Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan'a bağlı İzleme

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Memeli proteinlerinin bir çok sayıda ağır ribozom tarafından proteinlerin sentezi, aşağıdaki enzimlerin etkimesi ile modifiye edilir. Bu post-translasyonel modifikasyonlar, (PTMS) büyük ölçüde protein 1-3 arasında (diğer özellikleri yanı sıra) boyut, yük, yapı ve oligomerizasyon durumunu değiştirerek Proteome fonksiyonel çeşitliliği artırabilir. Bunun bir sonucu olarak, protein yapısındaki bir değişiklik, örneğin protein bozulması, hücre farklılaşması, iletimde, gen ekspresyonunda modülasyonu ve protein-protein etkileşimleri gibi fizyolojik sonuçlara yol açabilir. Bu değişiklikler tüm insan proteinlerinin büyük bir yüzdesi görülürken histon proteinler kovalent modifikasyonlar 4 alışılmadık derecede yüksek sayıda geçmesi üzerine, terminal biter. Histon proteinler genomik DNA yoğunlaştırılmasını kolaylaştırır, yapısal proteinlerin bir ailesidir. Yapılandırılmamış histon kuyrukları Kovalent modifikasyonlar bir seride tarafından yürütülen ve düzenlenir, artıkları (yazarlar) ve kovalent modifikasyonunu katalize aynı değişiklikleri (silgiler), ters ve değişiklikler arasında ayrım enzimlerin s histon kuyrukları (okuyucu) 5-7 üzerine basılmış olan. Aslında, bilinen PTMS en metilasyon, fosforilasyon, asetilasyon, sumoylation, ubikitinasyon ve sitrülinlenmesine 8 de dahil olmak üzere histonun bu kısa segmenti içinde görülmektedir.

Sitrülinlenmesine olmayan T RNA kodlanmış peptidil-sitrulin (Şekil 1A) peptidil-argininin dönüştürülmesini kapsar. Bu yan zinciri nötrleştirme sorumlu proteinleri, PAD üyesi olan kalsiyum-bağımlı enzimler olması her biri. 9,10, protein ailesini (s rginine D eiminase peptit). Bugüne kadar, PAD ailesinin beş üyesi (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 ve PAD6) 'de tarif edilmiştir. Bu ailenin her üyesi farklı hücresel proteinleri hedef görünür ve aynı zamanda uni görüntülerque doku dağılımı profilleri. PAD4 bir nükleer lokalizasyon dizisi 11 ile çekirdek içinde lokalize olduğu bilinmektedir, bu protein ailesinin tek üyesidir. Bu duruma göre, histon H2A arginin kalıntısının 3, PCR'ın N-terminal kuyrukları arginin yan zincirler (H2R3), H + 3 (H3R2, H3R17 ve H3R26) ve H4 (H4R3) 12 nükler hedeflerin bir dizi deiminate gösterilmiştir, 13. PAD izozimlerinin, her özel ve kritik fizyolojik işlevlere sahip olsa da, PAD4 dolayı hastalıklı ve sağlıklı hücrelerinin her ikisinde de, insan gibi bir dizi işlem rolünü önemli ölçüde daha fazla ilgi çekmektedir. Son zamanlarda, PAD4 Pluripotency transkripsiyonel ağı 14 üye olduğu gösterilmiştir. Her iki PAD4 sentezleme seviyeleri ve aktivite, farelerde yeniden programlama ve taban durumu, pluripotent durumlarında yüksek olduğu gösterilmiştir. Kök hücre genlerin düzenlenmesini kontrol edilerek, PAD4 hücre yeniden programlama veriminde önemli bir rol tutabilirler. PAD4 de implike edilmiştirüzerine patojenlerin bağlanmasını nötrofil hücre dışı tuzakları, oluşumu kendi sistem açıklığı sağlar. PAD4 histon proteinleri hypercitrullination dolayısıyla bakteriyel enfeksiyonların 15,16 sakınma, hücre dışı tutucusu ile, patojen bakterilerin kapsüllenmesi için taban malzemesi olarak hizmet eden kromatin yoğunluk azaltılmasından neden olur.

Buna ek olarak, PAD4 insan hastalıklarının bir dizi aktif bir rol oynadığı tespit edilmiştir. Daha önce PAD4 anormal ekspresyon romatoid arteritin başlamasında ve şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilmiştir, Alzheimer, Parkinson hastalığı ve multipl skleroz 17. Aslında, bir anti-sitrülin proteinin antikorların varlığı romatoid artrit 18 arasında en güvenilir ve kesin bir teşhis ve prognostik biyolojik biridir. Benzer şekilde, bozulmuş PAD4 aktivitesi en son yumurtalık, meme, akciğer, bir de dahil olmak üzere insan kanserlerinin bir dizi gözlenmiştird özofagus kanserleri 19-22. PAD4 ve kanser arasındaki bağlantı, p53 tümör bastırıcı bir protein 22,23 ELK1 onkogen üzerinden veya yoluyla aracılık ettiği gösterilmiştir ve önceki iş PAD4 bir yeni anti-kanser terapötik hedef 17,24,25 olabileceğini öne sürdü. Ilke çalışmanın bir kanıtı olarak, kolorektal kanser hücre çizgisi, HCT116 olarak shRNA ile PAD4 tükenmesi apoptoz ve hücre döngü yakalanmasını 26 uyarılması için yeterli olduğu bulundu. Son yıllarda geliştirilmiş olan geri dönüşü olmayan bir PAD4 inhibitörünün farelerde 27 tümör kütlesinde bir yetmiş oranında azalmaya yol açmıştır. Oldukça önemli ölçüde, PAD4 inhibisyon dönüştürülmemiş hücreleri ayırarak, kanser hücrelerinin seçici ölümüyle sonuçlanan bir hedefe yönelik bir tedavi olarak hareket ortaya çıktı.

PAD4 işlevini kapatmak için küçük moleküllerin kullanımı, kanser hücrelerini hedef veya mevcut kanser, kemoterapi 28 artırmak için yeni ve güçlü bir strateji olduğu ispat edebilir. Ne yazık ki, POÇadır geri dönüşümlü PAD4 inhibitörü henüz keşfedilmeyi etti. Kovalent önleyicileri bir dizi alt-tabakanın arginin 27,29,30 taklit ile sağlıklı ve hastalıklı durumu hücrelerinin her ikisinde de PAD4 rolünü anlamak için pratik araçlar olduğu kanıtlanmıştır kloro / floro dj pirimidin kolu kullanarak geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu molekül, benzer etki ile, aktif pedlerin her inhibe eder. Bu nedenle, PAD4 aktivitesine ilişkin raporlar, basit bir deneme için olan ihtiyaç çok önemlidir. Bugüne kadar, PAD4 deneyler, kolorimetrik bir okuma 31 ile reaksiyondan amonyağın serbest bağlantı tarif edilmiştir, floresan polarizasyon tahlili için 32 flüoresan chloroamidine alt-tabaka analog kullanmaktadır glioksal ve sitrulline 33 arasındaki asit yardımlı reaksiyon üzerine dayanır ve bağlanma aşamasının 34 dequenching bir floresan PAD4 faaliyet. Bunlardan sadece kovalent değiştirici haloacetamidine stratejisi, yüksek verimli Scre ile uyumlu olduğu kanıtlanmıştırsürmesi gelen platformlar 32,35,36. Biz güvenilir PAD4 aktivitesini ölçen basit floresan dayalı tahlil açıklar. Güçlü bir sinyal-gürültü oranı, analiz hızı ve ölçüm sağlamlık gösterir deneyi, gerçekten kuvvetli ve seçici PAD4 inhibitörü keşfetmek için potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. PAD4 Dönüşüm, Expression ve Arıtma

  1. PAD4 Dönüşüm için, kimyasal olarak, yeterli E. içine PAD4 GSTfüzyonunu içeren pGEX plazmid dönüşümü Aşağıdaki prosedür kullanılarak protein ifadesi için E. coli (E. coli türü BL21 (DE3) ') hücreleri. Kimyasal yetkili (kalsiyum klorür) hazırlayın E. Standart protokollere göre coli (E. coli türü BL21 (DE3) ') hücreleri.
    1. Önceden hazırlanan kimyasal yetkili BL21 (DE3) hücreleri buz üzerinde 50 ul çözülme ve 5 ml kültür tüpü içinde PAD4 genini içeren pGEX plazmidin 1 ul ile karıştırılır. Yavaşça her 2 dakikada çalkalayarak 10 dakika süreyle buz üzerinde inkübe karışımı.
    2. Isı 40 sn için 42 ° C su banyosu içinde karışımın yerleştirerek hücreleri şok. Hemen hücrelerinin iyileşmesi için verilen 2 dakika geri buz üzerinde hücreye plazmid karışımı yerleştirin. Karışıma steril LB et suyu 1 ml ilave edilir ve 1 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
    3. 1 250 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de hücreler şok ısı inkübehr. Pipet 75 bir ampisilin dayanıklı agar plakası üzerinde dönüştürülmüş hücrelerin ul ve 15 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 4 ° C'de muhafaza plaka.
  2. PAD4 ifadesi.
    1. 1x ampisilin içeren LB 5 ml ampisilin agar plaka ve yerden BL21 (DE3) hücreleri 1 koloni seçin. Küvöze ve 37 ° C'de O / N sallayın.
    2. 1x amfisilin trihidrat içeren steril LB (MW 403,45 g / Mol) 1 L LB (başlangıç) ve 5 ml aktarın. 37 ° C'de çalkalama inkübatöründe yer büyüme. Büyüme OD 600 izler. Büyüme 600 0.3 bir OD ulaştığında, inkübatör sallayarak 16 ° C içine büyüme taşıyın.
    3. OD 0.6 600, 0.3 mM isopropylthiagalactoside (IPTG, MW 238,30 g / Mol) ile hücrelerin uyarılması ulaştıktan sonra. Hücreler 16 ° C'de 15 saat boyunca çalkalanır izin verin.
    4. 0 ° C'de 20 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. -80 ° C'de süpernatant ve mağaza pelet kapalı dökün.
  3. PAD4 saflaştırma
    1. Yeniden askıya 50 mM NaCI (MA 58.44 g / Mol), bir tampon maddesi içinde hücreleri BL21 (DE3) 'de ifade edilen PAD4 içeren pelet, 300 mM NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / Mol), 10 mM imidazol (MW 68,077 g / mol), 0.1 mM fenilmetilsülfonil flüorür (PMSF, MW 174,94 g / Mol) ve 1 mM ditiyotretol (DTT, 154,25 g / Mol), pH = 8.0.
    2. 4 ° C'de 15 dakika süreyle sese tabi tutularak ile lizleyin hücreleri. Sonikasyonun ardından, 0 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de hücre lizat santrifüj. Dökün ve süpernatant kaydedin. Toplu, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca glutatyon (GSH) agaroz boncuklar ile yüzer.
    3. Gravite ile GST boncuk / sütundan süpernatant boşaltın. Oda sıcaklığında 1 x PBS'de (fosfat tamponlu tuz çözeltisi, pH = 8.0) ve 4 x 25 ml boncuk yıkayın.
    4. Zehir PAD4 2 x 10 mi elüsyon tamponu ile, 50 mM tris (hidroksimetil) aminometan (Tris baz, MW 121.14 g / mol), 10 mM glutatyon (GSH, MW 307,32 g / Mol), pH = 8.0.
    5. 100k MW kesme o kullanarak PAD4 Konsantreff santrifüj tüpleri ve santrifüj 4 ° C'de 20 dakika boyunca 4000 x g'de. -80 ° C'de kısım 1.0 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 200 ul hacim içinde, protein saklayın.

Tamponlar 2. hazırlanması Stok Çözümleri

  1. Sodyum klorür (NaCI, MA 58.44 g / mol) tartıldı ve 2M solüsyon hazırlanır. Berrak kadar çözüm karıştırın.
  2. Tris (hidroksimetil) aminometan (Tris baz, MW 121,14 g / Mol) tartın ve = 8.0, 2 M çözelti, pH hazırlar. Berrak kadar çözüm karıştırın.
  3. Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2 2H 2, O, MW 147,01 g / Mol) tartılır ve 500 mM'lik çözelti hazırlayın. Berrak kadar çözüm karıştırın.
  4. Tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP, MW 250,19 g / Mol) tartılır ve 200 mM'lik çözelti hazırlayın. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın.
  5. Ditiyotretol (DTT, MW 154,25 g / mol) tartıldı ve 1 M solüsyon hazırlanır. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın.
  6. HazırlamakTriton X-100% 0.5 çözeltisi.
  7. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA, MW 292,24 g / Mol) tartılır ve 100 mM'lik çözelti hazırlayın. Berrak kadar çözüm karıştırın.
  8. Hidroklorür (ZRcoum MW 621,69 g / Mol) metilkumarin Z Arg- Arg- -7- amido- 4- tartın ve dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM'lik bir çözelti hazırlayın.

37 ° C'de 3 PAD4 Deneyi

  1. 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 125 uM solüsyon hazırlanır. Bu 125 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  2. 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, 6.25 mM DTT tamponu ve 5 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti olacak B.
  3. 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, ve 6.25 mM DTT (pH = 8.0) 'in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti C olacak
  4. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. Berrak kadar çözüm karıştırın ve -20 ° C'de saklayın° C. Bu çözelti, D olacak
  5. 96 oyuklu bir plaka elde edilir ve bir kontrol için kuyu numarasına (PAD4) ve test kuyuları (+ PAD4) işaret etmektedir.
  6. Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm C 160 ul içine Solüsyon B 160 ul. 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Pipet 40, tüm oyuklara Eriyik A ul ve 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  8. Test kuyularının kontrol kuyuları yarısı ve yarısı dH 2 O Pipet 10 ul. Kontrol bölümlerinin ve test kontrolleri, bir pipet, 37 ° C'de 10 dakika boyunca Çözelti D inkübe 10 ul diğer yarısına.
  9. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

Oda sıcaklığında 4 PAD4 Deneyi

  1. 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 50 uM solüsyon hazırlanır. Bu 50 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  2. 100 mM Na bir tampon hazırlayınCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 ve 8 uM PAD4 (pH = 8.0). Bu çözelti olacak B.
  3. 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 (pH = 8.0) 'in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti C olacak
  4. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti, D olacak
  5. 384 oyuklu plaka elde edilir ve kontrol (hiçbir PAD4) ve test deliklerine (+ PAD4) için kuyu işaret etmektedir.
  6. Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm C 25 ul içine Solüsyon B 25 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika oyuklarda kuluçkalanması PAD4 olmadan / tampon izin verir.
  7. Tüm kuyulara C çözeltisi pipetle 25 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir.
  8. Test kuyularının kontrol kuyuları yarısı ve yarısı dH 2 O Pipet 10 ul. Kontrol bölümlerinin ve test kontrollerin diğer yarısı, pipett için10 dakika boyunca oda sıcaklığında Çözelti D inkübe e 10 ul.
  9. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

37 ° C'de ve oda sıcaklığında 5. PAD4 saat Sahası Tahliller

  1. 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 125 uM solüsyon hazırlanır. Bu 125 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  2. 62.5 mM NaCI, 62.5 mM Tris, 12.5 mM CaCI2, 6.25 mM DTT tamponu ve 5 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti olacak B.
  3. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti C olacak
  4. (Kaç zaman noktalarında bağlıdır kuyuların #) 2 96-iyi plakaları ve pipet kuyuların # miktarda içine Solüsyon B 160 ul edinin.
  5. 37 ° C'de bir 96 oyuklu plaka inkübe edin. Oda sıcaklığında, diğer 96 plaka inkübe edin.
  6. Ölmekette hemen 40 hem 96 oyuklu plakalar içinde, tüm oyuklara Eriyik A ul ve t = 0 dakika kuyulara çözelti C, 10 ul pipetle. Tüm kuyuları söndürüldü edilinceye kadar belirli zaman noktalarında Çözüm C 10 ul ekleyerek devam edin.
  7. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

RT'de 6 PAD4 Engelleme Deneyi:

  1. 10 mM ZRcoum stoktan, su ZRcoum bir 83 uM solüsyon hazırlanır. Bu 83 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  2. Cı-amidin (MW 424,8 g / Mol) tartıldı ve 100 uM stok solüsyonu hazırlanır. Bu çözelti olacak B.
  3. 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 ve tampon ve 8 uM PAD4 (pH = 8.0) hazırlayın. Bu çözelti C olacak
  4. 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, 2 mM TCEP,% 0.02 Triton X-100 (pH = 8.0) 'in bir tamponu hazırlayın. ThÇözüm D. olacak olan
  5. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti, E. olacak
  6. 384 oyuklu plaka elde edilir ve kontroller için kuyu (Resim PAD4) Test oyuklarını (+ PAD4) ve inhibisyon kuyu (PAD4 + CI-amidin) işaret etmektedir.
  7. Pipet testi kuyular ve pipet kontrol kuyulara Çözüm D 25 ul içine Çözüm C 25 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika oyuklarda kuluçkalanması PAD4 olmadan / tampon izin verir.
  8. Inhibisyon kuyulara Çözelti B'nin pipetle 10 ul ve RTE'nin 20 dakika süreyle inkübe edin.
  9. Tüm kuyulara Çözelti A'nın Pipet 15 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir.
  10. Pipet tüm kuyulara Çözüm E 10 ul. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  11. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda bir çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

7. ham hücre lizatının DeneyiRT'de

  1. 50 mM Tris, 50 mM NaCI, 0.1 mM fenilmetilsülfonil flüorür (PMSF, MW 174,94 g / Mol) ve 1 mM ditiyotretol (DTT, 154,25 g / Mol), pH, 10 ml PAD4 1 L gelişme gelen süspansiyon hücreleri hücrelerin hasat edilmesinden sonra, = 8.0.
  2. 4 ° C'de 15 dakika süreyle sese tabi tutularak ile lizleyin hücreleri. 0 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de hücre lizatı santrifüjleyin. 100k MA kesme santrifüj tüpleri kullanılarak 4 ° C'de 4,000 rpm'de santrifüjleme ile yarım hacme berrak bir aktif madde konsantre edilir.
  3. 10 mM ZRcoum stoklar kaynaktan su içinde ZRcoum bir 250 uM solüsyon hazırlanır. Bu 250 uM ZRcoum çözeltisi Çözelti A olacak
  4. 100 mM NaCI, 100 mM Tris, 20 mM CaCI2, ve 2 mM TCEP (pH = 8.0) 'in bir tamponu hazırlayın. Bu çözelti olacak B.
  5. (Büyükbaş hayvan pankreasından) tripsin, kristalin tartılır ve 100 mM EDTA içinde 10 mg / ml hazırlar. -20 ° C'de berrak ve mağaza kadar çözüm karıştırın. Bu çözelti C olacak
  6. Siyah, 384 oyuklu plaka ve tasarım elde edilirkontroller (hiçbir hücre dağılma) ve test kuyuları (+ hücre dağılma) için kuyu yedik.
  7. Pipet testi kuyulara bütün kuyuları ve hücre lisatından pipet 60 ul içine Çözüm B 100 ul. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Tüm kuyulara Çözelti A'nın Pipet 40 ul ve oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edilir.
  9. Pipet tüm kuyulara Çözüm C 10 ul. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  10. 345 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 465 nm'lik bir emisyon dalga boyunda olan çok modlu okuyucu üzerinde okuma bir floresan elde edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Başlangıçta ZRcoum 96 oyuklu bir plaka biçiminde, PAD4 aktivitesi rapor göstermiştir edilmiştir. Wells, alt-tabaka ZRcoum ve PAD4 varlığında / yokluğunda inkübe edildi. 475/15 nm filtre (Şekil 2A), - 37 ° C 'de 45 dakikalık bir inkübasyon döneminden sonra, floresan, bir 340/40 ile ölçüldü. Beklendiği gibi, floresans seviyesi ZRcoum (veya sitrülin ZRcoum) içindeki florofor olarak düşük kalmıştır kilitli halde kalmıştır. Çözeltiye, fazla tripsin / EDTA ilave edilmesi üzerine, flüoroforlar ZRcoum serbest bırakılan ama PAD4 mevcudiyetinde daha çok değişmeden kalmıştır. EDTA ilavesi nedeniyle birçok kalsiyum iyonlarını şelat haline getirmek için yeteneğine PAD4 reaksiyonun durdurulması yardımcı olmak üzere tasarlanmıştır. Bu verilerden, flüoresans üretimi ise 5.2 katlık bir azalma PAD4 mevcudiyetinde gözlenmiştir. Sonra, compyüksek verimli tarama platformları ile yeni geliştirilen tahlilin atibility gösterilmiştir. Bu tarama amaçları için en uygun olacak dört tepkime değişkenleri analiz etmek için en başta ilgi konusu olan (1) deney hacminin daha minyatürleştirilmesi (2) oda sıcaklığında Protein ve tampon karışımının (3) stabilitesini tahlilin gerçekleştirilmesi olasılığı tahlili ve organik çözücü / deterjan (4) potansiyel bir girişimi tamamlamadan önce.

Orta- ya da yüksek verimli tarama çabaları için, yüksek yoğunluklu iyi plakalar genellikle küçük molekül ekranlar kullanılmaktadır. Bir 96-yuvalı plaka (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında, deney, 384-oyuklu bir plaka içerisinde hemen hemen aynı gerçekleştirilebilir teyid edildi. Bundan başka, yüksek bir ürün formatında edilen deneme için olan çalışma şartları belirlenirken, PAD4 aktivitesi oda sıcaklığında makul bir zaman çerçevesi içinde takip edilebilir olup olmadığını araştırmak için çok önemliydi. Değil tüm sıvı-işleme aletleri beribir sıcaklık kontrol cihazı, bu yüksek sıcaklıkta, bir inkübasyon adımı için külfetli ve yüksek maliyetli olabilir. Ayrıca, sıcaklık dalgalanması için muhasebe plakaları ve çalışan arasında farklılığın bir nedeni olabilir. Burada tarif edilen analiz için daha düşük sıcaklıklarda etkisini belirlemek için, benzer bir deney, oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Bu sinyaller, 37 ° C'de ve oda sıcaklığına (Şekil 3) arasında hemen hemen hiçbir değişiklik olduğu tespit edilmiştir. Bundan başka PAD4 ve alt-tabaka arasındaki istenen inkübasyon zamanı en aza indirmek suretiyle analiz performansını optimize etmek için, reaksiyonun kinetik analiz edilmiştir. PAD4 aktivitesi, oda sıcaklığında ve 37 ° C'de iki kez izlenmiştir. Beklendiği gibi, bu PAD4 20 dakika süre ile çok tam bir reaksiyon ile (insan fizyolojik sıcaklık ile tutarlıdır), 37 ° C'de daha aktif olduğu görülmektedir. Tatminkar bir reaksiyon, kuvvetli, oda sıcaklığına kadar sıcaklık azalması ile etkilenmez. Reaksiyon itibariyle yaklaşık yarısı hızını devamsıcaklığı yükselmiş ve esasen tam 40-45 dakika sonrası başlamasıdır. Tabii analizleri zaman, kinetik sabitleri hesaplandı ve parametreleri (K M = 397 iM, k cat = 2.98 sn -1, k cat / k M = 7.400 sn -1 M -1) diğer PAD4 benzer olarak bulundu alt-tabakalar., özelliği, reaksiyonun kinetiği ile 31, daha sonraki tüm deneyler, ölçüm noktasına başından 1 saat indirgendi.

Uzun bir süre boyunca reaksiyon tamponu içinde çözüldü sonraki zaman, PAD4 stabilitesi değerlendirildi. Pratikte, yüksek verimli tarama gösterge ekranı tamamlanması sırasında pek çok saat boyunca, genellikle stabil olduğu reaktifleri gerektirecektir. Bazı reajanlar dakika göreli bir raf ömrüne sahip, oldukça pahalı ve zaman taze reaktif hazırlamak için ekran sona erdirmek için alıcı olabilir. Deney koşullarına bağlı olarak, bu değil,Bazı testlerde alışılmadık bu nedenle çok yüksek through-put tarama ile uyumsuz olması. Bu düşünceyle ile, tampon maddesi içinde PAD4 stabilitesi, birkaç saat boyunca izlendi. Hemen hemen bir enzimatik aktivite kaybı böylece protein hatta 15 üzerinde saat (Şekil 4A), oda sıcaklığında oturduktan sonra stabil olduğunu gösteren bir süre boyunca gözlendi. Daha sonra, minyatür koşullar altında ve oda sıcaklığında çalışan deney hala uygun bir PAD4 varlığına yanıt olup olmadığı incelendi. Bilinen PAD4 inhibitörü chloroamidine (Cı-amidin) olarak İnkübasyondan sonra, PAD4 (Şekil 4B) tam baskılanması ile uyumlu bir floresan sinyalinin bir tam restorasyonu yol açtı. Son olarak, aynı zamanda genel olarak, nihai hacim olarak% 3'e kadar, küçük moleküller stok solüsyonları olarak kullanılan organik çözücü, DMSO'nun varlığının, testi ile karışmamıştır teyit edildi (veriler gösterilmemiştir). Benzer şekilde,% 0.01 Triton X-100 eklenmesi sim sonuçlandıIlar floresan eğilimleri (veriler gösterilmemiştir).

Deney tipik olarak, küçük moleküllü ilaç keşiflerine karşılaşılan çeşitli şartlar altında toleranslı olduğu gösterildikten sonra, 80 bileşiklerinin bir ön tarama yapılması ve 0.71 sağlam bir Z değeri tespit edilmiştir. Deneyin potansiyelini ileriye olarak, PAD4 / ZRcoum reaksiyonunun seçiciliğinin, ham bütün hücre lizatları içinde reaksiyonu gerçekleştirerek vurgulanmıştır. E. GST-PAD4 ekspresyon vektörü ihtiva eden E. coli hücreleri, GST-PAD4 izolasyonu için kullanılan prosedüre benzer bir IPTG ile indüklenmiştir. Sonikasyon yoluyla hücre zarına parçalanmasını takiben, hücresel artığın bir berraklaştınlmış hücre lizatı elde etmek için santrifüj ile ayrılmıştır. PAD4-ihtiva eden hücre lizatı, saflaştırılmış GST-PAD4 tahlilinde, çözelti içinde aktif PAD4 varlığında (ile uyum içinde değiştirilebilir flüoresan sinyali ile aynı deney koşullarına tabi zaman > Şekil 5). Hücre lisatları potansiyel PAD4 aktivitesine ZRcoum flüoresan özellikleri ve tripsin adım müdahale edebilecek yüksek konsantrasyonlarda biomacromolecules bir dizi içerir. Tahlil ham hücre lizatları içinde işlevsel bulgu PAD4 ve ZRcoum arasındaki reaksiyonda yüksek bir seçicilik vardır olduğunu gösterir. Daha ham hücre lizatları mevcudiyetinde sinyal azalması aktif PAD4, Cı-amidin, kurulu bir kovalent PAD4 inhibitörünün etkisinin varlığı spesifik olduğunu göstermek için değerlendirilmiştir. Cı-amidin eklenmesi flüoresan sinyalinde bir restorasyon, PAD4 inaktivasyon ile uyumlu olarak (Şekil 5) yol açtı. Birlikte, bu deneyi daha PAD4 aktivitesinin izlenmesi için ham hücre lizatları kullanılarak basitleştirilebilir gösterilmiştir.

2114 / 52114fig1highres.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 1. PAD4 ve flüoresan bazlı tahlilin bir tasarım. (A), nükleozom temel birimini oluşturan histon düzeneklerinin Çizgi temsili. PAD4 histon proteinleri üzerine arginin kalıntısının bir dizi sitrülinlenmesine katalize eder. (B) ZRcoum PAD4 ve (netlik için gizli) yerli substrat (katılım kodu 2DW5) ile kaplanmış. Tipik PAD4 deneyinde adımları (C) gösterimi. Substrat ZRcoum bir PAD4 tarafından sitrülinlenmesine böylece floresan düzeylerinde değişikliğe neden, tripsin-aracılı amid hidroliz olan duyarlılığı azaltır. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2, 96 gözlü, 384 gözlü plaka formatlarında Şekil 2. PAD4 deneyi. Flüoresan ölçüldü (eksitasyon 345 nm / emisyon 465 nm) belirlenen koşullara hem 96-kuyulu bir formatın, (A) ve 384 gözlü format (B) (37 ° C). Proteaz tripsin ilave PAD4 olmadan yuvalar içinde floresan düzeylerinde büyük bir artışa yol açar ve PAD4 ile kuyu için hemen hemen değişmeden kalır. Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir (n = 3). rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
PAD4 deneyi. Floresan Şekil 3. zaman süreci analizi ölçüldü (eksitasyon 345 nm / emisyon 465 nm) periyodik olarak protein ile 70 dakika boyunca 96 gözlü plaka formatında ya da 37 ° C'de inkübe edildikten° C (A) ya da oda sıcaklığında (B) gerçekleştirildi. Veriler ortalama +/- SD temsil edilmektedir (n = 3). rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. protein stabilitesi ve inhibisyon (A). PAD4 aktivitesi belirlenen zaman aralıklarından sonra ölçülmüştür. Karşılaştırma için, floresan seviyeleri PAD4 yokluğunda gösterilmiştir. Floresan seviyeleri, önce (kırmızı) ve sonrasında (yeşil) tripsin eklenmesini gösterilmiştir. Bilinen PAD4 önleyicisi Cı-amidin (100 uM) ve (B) giriş, oda sıcaklığında, 384-kuyucuklu bir plaka biçiminde, floresan sinyalinin restorasyonu yol açtı. Floresan seviyeleri, önce (kırmızı) ve sonrasında (yeşil) tripsin eklenmesini gösterilmiştir. Tüm veriler huk vardırolarak ortalama +/- SD nted (n = 3). rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5. Ham hücre lizatı deneyi. Deney, oda sıcaklığında, 384-kuyucuklu bir plaka biçiminde olmaması ve ham hücre lizatlan varlığında yapıldı. Floresan seviyeleri, önce (kırmızı) ve sonrasında (yeşil) tripsin eklenmesini gösterilmiştir. Cı-amidin (100 uM), aynı zamanda, bu koşullar altında flüoresan sinyalinde bir artışa yol açmıştır. Tüm veriler ortalama +/- SD temsil (n = 3). Edilir rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J. 3rd, Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. Biochemistry. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. Biochemistry. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. Biochemistry. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. Biochemistry. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

Kimya Sayı 93 PAD4 PADI4 sitrülinlenmesine arginin post-translasyonel değişikliği HTS deney flüoresan sitrulin
Pro-floresan alt madde analog ile PAD4 Faaliyet flüoresan'a bağlı İzleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter