (H3R2, H3R17, и H3R26) и H4 (H4R3) 12, 13. В то время как каждый из PAD изоферментов есть конкретные и важные физиологические функции, PAD4 получил значительно больше внимания из-за его роли в ряде населенных процессов в обоих больных и здоровых клеток. В последнее время, PAD4 было показано, что член плюрипотентность транскрипционной сети 14. Оба уровни экспрессии PAD4 и деятельность были показаны, что повышается во время перепрограммирования и основного состояния плюрипотентных государств на мышах. Управляя регуляции генов стволовых клеток, PAD4 может сохранить ключевую роль в эффективности клеточного перепрограммирования. PAD4 также участвует вформирование нейтрофилов внеклеточных ловушек, которые при связывании патогенов включить их системы очистки. Hypercitrullination из гистоновых белков путем PAD4 индуцирует деконденсацию хроматина, который служит в качестве базового материала для инкапсуляции патогенных бактерий путем внеклеточного ловушку, тем самым отвести бактериальных инфекций 15,16.

Кроме того, PAD4 было установлено, играть активную роль в ряде заболеваний человека. Ранее было показано, что аберрантная экспрессия PAD4 связан с началом и тяжести ревматоидного артрита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянный склероз и 17. В самом деле, присутствие анти-цитруллинированных белковых антител является одним из наиболее надежных и окончательных диагностических и прогностических биомаркеров ревматоидного артрита 18. Аналогичным образом, нарушением регуляции активности PAD4 недавно было отмечено в ряде злокачественных опухолей человека, включая рак яичников, молочной железы, легкого, сг рака пищевода 19-22. Связь между PAD4 и рака было показано, чтобы быть опосредованы через онкогена ELK1 или через супрессора опухолевого белка р53 22,23 и предыдущая работа предположил, что PAD4 может быть новым противораковым терапевтической мишенью 17,24,25. В качестве доказательства принцип исследования, истощение PAD4 через shRNA в колоректального клеточной линии рака НСТ116 Было показано, что достаточно для индукции апоптоза и клеточного цикла 26. Недавно был разработан необратимый ингибитор PAD4 привело к снижению массы опухоли у мышей 27 в семьдесят процентов. Довольно удивительно, PAD4 торможение, казалось, выступать в качестве целевой терапии, в результате селективного убийства раковых клеток, щадя непреобразованной клетки.

Использование малых молекул, чтобы выключить функцию PAD4 может оказаться мощным новая стратегия, чтобы раковые клетки или дополнить существующие химиотерапевтические рака 28. К сожалению, POПалатка обратимым PAD4 ингибитор еще предстоит открыть. Ряд ингибиторов ковалентных были разработаны с использованием хлора / фтора imidine ручку, который имитирует аргинин субстрат 27,29,30 и зарекомендовали себя как практические инструменты для понимания роли PAD4 в обоих здоровых и больных государственных клеток. Тем не менее, эти молекулы ингибируют все активные колодки с аналогичной активностью. Таким образом, потребность в поспешном анализа, который сообщает о деятельности PAD4 имеет решающее значение. На сегодняшний день PAD4 анализы были описаны, что связать высвобождение аммиака в результате реакции на колориметрический считывания 31, используют флуоресцентно меченого субстрата chloroamidine аналог для поляризации флуоресценции анализа 32, опираются на реакции кислоты при содействии между глиоксаля и цитруллина 33, и пара деятельность PAD4 к флуоресценции шаг 34 dequenching. Из них только ковалентная модификатор стратегия haloacetamidine доказал, чтобы быть совместимым с высокой пропускной Screрение платформы 32,35,36. Мы описываем легкое флуоресценции, основанный анализ, который надежно измеряет активность PAD4. Анализ, который отображает сильный сигнал-шум, скорость анализа и надежности измерений, имеет потенциал, чтобы открыть для себя по-настоящему мощным и селективным ингибитором PAD4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 Трансформация, Expression, и очистка

  1. Для PAD4 трансформации, преобразования плазмиды pGEX содержащий PAD4 GST слияние в химически компетентных Е. Coli (BL21 (DE3)) клетки для экспрессии белка, используя следующую процедуру. Подготовка химически компетентную (хлорид кальция) Е. Coli (BL21 (DE3)) клетки в соответствии со стандартными протоколами.
    1. Оттепели 50 мкл ранее подготовленного химически компетентных клеток BL21 (DE3) на льду и смешать с 1 мкл плазмиды pGEX содержащей ген PAD4 в 5 мл пробирку с. Выдержите смесь на льду в течение 10 мин при осторожном встряхивании каждые 2 мин.
    2. Теплового шока клетки помещением смеси в водяной бане при 42 ° в течение 40 сек. Сразу же место клетка-плазмиды смесь снова на льду в течение 2 мин, чтобы позволить клетки для восстановления. Добавить 1 мл стерильного LB бульоне к смеси и поместите на льду в течение 1 мин.
    3. Инкубируйте клетки подвергали тепловому шоку при 37 ° С, встряхивая при 250 оборотах в минуту в течение 1ч. Пипетка 75 мкл трансформированных клеток на устойчивости к ампициллину в чашки с агаром и инкубировали при 37 ° С в течение 15 ч. Магазин пластины при температуре 4 ° С.
  2. PAD4 Expression.
    1. Pick 1 колонию BL21 (DE3) с ампициллином агаром и месте в 5 мл LB, содержащих ампициллин 1x. Место в инкубаторе и пожать O / N при 37 ° С.
    2. Перенесите 5 мл LB (стартера) в 1 л стерильной LB, содержащей 1x тригидрат ампициллина (МВт 403,45 г / моль). Рост Место в 37 ° C дрожащим инкубатора. Монитор OD 600 от роста. Когда рост достигает OD 600 0.3, двигаться рост в 16 ° C, пожимая инкубатор.
    3. По достижении наружный диаметр 600 из 0,6-индуцировать клетки с 0,3 мМ IPTG (isopropylthiagalactoside, МВт 238,30 г / моль). Разрешить клетки встряхивают в течение 15 ч при 16 ° С.
    4. Урожай клетки центрифугированием при 4000 х г в течение 20 мин при 0 ° С. Слить надосадочную жидкость и осадок магазина при -80 ° С.
  3. PAD4 Очистка
    1. Повторное приостановить осадок, содержащий выраженное в PAD4 BL21 (DE3) в буфере 50 мМ NaCl (МВт 58,44 г / моль), 300 мМ NaH 2 PO 4 (MW 119,98 г / моль), 10 мМ имидазола (MW 68,077 г / моль), 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ, МВт 174,94 г / моль) и 1 мМ дитиотреитола (ДТТ, 154,25 г / моль), рН = 8,0.
    2. Лизиса клеток с помощью обработки ультразвуком в течение 15 мин при 4 ° С. После обработки ультразвуком, центрифугировать клеточного лизата при 20000 х г в течение 20 мин при 0 ° С. Слейте и сохраните супернатант. Пакетный супернатант с глутатион (GSH) агарозных бусин в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Слейте супернатант из GST бисером / колонки с помощью гравитации. Промыть шарики с 4 х 25 мл 1х PBS (фосфатно-солевым буфером, рН = 8,0) при комнатной температуре.
    4. Элюировать PAD4 с 2 х 10 мл буфера для элюции, 50 мМ трис (гидроксиметил) аминометан (Трис-основание, МВт 121,14 г / моль), 10 мМ глутатион (GSH, МВт 307,32 г / моль), рН = 8,0.
    5. Концентрат PAD4 используя 100k МВт вырезать-оFF центрифужные пробирки и центрифуги в 4000 мкг в течение 20 мин при 4 ° С. Аликвоты белка в 200 мкл объемы в 1,0 мл микроцентрифужных пробирках и хранить при -80 ° С.

2. Подготовка Сток Решения для буферов

  1. Взвесить хлорид натрия (NaCl, МВт 58,44 г / моль) и приготовить раствор 2 М. Смешайте решение пока ясно.
  2. Взвесить Трис (гидроксиметил) аминометан (Трис-основание, МВт 121,14 г / моль) и подготовить 2 М раствор, рН = 8,0. Смешайте решение пока ясно.
  3. Взвесить дигидрата хлорида кальция (CaCl 2 2H 2 O, МВт 147,01 г / моль) и получением раствора 500 мМ. Смешайте решение пока ясно.
  4. Взвесить Трис (2-карбоксиэтил) фосфин (ТСЕР, МВт 250,19 г / моль) и получением раствора 200 мМ. Смешайте решение пока ясно и хранить при температуре -20 ° С.
  5. Взвесить дитиотреитола (ДТТ, MW 154,25 г / моль) и получением раствора 1 М. Смешайте решение пока ясно и хранить при температуре -20 ° С.
  6. Подготовить0,5% -ный раствор Тритона Х-100.
  7. Взвесить этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА, МВт 292,24 г / моль) и получением раствора 100 мМ. Смешайте решение пока ясно.
  8. Взвесить Z-Arg-Arg-7- amido- 4- метилкумарин гидрохлорида (ZRcoum, МВт 621,69 г / моль) и подготовить 10 мМ раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО).

3. PAD4 анализа при 37 ° C

  1. От 10 мм ZRcoum складе, подготовить 125 мкм решение ZRcoum в воде. Это решение 125 мкмоль ZRcoum будет решение А.
  2. Подготовить буфер 62,5 мМ NaCl, 62,5 мМ Трис, 12,5 мм CaCl 2, 6,25 мМ DTT и 5 мкм PAD4 (рН = 8,0). Это будет решение Б.
  3. Готовят буфер 62,5 мМ NaCl, 62,5 мМ Трис, 12,5 мМ CaCl 2, и 6,25 мМ DTT (рН = 8,0). Это будет решение C.
  4. Взвесить трипсин, кристаллический (из бычьей поджелудочной железы) и подготовить 10 мг / мл в 100 мМ ЭДТА. Смешайте решение пока ясно и хранить при температуре -20° С. Это будет решение D.
  5. Получить 96-луночного планшета и назначить ряд скважин для контроля (без PAD4) и разведочных скважин (+ PAD4).
  6. Внесите 160 мкл раствора В в тестовых скважин и пипетки 160 мкл раствора С в контрольных скважин. Инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С.
  7. Пипетка 40 мкл раствора А во все лунки и инкубируют при 37 ° С в течение 45 мин.
  8. Пипеток 10 мкл дН 2 O в половине контрольных скважин и половины испытательных скважин. Для другой половины контрольных испытаний скважин и управления, пипетки 10 мкл раствора D. инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С.
  9. Получить флуоресценции чтения на мультимодальной читателя с длиной волны возбуждения 345 нм и длине волны эмиссии 465 нм.

4. PAD4 анализа при комнатной температуре

  1. От 10 мм ZRcoum складе, подготовить 50 мкм решение ZRcoum в воде. Это решение ZRcoum 50 мкмоль будет решение А.
  2. Подготовить буфер 100 мм NaCl, 100 мМ Трис, 20 мМ CaCl 2, 2 мМ TCEP, 0,02% Тритона Х-100, и 8 мкМ PAD4 (рН = 8,0). Это будет решение Б.
  3. Готовят буфер 100 мМ NaCl, 100 мМ Трис, 20 мМ CaCl 2, 2 мМ TCEP, и 0,02% Triton X-100 (рН = 8,0). Это будет решение C.
  4. Взвесить трипсин, кристаллический (из бычьей поджелудочной железы) и подготовить 10 мг / мл в 100 мМ ЭДТА. Смешайте решение пока ясно и хранить при температуре -20 ° С. Это будет решение D.
  5. Получить 384-луночного планшета с и назначить скважин для контроля (без PAD4) и испытательных скважин (+ PAD4).
  6. Внесите 25 мкл раствора В в тестовых скважин и пипетки 25 мкл раствора С в контрольных скважин. Разрешить буфер с / без PAD4 инкубировать в скважинах в течение 20 мин при комнатной температуре.
  7. Пипеток 25 мкл раствора С во все лунки и инкубировать в течение 45 мин при комнатной температуре.
  8. Пипеток 10 мкл дН 2 O в половине контрольных скважин и половины испытательных скважин. Для другой половины контрольных скважин и испытаний элементов управления, pipettE 10 мкл раствора D. инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  9. Получить флуоресценции чтения на мультимодальной читателя с длиной волны возбуждения 345 нм и длине волны эмиссии 465 нм.

5. PAD4 Время курса Анализы на 37 ° С и РТ

  1. От 10 мм ZRcoum складе, подготовить 125 мкм решение ZRcoum в воде. Это решение 125 мкмоль ZRcoum будет решение А.
  2. Подготовить буфер 62,5 мМ NaCl, 62,5 мМ Трис, 12,5 мм CaCl 2, 6,25 мМ DTT и 5 мкм PAD4 (рН = 8,0). Это будет решение Б.
  3. Взвесить трипсин, кристаллический (из бычьей поджелудочной железы) и подготовить 10 мг / мл в 100 мМ ЭДТА. Смешайте решение пока ясно и хранить при температуре -20 ° С. Это будет решение C.
  4. Получить 2 96-луночных и пипетки 160 мкл раствора B в # количества скважин (# скважин будет зависеть от того, сколько временных точках).
  5. Инкубируйте один 96-луночный планшет при 37 ° С. Инкубируйте другой 96-луночный планшет при комнатной температуре.
  6. ПипEtte 40 мкл раствора А во все лунки в обоих 96-луночных и сразу же пипеткой 10 мкл раствора C в Т = 0 мин скважин. Продолжить добавлением 10 мкл раствора C в определенных временных точках, пока все лунки не были гасили.
  7. Получить флуоресценции чтения на мультимодальной читателя с длиной волны возбуждения 345 нм и длине волны эмиссии 465 нм.

6. PAD4 Анализ ингибирования при комнатной температуре

  1. От 10 мм ZRcoum складе, подготовить 83 мкМ раствор ZRcoum в воде. Это решение ZRcoum 83 мкмоль будет решение А.
  2. Взвесить CL-амидина (Mw 424,8 г / моль) и подготовить 100 мкМ исходного раствора. Это будет решение Б.
  3. Готовят буфер 100 мМ NaCl, 100 мМ Трис, 20 мМ CaCl 2, 2 мМ TCEP, 0,02% Triton X-100 и 8 мкм PAD4 (рН = 8,0). Это будет решение C.
  4. Готовят буфер 100 мМ NaCl, 100 мМ Трис, 20 мМ CaCl 2, 2 мМ TCEP, и 0,02% Triton X-100 (рН = 8,0). Чтэто будет решение D.
  5. Взвесить трипсин, кристаллический (из бычьей поджелудочной железы) и подготовить 10 мг / мл в 100 мМ ЭДТА. Смешайте решение пока ясно и хранить при температуре -20 ° С. Это будет решение E.
  6. Получить 384-луночного планшета с и назначить скважин для контроля (без PAD4), лунок (+ PAD4) и ингибирование скважин (PAD4 + Cl-амидин).
  7. Внесите 25 мкл раствора С в тестовых скважин и пипетки 25 мкл раствора D в контрольных скважин. Разрешить буфер с / без PAD4 инкубировать в скважинах в течение 20 мин при комнатной температуре.
  8. Пипеток 10 мкл раствора В в ингибирования скважин и выдержать в течение 20 мин при RTE.
  9. Пипеток 15 мкл раствора А во все лунки и инкубировать в течение 45 мин при комнатной температуре.
  10. Внесите 10 мкл раствора E для всех скважин. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  11. Получить флуоресценции чтения на мультимодальной читателя с длиной волны возбуждения 345 нм и длине волны эмиссии 465 нм.

7. Сырая клеточного лизата Пробирнойпри комнатной температуре

  1. После сбора клеток из PAD4 1 л роста, ресуспендирования клеток в 10 мл 50 мМ Трис, 50 ​​мМ NaCl, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ, МВт 174,94 г / моль) и 1 мМ дитиотреитола (ДТТ, 154,25 г / моль), рН = 8,0.
  2. Лизиса клеток с помощью обработки ультразвуком в течение 15 мин при 4 ° С. Центрифуга клеточного лизата при 20000 х г в течение 20 мин при 0 ° С. Концентрат прозрачный супернатант до половины объема путем центрифугирования при 4000 оборотах в минуту при 4 ° С с использованием 100k МВт отрезные центрифужные пробирки.
  3. От 10 мм ZRcoum складе, подготовить 250 мкм решение ZRcoum в воде. Это решение 250 мкмоль ZRcoum будет решение А.
  4. Готовят буфер 100 мМ NaCl, 100 мМ Трис, 20 мМ CaCl 2, и 2 мМ TCEP (рН = 8,0). Это будет решение Б.
  5. Взвесить трипсин, кристаллический (из бычьей поджелудочной железы) и подготовить 10 мг / мл в 100 мМ ЭДТА. Смешайте решение пока ясно и хранить при температуре -20 ° С. Это будет решение C.
  6. Получение черный 384-луночный планшет и дизайнели скважин для контроля (нет клеточных лизатов) и испытательных скважин (+ клеточных лизатов).
  7. Внесите 100 мкл раствора В во все лунки и пипетки 60 мкл лизата клеток в тестовых скважин. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
  8. Пипеток 40 мкл раствора А во все лунки и инкубировать в течение 45 мин при комнатной температуре.
  9. Внесите 10 мкл раствора С до всех скважин. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  10. Получить флуоресценции чтения на мультимодальных читателя с длиной волны возбуждения 345 нм и длине волны эмиссии 465 нм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изначально, было показано, что ZRcoum можете сообщить о деятельности PAD4 в формате пластины 96-луночного. Лунки инкубировали с субстратом ZRcoum и в наличии / отсутствии PAD4. После инкубационного периода 45 мин при 37 ° С, флуоресценции измеряли с помощью 340/40 - 475/15 нм фильтра (фиг.2А). Как и ожидалось, уровни флуоресценции оставалась низкой, как флуорофора в ZRcoum (или цитруллинированному ZRcoum) оставались в закрытом состоянии. При добавлении избытка трипсина / EDTA в растворе, флюорофоры были освобождены от ZRcoum но оставались в основном неизменными в присутствии PAD4. Добавление ЭДТА предназначен для оказания помощи в прекращении реакции PAD4 из-за его способности хелатных основные ионы кальция. Из этих данных, уменьшение 5,2-кратное выход флуоресценции наблюдалась в присутствии PAD4. Далее, компatibility из недавно разработанного теста с высокопроизводительного скрининга платформ была продемонстрирована. Это был основной интерес для анализа четыре реакционные переменные, которые были бы наиболее благоприятным для целей скрининга (1) дальнейшая миниатюризация объема анализа (2) возможность проведения анализа при комнатной температуре (3) стабильность белковой смеси и буферной до завершения анализа и (4) возможных помех органических растворителей / моющих средств.

Для средних и усилий высокопроизводительного скрининга, а плиты высокой плотности, как правило, используется в небольших экранах молекул. Было подтверждено, что анализ может быть выполнен практически одинаково в 384-луночный планшет с по сравнению с 96-луночного планшета (Фигура 2В). В дальнейшем определении условий труда для анализа в формате высокой пропускной важно исследовать вопрос о том PAD4 деятельность можно отслеживать в разумные сроки при комнатной температуре. Так как не все жидкие обработки инструментов естьРегулятор температуры, она может стать громоздким и дорогим, чтобы иметь стадию инкубации при повышенной температуре. Кроме того, что составляет колебания в температуре может быть причиной для расхождений между пластинами и работает. Для того чтобы определить влияние более низких температурах для анализа, описанного здесь, аналогичный анализ проводили при комнатной температуре. Было установлено, что сигналы практически не изменились между 37 ° С и комнатной температуре (рисунок 3). Для дальнейшей оптимизации характеристик анализа путем минимизации требуемого времени инкубации между PAD4 и подложкой, кинетика реакции анализировали. PAD4 активность контролировали с течением времени и при комнатной температуре и 37 ° С. Как и ожидалось, оказалось, что PAD4 более активен при 37 ° C (в соответствии с физиологической температуре человеческого) с реакцией в основном полного на 20 мин. Удовлетворительно, реакция не сильно влияет на снижение температуры вплоть до комнатной температуры. Реакция протекает при температуре приблизительно половину скорости как наповышенной температуре и, по существу, полное 40-45 мин после инициации. С того времени, конечно анализирует, Кинетические константы были рассчитаны и параметры (K M = 397 мкМ, к кот = 2,98 с -1, к кат / К М = 7400 сек -1 М -1), оказались аналогичны другим PAD4 субстраты. 31 с кинетикой реакции характерно, все последующие анализы были снижены до 1 часа от начала до точки измерения.

Далее, стабильность PAD4 оценивали при растворении в реакционном буфере в течение длительного периода времени. Реально, высокий скрининг потребует реагенты в целом стабильными в течение многих часов, пока прибор завершает экран. Если какие-то реактивы имеют относительную срок годности минут, это может быть весьма дорогим и трудоемким, чтобы прекратить экран для того, чтобы подготовить свежие реагенты. В зависимости от условий анализа, это ненеобычный для некоторых анализов, несовместимы с высоким сквозным положить скрининга по этой самой причине. С этой идеи в виду, стабильность PAD4 в буфере наблюдают в течение нескольких часов. Практически без потерь в ферментативной активности не наблюдалось в течение всего периода времени, таким образом, указывая, что белок устойчив даже после того, как сидит при КТ в течение более чем 15 часов (рис 4а). Далее, она была оценена ли анализ работать под миниатюрных условиях и при комнатной температуре еще будет соответствующим образом реагировать на присутствии PAD4. По инкубации известной PAD4 ингибитора, chloroamidine (Cl-амидиновой), привели к полному восстановлению сигнала флуоресценции в соответствии с полной ингибирования PAD4 (рис 4В). Наконец, было также подтверждено, что присутствие органического растворителя ДМСО, обычно используемый в маточных растворов малых молекул, до 3% конечного объема, как, не вли ни на анализ (данные не показаны). Кроме того, добавление 0,01% Triton X-100 привело к SIM-картеИлар тенденции флуоресценции (данные не показаны).

Показав, что анализ толерантен к различным условиям, которые обычно встречаются в небольших молекул усилий поиска новых лекарственных препаратов, предварительный скрининг соединений 80 и было проведено надежный значение Z 'из 0,71 был идентифицирован. В дальнейшей потенциал анализа, селективность реакции PAD4 / ZRcoum был выделен при проведении реакции в сырых цельных клеточных лизатов. Е. палочки клетки, содержащие вектор экспрессии GST-PAD4 индуцировали с помощью IPTG, аналогичной процедуре, используемой для выделения GST-PAD4. После разрушения клеточной мембраны через ультразвуком, клеточные обломки отделяли центрифугированием с получением осветленного клеточного лизата. Когда PAD4 содержащих лизат клеток был представлен теми же условиях анализа, как и очищенный GST-PAD4 анализа, флуоресценции сигнала изменялась в соответствии с наличием активной PAD4 в растворе ( > Рисунок 5). Клеточные лизаты содержат ряд биомакромолекул при высоких концентрациях, которые потенциально могут помешать деятельности PAD4, флуоресцентные свойства ZRcoum, и шаг трипсина. Тот факт, что этот анализ был функционален в сырых клеточных лизатов показывает, что существует высокая селективность в реакции между PAD4 и ZRcoum. Для дальнейшей демонстрации, что уменьшение сигнала в присутствии лизатов неочищенного клеточного конкретно с наличием активной PAD4, эффект Cl-амидина, установленной ковалентной PAD4 ингибитора, была оценена. Добавление Cl-амидин привело к восстановлению в флуоресцентного сигнала, в соответствии с инактивации PAD4 (рисунок 5). Вместе, было продемонстрировано, анализ может быть дополнительно упрощена путем использования лизатов неочищенного клеточного для мониторинга PAD4 активности.

2114 / 52114fig1highres.jpg "ширина =" 600 "/>
Рисунок 1. PAD4 и дизайн ее флуоресценции на основе анализа. (А) Мультфильм представление гистонов собраний, которые составляют основную единицу нуклеосоме. PAD4 катализирует citrullination ряда остатков аргинина на белков гистонов. (B) ZRcoum обложил родной подложке (скрытой для ясности) из PAD4 (присоединение кода 2DW5). (C) Представительство шагов в типичном PAD4 анализа. Citrullination по PAD4 подложки ZRcoum снижает ее восприимчивость к трипсина опосредованного гидролиза амида, тем самым вызывая изменение уровня флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунка.

Рисунок 2 Рисунок 2. PAD4 анализа в 96-луночных и 384-луночные пластины форматов. Флуоресценции измеряли (возбуждение 345 нм / испускание 465 нм) в оба формата 96-а (А) и 384-луночный формат (В) с назначенными условиях (37 ° С). Добавление протеазы трипсина приводит к значительному увеличению уровня флуоресценции в скважинах без PAD4 и остается практически неизменным в течение скважин с PAD4. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунка.

Рисунок 3
Рисунок 3. Время Конечно анализ PAD4 анализа. Флуоресценции измеряли (возбуждение 345 нм / испускание 465 нм) периодически в формате 96-луночного планшета в течение 70 минут с белком быть инкубировали либо при 37° С (А) или при комнатной температуре (В). Данные представлены как среднее +/- SD (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунка.

Рисунок 4
Рисунок 4. стабильности белка и ингибирование. (А) Активность PAD4 измеряли после назначенных временных интервалах. Для сравнения, уровни флуоресценции, показаны в отсутствие PAD4. Уровни флуоресценции показаны предварительное (красный) и следующий (зеленый) добавление трипсина. (B) Введение Известно ингибитора PAD4 Cl-амидин (100 мкм) привело к восстановлению сигнала флуоресценции в формате 384-луночного планшета при комнатной температуре. Уровни флуоресценции показаны предварительное (красный) и следующий (зеленый) добавление трипсина. Все данные являются represented как среднее +/- SD (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунка.

Рисунок 5
Рисунок 5. Сырой клеточный лизат анализа. Анализ проводили в отсутствие и в присутствии сырых клеточных лизатов в формате 384-луночного планшета при комнатной температуре. Уровни флуоресценции показаны предварительное (красный) и следующий (зеленый) добавление трипсина. Cl-амидина (100 мкМ) также вызывал увеличение сигнала флуоресценции при этих условиях. Все данные представлены в виде среднего +/- SD (п = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

Химия выпуск 93 PAD4 PADI4 citrullination аргинин посттрансляционной модификации HTS анализ флуоресценция цитруллин
Флуоресценции основе Контроль PAD4 деятельности через Pro-флуоресцентной субстрата Analog
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter