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JoVE Journal Chemistry
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Chemistry

Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Un gran numero di proteine ​​di mammifero sono fortemente modificato dall'azione di enzimi seguito della biosintesi delle proteine ​​del ribosoma. Queste modificazioni post-traduzionali (PTM) possono aumentare notevolmente la diversità funzionale del proteoma modificando le dimensioni, la carica, la struttura, e lo stato di oligomerizzazione (tra le altre caratteristiche) di proteine ​​1-3. Di conseguenza, il cambiamento della struttura di proteine ​​può portare a conseguenze fisiologiche, quali la degradazione delle proteine, differenziazione cellulare, segnalazione, la modulazione dell'espressione genica, e le interazioni proteina-proteina. Mentre queste modificazioni sono prevalenti in una grande percentuale di tutte le proteine ​​umane, il terminale termina il istoni subiscono un numero insolitamente elevato di modificazioni covalenti 4. Istoni sono una famiglia di proteine ​​strutturali che facilitano la condensazione del DNA genomico. Covalenti modificazioni delle code istoniche non strutturati sono effettuate e regolate da una series di enzimi in grado di catalizzare la modifica covalente di residui (scrittori), invertire le stesse modifiche (gomme), e distinguere tra i cambiamenti che sono impresse sulle code degli istoni (lettori) 5-7. In realtà, la maggior parte dei PTM conosciute si possono osservare in questo breve segmento del istoni compresi metilazione, fosforilazione, acetilazione, sumoilazione, ubiquitinazione e citrullination 8.

Citrullination comporta la conversione del peptidil-arginina al t RNA non codificato peptidil-citrullina (Figura 1A). Le proteine, responsabili di questa catena di neutralizzazione lato, sono membri del PAD (p eptide un rginine eiminase d) famiglia di proteine, che sono tutti enzimi calcio-dipendenti. 9,10. Fino ad oggi, cinque membri della famiglia PAD sono state descritte (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, e PAD6). Ogni membro di questa famiglia sembra indirizzare proteine ​​cellulari distinti e anche visualizza unique profili distribuzione tissutale. PAD4 è l'unico membro di questa famiglia di proteine ​​note per essere localizzato all'interno del nucleo tramite una sequenza di localizzazione nucleare 11. Pertanto, è stato dimostrato per deiminate un numero di bersagli nucleari, comprese le catene laterali di arginina sulle code N-terminali degli istoni H2A residuo di arginina (3 H2R3), H3 (H3R2, H3R17 e H3R26) e H4 (H4R3) 12, 13. Mentre ciascuna delle isoenzimi PAD hanno funzioni fisiologiche specifiche e critiche, PAD4 ha ricevuto molta più attenzione a causa del suo ruolo in una serie di processi umani in cellule di entrambi i malati e sani. Recentemente, PAD4 ha dimostrato di essere un membro della pluripotenza trascrizionale di rete 14. Entrambi i livelli di espressione PAD4 e l'attività hanno dimostrato di essere elevata durante la riprogrammazione e la terra statali stati pluripotenti nei topi. Controllando la regolazione dei geni di cellule staminali, PAD4 può mantenere un ruolo centrale nella riprogrammazione cellulare efficienza. PAD4 è stato anche coinvolto nelformazione di trappole extracellulari dei neutrofili, che dopo il legame di agenti patogeni consentire loro liquidazione sistema. La hypercitrullination di proteine ​​istoniche da PAD4 induce decondensazione della cromatina, che serve come materiale di base per l'incapsulamento di batteri patogeni da parte della trappola extracellulare, in modo da scongiurare infezioni batteriche 15,16.

Inoltre, PAD4 è stata trovata a svolgere un ruolo attivo in una serie di malattie umane. È stato precedentemente dimostrato che l'espressione aberrante di PAD4 è associato con l'insorgenza e la gravità di artrite reumatoide, morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, sclerosi multipla e 17. Infatti, la presenza di anticorpi anti-proteina citrullinati è uno dei biomarcatori diagnostici e prognostici più affidabili e definitive di artrite reumatoide 18. Analogamente, l'attività PAD4 disregolazione stato recentemente osservato in un certo numero di tumori umani inclusi dell'ovaio, della mammella, del polmone, und tumori esofagei 19-22. Il legame tra PAD4 e il cancro ha dimostrato di essere mediata attraverso l'oncogene ELK1 o tramite il tumore soppressore p53 proteina 22,23 e lavoro precedente ha suggerito che PAD4 potrebbe essere un anti-cancro nuovo bersaglio terapeutico 17,24,25. Come una prova di principio studio, l'esaurimento delle PAD4 via shRNA nella linea cellulare del cancro del colon-retto HCT116 si è rivelato essere sufficiente per indurre l'apoptosi e arresto del ciclo cellulare 26. Un inibitore irreversibile PAD4 recentemente sviluppato ha portato ad una riduzione del settanta per cento della massa tumorale nei topi 27. Piuttosto notevole, l'inibizione PAD4 sembrava operare come una terapia mirata che ha provocato l'uccisione selettiva delle cellule cancerose risparmiando cellule non trasformate.

L'uso di piccole molecole per disattivare la funzione di PAD4 può rivelarsi una potente strategia nuova per colpire le cellule tumorali o di aumentare chemioterapici cancro esistenti 28. Purtroppo, un potenda inibitore reversibile PAD4 deve ancora essere scoperto. Un certo numero di inibitori covalenti sono stati sviluppati utilizzando il / maniglia imidine fluoro cloro che imita il substrato arginina 27,29,30 e hanno dimostrato di essere strumenti pratici per comprendere il ruolo di PAD4 in entrambe le cellule statali sani e malati. Tuttavia, queste molecole inibiscono tutte le pastiglie attivi con potenza simile. Pertanto, la necessità di un saggio superficiale che segnala l'attività di PAD4 è cruciale. Fino ad oggi, PAD4 saggi sono stati descritti che collegano il rilascio di ammoniaca dalla reazione a una lettura colorimetrica 31, utilizzare un analogo substrato chloroamidine fluorescente per fluorescenza polarizzata test 32, si basano sulla reazione acida assistita tra gliossale e citrullina 33, e coppia l'attività PAD4 ad una fluorescenza dequenching passo 34. Di questi, solo il modificatore strategia haloacetamidine covalente ha dimostrato di essere compatibile con scre elevato throughputpiattaforme zare 32,35,36. Descriviamo un test basato sulla fluorescenza facile che misura in modo affidabile l'attività di PAD4. Il test, che mostra un forte rapporto segnale-rumore, velocità di analisi, e la robustezza della misura, ha il potenziale per scoprire un inibitore PAD4 veramente potente e selettivo.

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Protocol

1. PAD4 Trasformazione, Espressione e purificazione

  1. Per PAD4 trasformazione, trasformare il plasmide contenente pGEX PAD4 GST fusione in chimicamente competente E. Coli (BL21 (DE3)), le cellule per l'espressione di proteine ​​utilizzando la seguente procedura. Preparare chimicamente competente (cloruro di calcio) E. Coli (BL21 (DE3)), le cellule secondo protocolli standard.
    1. Scongelare 50 ml di preparato in precedenza BL21 chimicamente competente (DE3) celle su ghiaccio e mescolare con 1 ml di plasmide pGEX contenente gene PAD4 in una provetta da 5 ml. Incubare la miscela in ghiaccio per 10 min, agitando delicatamente ogni 2 min.
    2. Heat Shock cellule collocando la miscela in un bagno d'acqua a 42 ° per 40 sec. Porre immediatamente la miscela di cellule-plasmide indietro su ghiaccio per 2 minuti per permettere alle cellule di recuperare. Aggiungere 1 ml di brodo LB sterile al composto e mettere in ghiaccio per 1 min.
    3. Incubare il calore cellule scioccato a 37 ° C, agitazione a 250 rpm per 1hr. Pipettare 75 ml di cellule trasformate su una piastra di agar ampicillina resistenti e incubare a 37 ° C per 15 h. Piastra Conservare a 4 ° C.
  2. PAD4 Expression.
    1. Raccogliere 1 colonia di (DE3) cellule BL21 dalla piastra di agar ampicillina e posto in 5 ml di LB contenente ampicillina 1x. Posto in incubatrice e agitare O / N a 37 ° C.
    2. Trasferire i 5 ml di LB (avviamento) in 1 L di sterile LB contenente ampicillina triidrato 1x (MW 403,45 g / mol). Posizionare la crescita in un incubatore agitazione 37 ° C. Monitorare l'OD 600 della crescita. Quando la crescita raggiunge un diametro esterno 600 di 0,3, muovere la crescita in 16 ° C agitazione incubatore.
    3. Dopo aver raggiunto un OD 600 di 0,6, induce le cellule con isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238,30 g / mol). Consentono alle cellule siano scossi per 15 ore a 16 ° C.
    4. Celle di raccolta per centrifugazione a 4000 xg per 20 minuti a 0 ° C. Eliminare il surnatante e conservare pellet a -80 ° C.
  3. PAD4 Purificazione
    1. Risospendere il pellet contenente il PAD4 espresso in BL21 (DE3) cellule in tampone 50 mM NaCl (MW 58.44 g / mol), 300 mM NaH 2 PO 4 (PM 119.98 g / mol), imidazolo 10 mM (MW 68,077 g / mol), 0,1 mM fluoruro phenylmethylsulfonyl (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM ditiotreitolo (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8,0.
    2. Lisare le cellule tramite sonicazione per 15 min a 4 ° C. Dopo sonicazione, centrifugare il lisato cellulare a 20.000 xg per 20 min a 0 ° C. Eliminare il surnatante e riporlo. Batch il surnatante con il glutatione (GSH) agarosio per 30 minuti a RT.
    3. Scolare il surnatante dal GST perline / colonna per gravità. Lavare perline con 4 x 25 ml di 1x PBS (tampone fosfato, pH = 8.0) a temperatura ambiente.
    4. Eluire PAD4 con 2 x 10 ml di tampone di eluizione, Tris 50 mM (idrossimetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM glutatione (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Concentrato PAD4 con 100k MW cut-oprovette da centrifuga ff e centrifugare a 4000 xg per 20 minuti a 4 ° C. Aliquota di proteine ​​in 200 volumi in microlitri 1,0 ml provette da microcentrifuga e conservare a -80 ° C.

2. Preparare soluzioni madre di buffer

  1. Pesare il cloruro di sodio (NaCl, MW 58.44 g / mol) e preparare una soluzione 2 M. Mescolare fino a quando la soluzione chiara.
  2. Pesare Tris (idrossimetil) aminometano (Tris Base, MW 121,14 g / mol) e preparare una soluzione 2 M, pH = 8,0. Mescolare fino a quando la soluzione chiara.
  3. Pesare diidrato cloruro di calcio (CaCl 2 2H 2 O, MW 147.01 g / mol) e preparare una soluzione 500 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara.
  4. Pesare Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP, MW 250,19 g / mol) e preparare una soluzione 200 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C.
  5. Pesare ditiotreitolo (DTT, MW 154,25 g / mol) e preparare una soluzione 1 M. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C.
  6. Preparareuna soluzione allo 0,5% di Triton X-100.
  7. Pesare etilendiamminotetraacetico (EDTA, MW 292,24 g / mol) e preparare una soluzione 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara.
  8. Pesare Z- Arg- Arg- 7- amido- 4- metilcumarina cloridrato (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) e preparare una soluzione 10 mM in dimetilsolfossido (DMSO).

3. PAD4 test a 37 ° C

  1. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 125 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 125 mM ZRcoum sarà Soluzione A.
  2. Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT, e 5 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B.
  3. Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2 e 6,25 mM DTT (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C.
  4. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20° C. Questo sarà soluzione D.
  5. Ottenere una piastra a 96 pozzetti e designare un numero di pozzi per i controlli (non PAD4) e pozzi di prova (+ PAD4).
  6. Pipettare 160 ml di soluzione B in pozzi di prova e pipetta 160 ml di soluzione di C nei pozzetti di controllo. Incubare per 15 minuti a 37 ° C.
  7. Pipettare 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare a 37 ° C per 45 min.
  8. Pipettare 10 ml di dH 2 O a metà dei pozzetti di controllo e la metà dei pozzi di prova. Per l'altra metà dei pozzetti di controllo e comandi di test, pipetta 10 ml di soluzione di D. Incubare per 10 min a 37 ° C.
  9. Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

4. PAD4 test a temperatura ambiente

  1. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione di 50 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione ZRcoum 50 micron sarà Soluzione A.
  2. Preparare un buffer di Na 100 mMCl, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM, 0,02% Triton X-100, e 8 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B.
  3. Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM e 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C.
  4. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione D.
  5. Ottenere una piastra da 384 pozzetti e designare pozzetti per i controlli (non PAD4) e pozzi di prova (+ PAD4).
  6. Pipettare 25 ml di soluzione B in pozzi di prova e pipetta 25 ml di soluzione di C nei pozzetti di controllo. Consentire buffer con / senza PAD4 ad incubare in pozzetti per 20 minuti a RT.
  7. Pipettare 25 ml di soluzione C in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente.
  8. Pipettare 10 ml di dH 2 O a metà dei pozzetti di controllo e la metà dei pozzi di prova. Per l'altra metà dei pozzetti di controllo e comandi di test, pipette 10 ml della soluzione D. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
  9. Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

5. PAD4 Andamento temporale saggi a 37 ° C e RT

  1. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 125 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 125 mM ZRcoum sarà Soluzione A.
  2. Preparare un buffer di 62,5 mM NaCl, 62,5 mM Tris, 12,5 mM CaCl 2, 6,25 mM DTT, e 5 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B.
  3. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione C.
  4. Ottenere 2 piastre a 96 pozzetti e pipetta 160 ml di soluzione di B in # quantità di pozzi (# di pozzi dipenderà da quanti punti di tempo).
  5. Incubare una piastra a 96 pozzetti a 37 ° C. Incubare l'altra piastra da 96 pozzetti a temperatura ambiente.
  6. Semeette 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti in entrambe le piastre a 96 pozzetti e subito Pipettare 10 ml di Soluzione C nelle t = 0 min pozzi. Continuare ad aggiungere 10 ml di soluzione C in punti temporali specifici prima di aver spento tutti i pozzetti.
  7. Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

6. PAD4 Inibizione test a temperatura ambiente

  1. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 83 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione ZRcoum 83 mM sarà Soluzione A.
  2. Pesare Cl-amidina (MW 424,8 g / mol) e preparare una soluzione madre a 100 micron. Questo sarà soluzione B.
  3. Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM, 0,02% Triton X-100, e 8 mM PAD4 (pH = 8,0). Questo sarà soluzione C.
  4. Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, 2 TCEP mM e 0,02% Triton X-100 (pH = 8,0). Thè sarà Soluzione D.
  5. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà Soluzione E.
  6. Ottenere una piastra da 384 pozzetti e designare pozzi per i controlli (non PAD4), pozzi di prova (+ PAD4), e pozzi di inibizione (PAD4 + Cl-ammidinici).
  7. Pipettare 25 ml di soluzione C in pozzi di prova e pipetta 25 ml di soluzione di D nei pozzetti di controllo. Consentire buffer con / senza PAD4 ad incubare in pozzetti per 20 minuti a RT.
  8. Pipettare 10 ml di soluzione B nei pozzetti di inibizione e incubare per 20 minuti a Rte.
  9. Pipettare 15 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente.
  10. Pipettare 10 ml di soluzione E a tutti i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
  11. Ottenere una fluorescenza lettura su un lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

7. greggio lisato Assaya RT

  1. Dopo la raccolta delle cellule dal PAD4 1 L di crescita, risospendere le cellule in 10 ml di 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF, MW 174,94 g / mol) e 1 mM ditiotreitolo (DTT, 154.25 g / mol), pH = 8.0.
  2. Lisare le cellule tramite sonicazione per 15 min a 4 ° C. Centrifugare il lisato cellulare a 20.000 xg per 20 min a 0 ° C. Concentrare il surnatante limpido per la metà del volume mediante centrifugazione a 4000 rpm a 4 ° C con 100k MW provette di cut-off.
  3. Da 10 ZRcoum mM magazzino, preparare una soluzione 250 mM di ZRcoum in acqua. Questa soluzione 250 mM ZRcoum sarà Soluzione A.
  4. Preparare un buffer di NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM CaCl 2, e 2 TCEP mM (pH = 8,0). Questo sarà soluzione B.
  5. Pesare tripsina, cristallino (da pancreas bovino) e preparare 10 mg / ml in EDTA 100 mM. Mescolare fino a quando la soluzione chiara e conservare a -20 ° C. Questo sarà soluzione C.
  6. Ottenere una piastra da 384 pozzetti nero e designmangiato pozzetti per i controlli (senza lisato cellulare) e le fonti di prova (+ lisato cellulare).
  7. Pipettare 100 ml di soluzione B in tutti i pozzetti e le pipette 60 ml di lisato cellulare nei pozzetti di prova. Incubare per 20 minuti a RT.
  8. Pipettare 40 ml di soluzione A in tutti i pozzetti e incubare per 45 minuti a temperatura ambiente.
  9. Pipettare 10 ml di soluzione C a tutti i pozzetti. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
  10. Ottenere una fluorescenza lettura sul lettore multimodale con lunghezza d'onda di eccitazione di 345 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 465 nm.

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Representative Results

Inizialmente, è stato dimostrato che ZRcoum può riferire sull'attività di PAD4 in un formato di piastra da 96 pozzetti. Wells sono stati incubati con il substrato ZRcoum e in presenza / assenza di PAD4. Dopo un periodo di incubazione di 45 min a 37 ° C, la fluorescenza è stata misurata con un 340/40 - 475/15 nm filtro (Figura 2A). Come previsto, i livelli di fluorescenza sono rimasti bassi come fluoroforo entro ZRcoum (o il citrullinato ZRcoum) sono rimasti in stato di blocco. Dopo aggiunta di eccesso di tripsina / EDTA alla soluzione, i fluorofori sono stati liberati da ZRcoum ma sono rimasti sostanzialmente invariati in presenza di PAD4. L'aggiunta di EDTA destinato a contribuire alla cessazione della reazione PAD4 grazie alla sua capacità di chelare gli ioni essenziali calcio. Da questi dati, una diminuzione 5,2 volte della produzione di fluorescenza è stata osservata in presenza di PAD4. Successivamente, il compatibilità del saggio di nuova concezione con le piattaforme di screening high-throughput è stata dimostrata. Era di interesse primario per analizzare quattro variabili di reazione che sarebbero più favorevole ai fini di screening (1) l'ulteriore miniaturizzazione del volume di dosaggio (2) la possibilità di eseguire il test a temperatura ambiente (3) la stabilità della miscela proteica e tampone prima di completare il test e (4) la possibile interferenza di solventi organici / detergenti.

Per medio o high-throughput sforzi di screening, piastre e ad alta densità sono comunemente utilizzati in piccoli schermi molecola. Si è verificato che l'analisi può essere eseguita in modo quasi identico in una piastra a 384 pozzetti, rispetto ad una piastra a 96 pozzetti (Figura 2B). Nel determinare ulteriormente le condizioni di lavoro per l'analisi in un formato ad alta velocità, è importante indagare se l'attività PAD4 può essere monitorato in un lasso di tempo ragionevole a temperatura ambiente. Dal momento che non tutti gli strumenti di gestione dei liquidi hannoun regolatore di temperatura, può diventare ingombrante e costosa per avere una fase di incubazione a temperatura elevata. Inoltre, rappresentano variazioni di temperatura può essere un motivo di discrepanza tra le piastre e le piste. Al fine di determinare l'effetto di temperature più basse per il saggio descritto, un test simile è stata eseguita a temperatura ambiente. Si è constatato che i segnali erano praticamente invariato tra 37 ° C e RT (Figura 3). Per ottimizzare ulteriormente le prestazioni del test minimizzando il tempo di incubazione richiesto tra PAD4 e il substrato, la cinetica della reazione è stato analizzato. Attività PAD4 è stata monitorata nel corso del tempo, sia a temperatura ambiente e 37 ° C. Come previsto, sembra che PAD4 è più attivo a 37 ° C (coerente con temperatura fisiologica umana) con la reazione quasi completo da 20 min. Soddisfacente, la reazione non è fortemente influenzata dalla riduzione della temperatura a RT. La reazione procede a circa la metà della velocità altemperatura elevata ed è praticamente completa 40-45 min dopo l'iniziazione. Dal momento analizza Naturalmente, costanti cinetiche sono stati calcolati ei parametri (K M = 397 pM, k cat = 2,98 sec -1, k cat / k M = 7.400 sec -1 M -1) sono risultati essere simile ad altri PAD4 substrati. 31 Con la cinetica della reazione caratterizzata, tutti i dosaggi successivi sono stati ridotti a 1 ora dall'inizio al punto di misura.

Successivamente, la stabilità di PAD4 stata valutata quando disciolto in tampone di reazione per un periodo di tempo prolungato. Realisticamente, screening ad alto rendimento richiederà reagenti ad essere generalmente stabile per molte ore, mentre lo strumento sta completando lo schermo. Se alcuni reagenti hanno una relativa shelf-life di minuti, può essere molto costoso e richiede tempo per terminare la schermata per preparare i reagenti freschi. A seconda delle condizioni di saggio, non èinsolito per alcuni test per essere incompatibile con alto through-put screening per questo motivo. Con questa idea in mente, la stabilità PAD4 in tampone è stato monitorato per diverse ore. Quasi senza perdita di attività enzimatica è stata osservata per tutto il periodo di tempo, indicando così che la proteina è stabile anche dopo la seduta a temperatura ambiente per oltre 15 ore (Figura 4A). Successivamente, si è valutato se il test eseguito in condizioni miniaturizzati e RT sarebbe ancora adeguatamente rispondere alla presenza di un PAD4. Dopo l'incubazione dell'inibitore PAD4 noto, chloroamidine (Cl-amidina), ha portato ad un completo restauro del segnale di fluorescenza coerente con la piena inibizione della PAD4 (Figura 4B). Infine, si è anche verificato che la presenza del solvente organico DMSO, comunemente usato in soluzioni stock di piccole molecole, fino al 3% in volume finale, non interferisce con il saggio (dati non mostrati). Analogamente, l'aggiunta di 0,01% Triton X-100 portato simtendenze fluorescenza ili (dati non mostrati).

Dopo aver dimostrato che il test è tollerante ad una varietà di condizioni che si riscontrano in genere in piccole molecole sforzi di scoperta di nuovi farmaci, uno screening preliminare di 80 composti è stata condotta ed è stato individuato un valore solido Z 'di 0,71. Nel promuovere il potenziale del dosaggio, la selettività della reazione PAD4 / ZRcoum stata evidenziata eseguendo la reazione in lisati cellulari totali greggio. E. coli contenenti il vettore di espressione di GST-PAD4 state indotte con IPTG, simile alla procedura utilizzata per l'isolamento di GST-PAD4. Dopo la rottura della membrana cellulare tramite sonicazione, i detriti cellulari è stato separato per centrifugazione permettere un lisato cellulare chiarificato. Quando il lisato cellulare-PAD4 contenente è stato presentato alle stesse condizioni del saggio come il purificato test GST-PAD4, il segnale di fluorescenza varia in accordo con la presenza di attiva PAD4 in soluzione ( > Figura 5). I lisati cellulari contengono un numero di biomacromolecole ad alte concentrazioni che potrebbero interferire con l'attività PAD4, le proprietà di fluorescenza di ZRcoum, e il passo tripsina. La constatazione che il saggio era funzionale nei lisati cellulari grezzi indica che c'è un'alta selettività nella reazione tra PAD4 e ZRcoum. Per dimostrare ulteriormente che la diminuzione del segnale in presenza di lisati cellulari grezzi era specifico per la presenza di PAD4 attiva, l'effetto di Cl-ammidina, un inibitore covalente PAD4 stabilita, è stata valutata. L'aggiunta di Cl-ammidina portato ad un restauro nel segnale di fluorescenza, coerente con l'inattivazione di PAD4 (figura 5). Insieme, è stato dimostrato il dosaggio può essere ulteriormente semplificata utilizzando lisati cellulari grezzi per il monitoraggio dell'attività PAD4.

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Figura 1. PAD4 e il design del suo saggio basato fluorescenza. (A) rappresentazione del fumetto delle assemblee istoni che compongono l'unità di base di un nucleosoma. PAD4 catalizza la citrullination di un certo numero di residui di arginina sulle proteine ​​istoni. (B) ZRcoum sovrapposto con il substrato nativo (nascosto per chiarezza) di PAD4 (codice adesione 2DW5). (C) La rappresentanza dei passi in un tipico test PAD4. Citrullination dal PAD4 del ZRcoum substrato riduce la propensione a tripsina-mediata ammide idrolisi, provocando così un cambiamento nei livelli di fluorescenza. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

Figura 2 Figura 2. PAD4 dosaggio in 96 pozzetti e 384 pozzetti formati lastra. La fluorescenza è stata misurata (eccitazione 345 nm / emissione 465 nm) sia in un formato a 96 pozzetti (A) e 384 pozzetti (B) con le condizioni designate (37 ° C). L'aggiunta di proteasi tripsina porta ad un forte aumento dei livelli di fluorescenza in pozzi senza PAD4 e rimane praticamente invariato per i pozzi con PAD4. I dati sono rappresentati come media + deviazione standard (n = 3). Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

Figura 3
Figura 3. Tempo di analisi corso di PAD4 test. La fluorescenza è stata misurata (eccitazione 345 nm / emissione 465 nm) periodicamente in un formato a 96 pozzetti piastra su 70 min con la proteina di essere incubati sia a 37° C (A) o RT (B). I dati sono rappresentati come media +/- SD (n = 3). Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

Figura 4
Figura 4. stabilità delle proteine ​​e l'inibizione. (A) L'attività di PAD4 è stata misurata dopo gli intervalli di tempo designato. Per confronto, i livelli di fluorescenza sono mostrati in assenza di PAD4. Livelli di fluorescenza sono mostrati prima (rosso) e dopo (verde) l'aggiunta di tripsina. (B) Introduzione dell'inibitore PAD4 noto Cl-amidina (100 mM) ha portato ad un ripristino del segnale di fluorescenza in un formato 384 pozzetti a temperatura ambiente. Livelli di fluorescenza sono mostrati prima (rosso) e dopo (verde) l'aggiunta di tripsina. Tutti i dati sono RAPPRESEnted come media +/- SD (n = 3). Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.

Figura 5
Figura 5. cellule grezza dosaggio lisato. Il saggio è stato eseguito in assenza e in presenza di lisati cellulari grezzi in un formato 384 pozzetti a temperatura ambiente. Livelli di fluorescenza sono mostrati prima (rosso) e dopo (verde) l'aggiunta di tripsina. Cl-amidina (100 mM) ha provocato un aumento del segnale di fluorescenza in queste condizioni. Tutti i dati sono rappresentati come media +/- SD (n = 3). Cliccate qui per vedere una versione più grande della figura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

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References

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Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza
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Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

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