Introduction
哺乳類のタンパク質の大多数は重くリボソームによるタンパク質の合成以下の酵素の作用によって修飾される。これらの翻訳後修飾（PTMは）大幅にタンパク質1-3（他の機能の中で）、サイズ、電荷、構造、オリゴマー化状態を変化させることにより、プロテオームの機能的多様性を増加させることができる。その結果、タンパク質構造の変化は、タンパク質分解、細胞分化、シグナル伝達、遺伝子発現の調節、およびタンパク質 - タンパク質相互作用のような生理学的結果をもたらすことができる。これらの変更は、すべてのヒトタンパク質の大きな割合で普及している一方で、端末はヒストンタンパク質に終了共有結合修飾4の異常に高い数値を受ける。ヒストンタンパク質は、ゲノムDNAの凝縮を容易にする構造タンパク質のファミリーである。非構造化ヒストン尾部の共有結合修飾は、セリエAによって行われ、規制されている、残基（作家）の共有結合的修飾を触媒する同じ変更（消しゴム）を逆転し、変更を区別できる酵素のsはヒストン尾（読者）5-7上に刻印されている。実際には、既知のPTMのほとんどは、メチル化、リン酸化、アセチル化、SUMO化、ユビキチン化、およびシトルリン8を含むヒストンのこの短いセグメント内に観察することができる。
シトルリンは、ペプチジル-シトルリン（ 図1A）符号化された非トン RNAへのプチアルギニンの変換を含む。この側鎖の中和を担うタンパク質は、カルシウム依存性酵素であるその全てがPAD た（p eptide A rginine dの eiminase）タンパク質ファミリーのメンバーである。9,10。現在までに、PADのファミリーの5メンバーは（PAD1、PAD2、PAD3、PAD4、およびPAD6）に記載されている。このファミリーの各メンバーは、個別の細胞タンパク質を標的とするように表示され、またUNIを表示queの組織分布プロファイル。 PAD4は、核局在化配列11を介して核内に局在することが知られているこのタンパク質ファミリーの唯一のメンバーである。したがって、H3（H3R2、H3R17、およびH3R26）及びH4（H4R3）、ヒストンH2Aのアルギニン残基3（H2R3）のN末端 尾部におけるアルギニンの側鎖を含む核標的の数を、deiminateすることが示されている12、 13。 PADアイソザイムのそれぞれが具体的かつ重要な生理学的機能を有するが、PAD4は、罹患および正常細胞の両方におけるヒトのプロセス数におけるその役割にかなり注目されている。最近では、PAD4は、多能性の転写ネットワーク14のメンバであることが示された。両方PAD4の発現レベルおよび活性は、マウスにおける再プログラミングと基底状態の多能性状態の間に上昇することが示された。幹細胞の遺伝子の調節を制御することにより、PAD4は細胞リプログラミング効率の極めて重要な役割を保持することができる。 PAD4も関与している病原体の結合時に、そのシステムのクリアランスを有効に好中球細胞外トラップの形成。 PAD4によるヒストンタンパク質のhypercitrullinationは、このような細菌感染15,16を退ける、細胞外トラップによる病原性細菌のカプセル化のための基材として機能するクロマチンの脱凝縮を誘導する。
さらに、PAD4は、多くのヒト疾患において積極的な役割を果たすことが見出されている。これは、以前にPAD4の異常な発現は、関節リウマチの発症および重症度と関連していることが示されており、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症17。実際、抗シトルリン化タンパク質抗体の存在が関節リウマチ18の最も信頼性の決定的な診断および予後バイオマーカーの1つである。同様に、調節不全PAD4活性は最近、卵巣、乳房、肺、などの多くのヒト癌において観察されているD食道癌19-22。 PAD4と癌との関連は、p53腫瘍抑制タンパク質22,23 ELK1癌遺伝子を介して、またはを介して媒介されることが示されており、以前の研究は、PAD4は、新規な抗癌治療のターゲット17,24,25かもしれないことを示唆している。原理研究の証明として、結腸直腸癌細胞株HCT116におけるshRNAを介したPAD4の枯渇は、アポトーシスおよび細胞周期停止26を誘導するために十分であることが判明した。最近開発された不可逆的なPAD4阻害剤は、マウス27の腫瘍塊における七十%削減につながった。かなり著しく、PAD4阻害は非形質転換細胞を温存しながら、癌細胞の選択的殺傷をもたらした標的療法として機能するように見えた。
PAD4の機能をオフにする小分子の使用は、癌細胞を標的とするか、または既存の癌化学療法剤28を補強するための強力な新しい戦略になるかもしれない。残念ながら、PO10トン可逆PAD4阻害剤は、まだ発見されなければならない。共有結合性阻害剤の数は、アルギニン基板27,29,30を模倣し、健康および疾患状態の細胞の両方においてPAD4の役割を理解する上で実用的なツールであることが証明されているクロロ/フルオロイミジンハンドルを使用して開発されている。しかし、これらの分子は、同様の効力を有する活性のPADのすべてを阻害する。したがって、PAD4の活動について報告し、容易なアッセイの必要性は非常に重要です。今日まで、PAD4アッセイは、比色読み出し31に対する反応からのアンモニアの放出をリンクすることが記載されており、蛍光偏光アッセイ32用の蛍光標識chloroamidine基質類似体を利用し、グリオキサール及びシトルリン33との間の酸アシスト反応に依存して、及び夫婦ステップ34を脱消光蛍光にPAD4活動。これらのうち、唯一の共有結合の修飾haloacetamidine戦略は、ハイスループットSCREと互換性があることが証明されている締付プラットフォーム32,35,36。私たちは確実にPAD4の活性を測定する簡便な蛍光ベースのアッセイを記述する。強力な信号対雑音比、分析速度、および測定のロバスト性を表示するアッセイは、真の強力かつ選択的なPAD4阻害剤を発見する可能性がある。
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Protocol
1. PAD4変換、発現、および精製
- PAD4の形質転換のために、化学的にコンピテントにPAD4のGST融合を含むのpGEXプラスミドを変換する以下の手順を使用して、タンパク質発現のための大腸菌 （BL21（DE3））細胞。化学的にコンピ（塩化カルシウム）を準備E.大腸菌 （BL21（DE3））細胞を標準的なプロトコルに従って。
- 氷上で予め調製した化学的にコンピテントなBL21（DE3）細胞を、50μlの融解し、5mlの培養チューブにPAD4遺伝子を含有するpGEXプラスミド1μlを混合する。優しく2分ごとに振とうしながら10分間氷上で混合をインキュベートする。
- 熱は、40秒間42℃の水浴中で混合物を配置することによって細胞にショックを与える。すぐに細胞が回復できるように2分間背中氷上で細胞プラスミド混合物を配置します。混合物に滅菌LBブロス1ミリリットルを加え、1分間氷上に置きます。
- 1のために250rpmで振盪、37℃で細胞を熱ショックをインキュベートhrで。アンピシリン耐性寒天プレート上に形質転換された細胞のピペット75μlの、15時間、37℃でインキュベートする。 4℃で保存プレート。
- PAD4式。
- 1xのアンピシリンを含むLB 5mlにアンピシリン寒天プレートと場所からのBL21（DE3）細胞の1コロニーを採取。インキュベーター内の場所、そして37℃でO / Nを振る。
- 1Xアンピシリン三水和物を含む滅菌LB（MW 403.45グラム/モル）1L中にLB（スターター）の5ミリリットルを転送します。 37℃の振盪インキュベーター内の場所の成長。成長のOD 600を監視します。成長は600 0.3のODに達したときに、インキュベーターを振って16℃に成長を移動します。
- OD 600が 0.6 に達したら、0.3mMので細胞を誘導する（IPTG、MW 238.30グラム/モル）isopropylthiagalactoside。細胞は16℃で15時間振とうすることができます。
- 0℃で20分間、4,000×gでの遠心分離により細胞を回収する。 -80℃で上清とストアペレットを捨てる。
- PAD4精製
- 再懸 濁50mMのNaCl（MW 58.44グラム/モル）の緩衝液中で細胞をBL21（DE3）で発現さPAD4を含むペレットを300mMののNaH 2 PO 4（MW 119.98グラム/モル）、10mMのイミダゾール（MW 68.077グラム/モル）、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF、MW 174.94グラム/モル）及び1mMジチオスレイトール（DTT、154.25グラム/モル）でpH = 8.0。
- 4℃で15分間、超音波処理を介した溶解細胞。以下、超音波処理、0℃で20分間遠心2万×gで細胞溶解物。捨て、上清を保存します。バッチをRTで30分間グルタチオン（GSH）アガロースビーズと上清。
- GSTビーズ/重力介してカラムから上澄みを排出します。 RTで1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水、pH値= 8.0）の4×25 mlのビーズを洗ってください。
- 溶出PAD4 10mLで2回溶出緩衝液を用いて、50mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基、MW 121.14グラム/モル）、10mMグルタチオン（GSH、MW 307.32グラム/モル）でpH = 8.0。
- 100kのMWカット-Oを使用してPAD4を集中ffの遠心管遠心分離を4℃で20分間4,000×gで。 -80℃でアリコート1.0 mlのマイクロチューブ中の200μlのボリュームへのタンパク質や店舗。
バッファ2.準備株価ソリューション
- 塩化ナトリウム（NaCl、MW 58.44グラム/モル）を秤量し、2 M溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。
- トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基、MW 121.14グラム/モル）秤量し、2M溶液のpH = 8.0を準備します。透明になるまで溶液を混合。
- 塩化カルシウム二水和物（のCaCl 2·2H 2 O、MW 147.01グラム/モル）を秤量し、500mMの溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。
- トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP、MW 250.19グラム/モル）を秤量し、200mMの溶液を調製する。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。
- ジチオスレイトール（DTT、MW 154.25グラム/モル）秤量し、1M溶液を調製。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。
- 準備するトリトンX-100の0.5％溶液。
- エチレンジアミン四酢酸（EDTA、MW 292.24グラム/モル）を秤量し、100mMの溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。
- Z- Arg- Arg- 7-アミド - 、4-メチルクマリン塩酸塩（ZRcoum、MW 621.69グラム/モル）を秤量し、ジメチルスルホキシド（DMSO）中の10mM溶液を調製する。
37℃で3 PAD4アッセイ
- 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの125μMの溶液を調製。この125μMZRcoum溶液は溶液Aになります
- 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、6.25 mMのDTT、および5μMのPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります
- 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、および6.25 mMのDTT（pH値= 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります
- （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。透明になるまで溶液を混合し、-20℃で保存する℃である。これにより、ソリューションD.なります
- 96ウェルプレートを入手して、コントロールのウェル数（無PAD4）を指定し、試験ウェル（+ PAD4）。
- ピペット160試験ウェルへの溶液Bμlのピペット溶液C160μlの対照ウェルへ。 37℃で15分間インキュベートする。
- ピペット40のすべてのウェルにA液μlの45分間37℃でインキュベートする。
- 試験ウェルの対照ウェルと半分の半分にのdH 2 Oのピペットを10μl。対照ウェルと試験制御、ピペット37℃で10分間インキュベートするソリューションD.10μlの他の半分。
- 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。
RTで4 PAD4アッセイ
- 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoum50μMの溶液を調製。この50μMのZRcoumソリューション、ソリューション、Aになります
- 100 mMのNaをバッファを準備Clを、100mMのトリス、20mMのCaCl 2を 、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100、および8μMPAD4液（pH = 8.0）。これは溶液Bになります
- 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります
- （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これにより、ソリューションD.なります
- 384ウェルプレートを取得せず、コントロールのウエルを指定する（無PAD4）と試験ウェル（+ PAD4）。
- ピペット試験ウェルとピペット対照ウェルへの溶液Cを25μlにB液25μlの。 PAD4なし/付きバッファは室温で20分間ウェル中でインキュベートすることができます。
- すべてのウェルに溶液Cのピペットを25μlとRTで45分間インキュベートする。
- 試験ウェルの対照ウェルと半分の半分にのdH 2 Oのピペットを10μl。対照ウェルと試験のコントロールの他の半分に、pipett室温で10分間ソリューションD.インキュベートの電子10μlの。
- 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。
37℃およびRTで5 PAD4タイムコースアッセイ
- 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの125μMの溶液を調製。この125μMZRcoum溶液は溶液Aになります
- 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、6.25 mMのDTT、および5μMのPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります
- （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これは溶液Cになります
- （どのように多くの時間点に依存することになるのウェル＃）2 96ウェルプレートおよびピペットのウェル＃量にB液160μlのを取得します。
- 37℃で1枚の96ウェルプレートをインキュベートする。 RTで、他の96ウェルプレートをインキュベートする。
- ピップ両方の96ウェルプレート内のすべてのウェルにエットA液40μlのを、すぐにT = 0分ウェルに溶液Cを10μlピペット。すべてのウェルが急冷されるまで、特定の時点で溶液C10μlの追加を続けます。
- 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。
RTで6 PAD4阻害アッセイ
- 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの83μM溶液を調製。この83100μMのZRcoum溶液は溶液Aになります
- のCl - アミジンを秤量（MW 424.8グラム/モル）および100μMストック溶液を準備します。これは溶液Bになります
- 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100、および8μMPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります
- 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100液（pH = 8.0）のバッファを準備します。目ソリューションD.なりますです
- （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これにより、ソリューション、Eになります
- 384ウェルプレートを入手して、コントロールのウェル（なしPAD4）、試験ウェル（+ PAD4）、および阻害ウェル（PAD4 +のCl - アミジン）を指定。
- ピペット25試験ウェルへの溶液Cμlのピペット対照ウェルへの溶液D25μlの。 PAD4なし/付きバッファは室温で20分間ウェル中でインキュベートすることができます。
- ピペット10阻害ウェルに溶液BμlのRTEで20分間インキュベートする。
- すべてのウェルへの溶液Aのピペットを15μlとRTで45分間インキュベートする。
- ピペットすべてのウェルへの溶液Eを10μl。室温で10分間インキュベートする。
- 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。
7.粗細胞溶解物アッセイRTで
- 50mMトリス、50mMのNaCl、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF、MW 174.94グラム/モル）及び1mMジチオスレイトール（DTT、154.25グラム/モル）、pHを、10mlのPAD4 1 Lの成長から再懸濁細胞を細胞を回収した後= 8.0。
- 4℃で15分間、超音波処理を介した溶解細胞。遠心0℃で20分間、20,000×gで細胞溶解物。 100kのMWカットオフ遠心チューブを用いて4℃で4,000rpmでの遠心分離により半分の容量に透明な上清を濃縮する。
- 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの250μMの溶液を調製。この250μMのZRcoum溶液は溶液Aになります
- 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、および2mM TCEP（pH値= 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります
- （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これは溶液Cになります
- 黒色の384ウェルプレートデザインを得るコントロールのウェル（無細胞溶解物）と試験ウェル（+細胞溶解物）を食べた。
- ピペット試験ウェルへのすべてのウェルおよび細胞溶解物の60μlのピペットにB液を100μl。 RTで20分間インキュベートする。
- すべてのウェルへの溶液Aのピペットを40μlとRTで45分間インキュベートする。
- ピペットをすべてのウェルに溶液Cを10μl。室温で10分間インキュベートする。
- 345 nmの励起波長および465nmの発光波長でマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。
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Representative Results
最初に、それはZRcoum 96ウェルプレートフォーマットでPAD4の活性に報告することができることが実証された。ウェルを基板ZRcoumとし、PAD4の存在/非存在下でインキュベートした。 475/15 nmのフィルタ（ 図2A）、 - 37℃で45分間のインキュベーション時間の後、蛍光を340/40で測定した。予想されたように、蛍光レベルはZRcoum（またはシトルリンZRcoum）内の蛍光団として低いままロック状態のままであった。溶液に、過剰のトリプシン/ EDTAを添加すると、フルオロフォアはZRcoumから解放されたが、PAD4の存在下でほとんど変わらなかった。 EDTAの添加により本質的なカルシウムイオンをキレート化する能力にPAD4反応の停止を助けることを意図している。これらのデータから、蛍光出力の5.2倍の減少は、PAD4の存在下で観察された。次に、コンプハイスループットスクリーニングプラットフォームと新しく開発されたアッセイのatibilityが実証された。これは、スクリーニング目的のために最も有利であろう4つの反応変数を分析するために主要な関心であった（1）アッセイ容量の更なる小型化、（2）RTでのタンパク質および緩衝剤の混合物、（3）安定性アッセイを実施する可能性アッセイを完了すると、有機溶媒/界面活性剤（4）潜在的な干渉の前に。
ミッドまたはハイスループットスクリーニングの取り組みのために、高密度のウェルプレートは、一般に、小分子スクリーンにおいて利用される。これは、96ウェルプレート（ 図2B）と比較して、アッセイは、384ウェルプレート中でほぼ同一に行うことができることが確認された。さらに、ハイスループット形式でのアッセイのために働く条件を決定するには、PAD4活性は室温で、合理的な時間枠でモニターすることができるかどうかを調べることが重要であった。わけではないので、全ての液体ハンドリング機器が持っている温度コントローラは、それが高温でのインキュベーションステップを有することが面倒でコスト高になることができる。さらに、温度の変動の会計処理は、プレートと実行間の不一致の原因となることができます。ここに記載されるアッセイのために、より低い温度の効果を決定するために、同様のアッセイを室温で実施した。これは、信号が37℃、RT（ 図3）の間に、実質的に不変であったことが分かった。さらに、PAD4と基板との間に必要なインキュベーション時間を最小にすることによって、アッセイの性能を最適化するために、反応の速度を分析した。 PAD4活性は経時的に両方のRTおよび37℃でモニターした。予想されるように、PAD4 20分間によってほとんど完全な反応を37°C（人間の生理的温度と一致）でより活性であると思われる。 Satisfyingly、反応が強く、RTまで温度の低下による影響を受けません。反応は、とほぼ半分の速度で進行する温度が上昇し、実質的に完全な40〜45分後に開始される。もちろん、分析時から、反応速度定数を算出し、パラメータ（K M = 397μM、 の k cat = 2.98秒-1 の k cat / k個のM = 7400秒-1 M -1）は、他のPAD4と類似であることが見出されたを特徴とする反応の速度と基板31は 、後続のすべてのアッセイは、測定点を先頭から1時間後に減少した。
長期間にわたって反応バッファーに溶解した場合次に、PAD4の安定性を評価した。現実的には、ハイスループットスクリーニングは、機器が画面を完成している間、多くの時間、一般的に安定であることが、試薬を必要とする。特定の試薬が分の相対的な貯蔵寿命を持っている場合、それは非常に高価で時間の新鮮な試薬を調製するために、画面を終了するためにかかる可能性がある。アッセイ条件に依存して、そうではないいくつかのアッセイのための珍しいが、まさにこの理由のための高スループットスクリーニングと互換性がない可能性がある。これを念頭において考えに、バッファ内のPAD4の安定性は数時間にわたりモニタリングした。ほとんどの酵素活性の喪失は、したがって、タンパク質でも15時間以上（ 図4A）を室温で放置した後に安定であることを示し、期間を通して観察されなかった。次に、小型化条件下で、RTで実行アッセイは依然として適切にPAD4の存在に応答するかどうかを評価した。既知PAD4阻害剤、chloroamidine（Clで-アミジン）をインキュベーションすると、PAD4（ 図4B）の完全な阻害と一致した蛍光シグナルの完全な回復をもたらした。最後に、それはまた、一般的に、最終体積として3％まで、小分子のストック溶液に用いられる有機溶媒DMSOの存在は、アッセイを妨害しないことが確認された（データは示さず）。同様に、0.01％トリトンX-100の添加は、シムをもたらしILAR蛍光動向（データは示さず）。
アッセイは、典型的には、小分子薬物発見の試みに遭遇するさまざまな条件に耐性であることが示されたが、80化合物の予備スクリーニングを実施し、0.71の強いZ '値が確認された。アッセイの可能性を促進において、PAD4 / ZRcoum反応の選択性は、粗全細胞溶解物中で反応を行うことにより、強調された。E. GST-PAD4の発現ベクターを含む大腸菌細胞を、GST-PAD4の単離に使用した手順と類似のIPTGで誘導した。超音波処理による細胞膜の破壊に続いて、細胞破片を清澄化した細胞溶解物を得、遠心分離により分離した。 PAD4含有細胞溶解物は精製されたGST-PAD4アッセイと同じアッセイ条件に供したとき、蛍光シグナルは、溶液中の活性PAD4の存在と一致して変化させる（
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図1. PAD4とその蛍光ベースのアッセイの設計。（A）のヌクレオソームの基本単位を構成するヒストンアセンブリの漫画表現。 PAD4は、ヒストンタンパク質上のアルギニン残基の数のシトルリン化を触媒する。 （B）ZRcoumは PAD4の天然基質（わかりやすくするために隠された）（受託コード2DW5）でオーバーレイ。典型的なPAD4アッセイにおけるステップの（C）の表現。基板ZRcoumのPAD4によるシトルリン化は、このように蛍光レベルの変化を引き起こす、トリプシン媒介アミド加水分解に対する感受性を低減します。 図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
96ウェルおよび384ウェルプレートフォーマットでの図2 PAD4アッセイは、蛍光を測定した（励起345 nmの/発光465 nm）を指定された条件の両方を、96ウェル形式（A）および384ウェルフォーマット（B） （37℃）。プロテアーゼトリプシンの付加は、PAD4ないウェルにおける蛍光レベルの大幅な増加につながるとPAD4でウェルのための事実上変わらないままである。データは平均+ SDとして表現された（n = 3）。 図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
PAD4アッセイの図3時間経過解析蛍光は、タンパク質はどちら37でインキュベートされ、70分かけて、96ウェルプレート形式で定期的に（励起345 nmの/発光465 nm）を測定した°C（A）または室温で（B）。データは平均±標準偏差として表される（n = 3）を。されている図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4タンパク質の安定性および阻害（A）PAD4の活性は、指定された時間間隔後に測定した。比較のために、蛍光レベルは、PAD4の非存在下に示されている。蛍光レベルは、前（赤）と、以下の（緑色）のトリプシンを添加することを示している。既知PAD4阻害剤のCl -アミジン（100μM）の（B）の導入は、室温で384ウェルプレートフォーマットにおける蛍光信号の回復につながった。蛍光レベルは、前（赤）と、以下の（緑色）のトリプシンを添加することを示している。すべてのデータはrepreseです平均+/- SDとしてntedた（n = 3）。 図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.粗細胞溶解物アッセイアッセイは、RTで384ウェルプレートフォーマット中の粗細胞溶解物の非存在下および存在下で実施した。蛍光レベルは、前（赤）と、以下の（緑色）のトリプシンを添加することを示している。のCl - アミジン（100μM）は、これらの条件下で蛍光シグナルの増加を引き起こした。すべてのデータは、平均+/- SDとして表さた（n = 3）。されている図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. | |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich | ||
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | www.tecan.com | ||
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | http://www.perkinelmer.com |
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