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Chemistry

Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence

Published: November 5, 2014 doi: 10.3791/52114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Lehigh University

Introduction

Un grand nombre de protéines de mammifères sont fortement modifiées par l'action d'enzymes suivant la biosynthèse des protéines par le ribosome. Ces modifications post-traductionnelles (MPT) peuvent augmenter considérablement la diversité fonctionnelle du protéome en changeant la taille, la charge, la structure et l'état d'oligomérisation (entre autres fonctions) de protéines 1-3. En conséquence, le changement de structure de la protéine peut avoir des conséquences physiologiques, tels que la dégradation des protéines, la différenciation cellulaire, la signalisation, la modulation de l'expression génique, et les interactions protéine-protéine. Bien que ces modifications sont répandues dans un grand pourcentage de toutes les protéines humaines, le terminal se termine sur des protéines histones subissent un nombre anormalement élevé de modifications covalentes 4. protéines histones sont une famille de protéines de structure qui facilitent la condensation de l'ADN génomique. Des modifications covalentes des queues d'histones non structurées sont effectuées et réglées par une séries d'enzymes capables de catalyser la modification covalente de résidus (écrivains), inverser les mêmes modifications (gommes à effacer), et la distinction entre les changements étant imprimé sur les queues d'histones (lecteurs) 5-7. En fait, la plupart des PTM connus peut être observé dans ce court segment de l'histone y compris la méthylation, phosphorylation, acétylation, sumoylation, ubiquitination, et citrullination 8.

Citrullination implique la conversion de peptidyl-arginine de l'ARN t non codé peptidyl-citrulline (figure 1A). Les protéines, responsables de cette neutralisation de la chaîne latérale, sont membres de la PAD (p eptide un d eiminase rginine) famille de protéines, qui sont des enzymes dépendant du calcium. 9,10. À ce jour, cinq membres de la famille de PAD ont été décrits (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4, et PAD6). Chaque membre de cette famille semble cibler des protéines cellulaires distincts et affiche également uniprofils de distribution tissulaire Qué. PAD4 est le seul membre de cette famille de protéines connues pour être localisée dans le noyau par l'intermédiaire d'une séquence de localisation nucléaire 11. En conséquence, il a été démontré que deiminate un certain nombre de cibles nucléaires, y compris les chaînes latérales d'arginine sur les queues N-terminales des histones H2A arginine résidu 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17, et H3R26) et H4 (H4R3) 12, 13. Bien que chacune des isoenzymes de la PAD ont des fonctions physiologiques spécifiques et critiques, PAD4 a reçu beaucoup plus d'attention en raison de son rôle dans un certain nombre de processus humains à la fois les cellules saines et malades. Récemment, PAD4 a été montré pour être un membre du réseau de la transcription de la pluripotence 14. Les deux niveaux d'expression et de l'activité pAD4 ont été montrés à être élevé lors de la reprogrammation et l'Etat-sol Etats pluripotentes chez la souris. En contrôlant la régulation des gènes de cellules souches, PAD4 peut conserver un rôle central dans l'efficacité de la reprogrammation cellulaire. PAD4 a également été impliquée dans laformation de pièges extracellulaires neutrophiles, qui lors de la liaison des agents pathogènes permettre leur dégagement du système. Le hypercitrullination de protéines histones par PAD4 induit la décondensation de la chromatine, qui sert de matériau de base pour l'encapsulation de bactéries pathogènes par le piège extracellulaires, ainsi éloigner les infections bactériennes 15,16.

En outre, PAD4 a été trouvé à jouer un rôle actif dans un certain nombre de maladies humaines. Il a été précédemment montré que l'expression aberrante de PAD4 est associé à l'apparition et la gravité de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques et 17. En fait, la présence d'anticorps anti-protéine est une citrullinés des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques fiables et les plus définitives de la polyarthrite rhumatoïde 18. De même, l'activité dérégulée PAD4 a récemment été observé dans un certain nombre de cancers humains, y compris de l'ovaire, du sein, du poumon, und cancers de l'œsophage 19-22. Le lien entre PAD4 et le cancer a été montré être médiée par l'oncogène ELK1 ou via la p53 protéine suppresseur de tumeur et 22,23 travaux antérieurs ont suggéré que PAD4 pourrait être un anti-cancer cible thérapeutique 17,24,25. En tant que preuve de principe étude, l'épuisement des PAD4 via shRNA dans la lignée de cellules de cancer colorectal HCT116 a été révélée être suffisante pour induire l'apoptose et arrêt du cycle cellulaire 26. Inhibiteur irréversible de PAD4 récemment développé a conduit à une réduction de soixante-dix pour cent de la masse tumorale chez les souris 27. Tout à fait remarquable, PAD4 inhibition semble agir comme une thérapie ciblée qui conduit à une destruction sélective des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules non transformées.

L'utilisation de petites molécules pour désactiver la fonction de PAD4 peut se révéler être une nouvelle stratégie efficace pour cibler les cellules cancéreuses ou d'augmenter les agents chimiothérapeutiques contre le cancer 28 existantes. Malheureusement, un poinhibiteur de PAD4 réversible de la tente n'a pas encore été découvert. Un certain nombre d'inhibiteurs covalents ont été développés en utilisant la chloro / poignée de imidine fluoro qui imite le substrat arginine 27,29,30 et se sont révélés être des outils pratiques pour comprendre le rôle de PAD4 dans les cellules de l'État sains et malades. Cependant, ces molécules inhibent tous les DPA actifs avec une activité similaire. Par conséquent, la nécessité d'un dosage facile que les rapports sur l'activité de PAD4 est crucial. À ce jour, pAD4 essais ont été décrits qui pointent le rejet de l'ammoniac à partir de la réaction à une lecture colorimétrique 31, utiliser un analogue de substrat de chloroamidine marqué par fluorescence pour l'analyse de polarisation de fluorescence 32, compter sur la réaction acide-assistée entre glyoxal et citrulline 33, et coupler l'activité PAD4 à une fluorescence étape 34 dequenching. Parmi ceux-ci, seul le modificateur de stratégie haloacetamidine covalente est avéré être compatible avec scre à haut débitplates-formes Ening 32,35,36. Nous décrivons un test basé sur la fluorescence facile qui mesure de façon fiable l'activité de PAD4. L'essai, qui présente un fort rapport signal-sur-bruit, la vitesse d'analyse, et la robustesse de la mesure, est susceptible de découvrir un inhibiteur de PAD4 vraiment puissant et sélectif.

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Protocol

1. PAD4 transformation, expression et la purification

  1. Pour PAD4 Transformation, transformer le plasmide pGEX contenant PAD4 TPS fusion dans E. chimiquement compétent Coli (BL21 (DE3)), les cellules pour l'expression de protéine en utilisant la procédure suivante. Préparer chimiquement compétente (chlorure de calcium) E. Coli (BL21 (DE3)), les cellules selon les protocoles standards.
    1. 50 ul de dégel préalablement préparée chimiquement compétente BL21 (DE3), les cellules sur de la glace et mélanger avec 1 ul du plasmide pGEX PAD4 contenant le gène dans un tube de culture de 5 ml. Incuber le mélange sur de la glace pendant 10 min en agitant doucement toutes les 2 min.
    2. Choc thermique des cellules en plaçant le mélange dans un bain d'eau à 42 ° pendant 40 secondes. Placer immédiatement le mélange cellulaire plasmide retour sur la glace pendant 2 min pour permettre aux cellules de se rétablir. Ajouter 1 ml de bouillon LB stérile pour le mélange et le placer sur de la glace pendant 1 min.
    3. Incuber la chaleur cellules choqué à 37 ° C, en agitant à 250 rpm pendant 1h. Introduire à la pipette 75 ul de cellules transformées sur une plaque de gélose à l'ampicilline et résistant à incuber à 37 ° C pendant 15 heures. plaque de magasin à 4 ° C.
  2. Expression PAD4.
    1. Choisissez une colonie de BL21 (DE3) de la plaque de gélose à l'ampicilline et le lieu dans 5 ml de LB contenant de l'ampicilline 1x. Lieu dans l'incubateur et secouer O / N à 37 ° C.
    2. Transférer les 5 ml de LB (entrée) dans 1 L de milieu LB stérile contenant 1x trihydrate d'ampicilline (MW 403,45 g / mol). Lieu croissance dans un incubateur à agitation à 37 ° C. Surveiller la DO 600 de la croissance. Lorsque la croissance atteint une DO 600 de 0,3, se déplacer en croissance de 16 ° C en secouant incubateur.
    3. Après avoir atteint une DO 600 de 0,6, induire les cellules avec isopropylthiagalactoside 0,3 mM (IPTG, MW 238,30 g / mol). Permettent aux cellules de secouer pendant 15 heures à 16 ° C.
    4. cellules de récolte par centrifugation à 4000 g pendant 20 min à 0 ° C. Verser le surnageant et magasin culot à -80 ° C.
  3. PAD4 Purification
    1. Remettre en suspension le culot contenant la PAD4 exprimée dans BL21 (DE3), les cellules dans un tampon de 50 mM de NaCl (MW 58,44 g / mol), 300 mM de NaH 2 PO 4 (MW 119,98 g / mol), 10 mM d'imidazole (68,077 MW g / mol), 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, MW 174,94 g / mol) et mM de dithiothréitol (DTT, 154,25 g / mol), pH = 8,0 1.
    2. Lyser les cellules par traitement aux ultrasons pendant 15 min à 4 ° C. Suite à la sonification, centrifuger le lysat cellulaire à 20 000 x g pendant 20 min à 0 ° C. Décanter et conserver le surnageant. Lot le surnageant avec le glutathion (GSH), des billes d'agarose pendant 30 min à température ambiante.
    3. Égoutter surnageant de la TPS perles / colonne par gravité. Laver les billes avec 4 x 25 ml de 1 x PBS (solution saline tamponnée au phosphate, pH = 8,0) à la température ambiante.
    4. Eluer PAD4 avec 2 x 10 ml de tampon d'élution, 50 mM de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris Base, MW 121,14 g / mol), 10 mM de glutathion (GSH, MW 307,32 g / mol), pH = 8,0.
    5. Concentrez PAD4 utilisant 100k MW coupe-otubes à centrifuger ff et centrifuger à 4000 g pendant 20 min à 4 ° C. protéines aliquote dans 200 volumes ul dans 1,0 ml microtubes et conserver à -80 ° C.

2. Préparation des solutions d'achat d'actions pour tampons

  1. Peser le chlorure de sodium (NaCl, MW 58,44 g / mol) et préparer une solution à 2 m. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire.
  2. Peser Tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris base, MW 121.14 g / mol) et préparer une solution 2 M, pH = 8,0. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire.
  3. Peser le chlorure de calcium dihydraté (CaCl 2 2H 2 O, MW 147,01 g / mol) et de préparer une solution 500 mM. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire.
  4. Peser Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE, MW 250.19 g / mol) et préparer une solution de 200 mM. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C.
  5. Peser dithiothréitol (DTT, MW 154.25 g / mol) et préparer une solution à 1 M. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C.
  6. Préparerune solution à 0,5% de Triton X-100.
  7. Peser acide éthylène (EDTA, MW 292,24 g / mol) et préparer une solution à 100 mM. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire.
  8. Peser Z- Arg Arg 7- amido 4- méthylcoumarine chlorhydrate (ZRcoum, MW 621,69 g / mol) et de préparer une solution à 10 mM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).

3. PAD4 test à 37 ° C

  1. De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 125 uM de ZRcoum dans l'eau. Cette solution 125 uM ZRcoum sera la solution A.
  2. Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, et 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B.
  3. Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2 et 6,25 mM de DTT (pH = 8,0). Ce sera la solution C.
  4. Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d'EDTA. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire et stocker à -20° C. Ce sera la solution D.
  5. Obtenir une plaque de 96 puits et de désigner un certain nombre de puits pour les contrôles (pas PAD4) et les puits d'essai (+ de pAD4).
  6. Pipette 160 ul de solution B dans les puits d'essai et pipette 160 ul de la solution C dans les puits de contrôle. Incuber pendant 15 min à 37 ° C.
  7. Introduire à la pipette 40 ul de la solution A dans tous les puits et incuber à 37 ° C pendant 45 min.
  8. Introduire à la pipette 10 ul de dH 2 O à la moitié des puits de contrôle et la moitié des puits d'essai. Pour l'autre moitié des puits de contrôle et des commandes de test, la pipette 10 ul de la solution D. incuber pendant 10 min à 37 ° C.
  9. Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d'onde d'excitation de 345 nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm.

4. PAD4 test à température ambiante

  1. De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution à 50 uM de ZRcoum dans l'eau. Cette solution de ZRcoum 50 uM sera la solution A.
  2. Préparer un tampon de 100 mM NaCl, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, et 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B.
  3. Préparation d'un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, et 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Ce sera la solution C.
  4. Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d'EDTA. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution D.
  5. Obtenir une plaque de 384 puits et désigner puits pour les contrôles (pas pAD4) et les puits d'essai (+ de pAD4).
  6. Pipette 25 ul de solution B dans les puits d'essai et pipette 25 ul de la solution C dans les puits de contrôle. Autoriser tampon avec / sans PAD4 à incuber dans les puits pendant 20 min à température ambiante.
  7. Introduire à la pipette 25 ul de la solution C dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante.
  8. Introduire à la pipette 10 ul de dH 2 O à la moitié des puits de contrôle et la moitié des puits d'essai. Pour l'autre moitié des puits de contrôle et des commandes de test, pipette 10 ul de solution D. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  9. Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d'onde d'excitation de 345 nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm.

5. pAD4 Temps cours dosages à 37 ° C et la température ambiante

  1. De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 125 uM de ZRcoum dans l'eau. Cette solution 125 uM ZRcoum sera la solution A.
  2. Préparer un tampon de 62,5 mM de NaCl, Tris 62,5 mM, 12,5 mM de CaCl2, 6,25 mM de DTT, et 5 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution B.
  3. Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d'EDTA. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution C.
  4. Obtenir 2 plaques à 96 puits et pipette 160 ul de solution B dans # montant de puits (nombre de puits dépendra du nombre de points de temps).
  5. Incuber une plaque de 96 puits à 37 ° C. Incuber la plaque 96 autre bien à température ambiante.
  6. Topette 40 pi de la solution A dans tous les puits dans les plaques à 96 puits et immédiatement pipette 10 ul de la solution dans les puits C t = 0 min. Continuer l'ajout de 10 ul de la solution C à des points de temps spécifiques jusqu'à ce que tous les puits ont été trempés.
  7. Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d'onde d'excitation de 345 nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm.

6. PAD4 test d'inhibition à la température ambiante

  1. De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution 83 M de ZRcoum dans l'eau. Cette solution de ZRcoum 83 uM sera la solution A.
  2. Peser Cl-amidine (MW 424,8 g / mol) et préparer une solution stock de 100 pm. Ce sera la solution B.
  3. Préparation d'un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, 0,02% de Triton X-100, et 8 uM PAD4 (pH = 8,0). Ce sera la solution C.
  4. Préparation d'un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, 20 mM de CaCl2, 2 mM de TCEP, et 0,02% de Triton X-100 (pH = 8,0). Thest sera la solution D.
  5. Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d'EDTA. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution E.
  6. Obtenir une plaque de 384 puits et désigner puits pour les contrôles (pas pAD4), puits d'essai (+ pAD4), et les puits d'inhibition (PAD4 + Cl-amidine).
  7. Pipette 25 ul de la solution C dans les puits d'essai et pipette 25 ul de la solution D dans les puits de contrôle. Autoriser tampon avec / sans PAD4 à incuber dans les puits pendant 20 min à température ambiante.
  8. Pipette de 10 pi de solution B dans les puits d'inhibition et incuber pendant 20 min à RTE.
  9. Introduire à la pipette 15 ul de la solution A dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante.
  10. Introduire à la pipette 10 ul de la solution E à tous les puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  11. Obtenir une lecture de fluorescence sur un lecteur multimodal avec une longueur d'onde d'excitation de 345 nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm.

7. cellulaire brut lysat Assayà la température ambiante

  1. Après la récolte des cellules à partir de PAD4 croissance de 1 L, remettre les cellules dans 10 ml de Tris 50 mM, NaCl 50 mM, 0,1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF, MW 174,94 g / mol) et 1 mM de dithiothréitol (DTT, 154,25 g / mol), le pH = 8,0.
  2. Lyser les cellules par traitement aux ultrasons pendant 15 min à 4 ° C. Centrifuger le lysat cellulaire à 20 000 x g pendant 20 min à 0 ° C. Concentrer le surnageant clair à la moitié du volume par centrifugation à 4000 rpm à 4 ° C en utilisant 100k MW tubes à centrifuger coupure.
  3. De 10 mM ZRcoum mère, préparer une solution de 250 M de ZRcoum dans l'eau. Cette solution 250 uM ZRcoum sera la solution A.
  4. Préparation d'un tampon de NaCl 100 mM, Tris 100 mM, CaCl2 20 mM, et 2 mM de TCEP (pH = 8,0). Ce sera la solution B.
  5. Peser la trypsine cristalline (provenant de pancréas de bovin) et de préparer un 10 mg / ml dans 100 mM d'EDTA. Mélanger jusqu'à ce que la solution claire et conserver à -20 ° C. Ce sera la solution C.
  6. Obtenir une plaque et la conception de 384 puits noirmangé puits de contrôle (pas de lysat cellulaire) et des puits de test (+ lysat cellulaire).
  7. Introduire à la pipette 100 ul de solution B dans tous les puits et la pipette 60 ul de lysat de cellules dans des puits d'essai. Incuber pendant 20 min à température ambiante.
  8. Introduire à la pipette 40 ul de la solution A dans tous les puits et incuber pendant 45 min à température ambiante.
  9. Introduire à la pipette 10 ul de la solution C à tous les puits. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
  10. Obtenir une lecture de fluorescence sur le lecteur multimodal avec une longueur d'onde d'excitation de 345 nm et une longueur d'onde d'émission de 465 nm.

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Representative Results

Dans un premier temps, il a été démontré que ZRcoum peut rendre compte de l'activité de PAD4 dans un format de plaque à 96 puits. Les puits ont été incubés avec la ZRcoum de substrat et en présence / absence de PAD4. Après une période d'incubation de 45 min à 37 ° C, la fluorescence a été mesurée avec un 340/40-475/15 nm filtre (figure 2A). Comme prévu, les niveaux de fluorescence sont restés faibles comme le fluorophore dans ZRcoum (ou la citrulline ZRcoum) sont restés à l'état verrouillé. Lors de l'addition d'un excès de trypsine / EDTA à la solution, les fluorophores sont libérés de ZRcoum mais restent essentiellement inchangées en présence d'PAD4. L'addition d'EDTA a pour but d'aider à la cessation de la réaction PAD4 en raison de sa capacité à chélater les ions calcium essentiels. A partir de ces données, une diminution de 5,2 fois de la sortie de la fluorescence a été observée en présence de PAD4. Ensuite, l'échantillonatibility du dosage nouvellement développé avec les plates-formes de criblage à haut débit a été démontrée. Il est d'un intérêt primordial pour analyser quatre variables de la réaction qui seraient les plus favorables à des fins de criblage (1) la poursuite de la miniaturisation du volume de dosage (2) la possibilité d'effectuer l'essai à la température ambiante (3) la stabilité du mélange de protéines et un tampon avant de terminer l'essai et (4) les risques de brouillage de solvants / détergents organiques.

Pour la mi ou les efforts de criblage à haut débit, plaques et à haute densité sont couramment utilisées dans les petits écrans de la molécule. Il a été vérifié que le dosage peut être effectué presque identique dans une plaque à 384 puits par rapport à une plaque à 96 puits (figure 2B). Pour déterminer plus précisément les conditions de travail pour l'analyse dans un format à haut débit, il est important de déterminer si l'activité de PAD4 peut être contrôlée dans un délai raisonnable à la température ambiante. Comme tous les instruments de manipulation des liquides ontun régulateur de température, il peut devenir lourde et coûteuse à avoir une étape d'incubation à une température élevée. En outre, la comptabilisation des variations de la température peut être une cause de divergence entre les plaques et les pistes. Afin de déterminer l'effet de températures plus basses de l'essai décrit ici, une analyse similaire a été effectuée à température ambiante. Il a été constaté que les signaux sont restés pratiquement inchangés entre 37 ° C et la température ambiante (figure 3). Pour optimiser encore davantage les performances de l'essai en minimisant le temps d'incubation nécessaire entre PAD4 et le substrat, la cinétique de la réaction a été analysée. PAD4 activité a été suivie dans le temps à la fois à la température ambiante et 37 ° C. Comme on s'y attendait, il apparaît que PAD4 est plus actif à 37 ° C (conformément à la température physiologique humain) avec la réaction essentiellement complète en 20 min. Satisfaisante, la réaction ne soit pas fortement affecté par la diminution de la température jusqu'à la température ambiante. La réaction se déroule à peu près la moitié de la vitesse à latempérature élevée et est essentiellement complète après l'initiation de 40-45 min. Depuis le temps des analyses bien sûr, cinétique constantes ont été calculés et les paramètres (K M = 397 uM, k cat = 2,98 s -1, k cat / K M = 7400 sec -1 M -1) ont été trouvés à être semblable à d'autres PAD4 substrats. 31 Avec la cinétique de la réaction, caractérisé, tous les essais ultérieurs ont été réduites à une heure de début au point de mesure.

Ensuite, la stabilité a été évaluée de PAD4 lorsqu'il est dissous dans le tampon de réaction sur une période de temps prolongée. De façon réaliste, criblage à haut débit sera à prévoir des réactifs généralement stable pendant plusieurs heures alors que l'instrument est termine l'écran. Si certains réactifs ont une durée de vie relative de minutes, il peut être très coûteux et prend du temps de mettre fin à l'écran afin de préparer des réactifs frais. En fonction des conditions de dosage, il estinhabituel pour certains tests d'être incompatible avec la haute dépistage par-mettre pour cette raison. Avec cette idée en tête, la stabilité de PAD4 dans le tampon a été suivie pendant plusieurs heures. Presque pas de perte d'activité enzymatique n'a été observée tout au long de la période de temps, ce qui indique que la protéine est stable même après être resté assis à température ambiante pendant plus de 15 h (figure 4A). Ensuite, il a été évalué que le dosage de fonctionner dans des conditions miniaturisés et à la température ambiante serait toujours répondre de manière appropriée à la présence d'un PAD4. Après l'incubation de l'inhibiteur de PAD4 connu, chloroamidine (Cl-amidine), conduit à une restauration complète du signal de fluorescence conforme à l'inhibition complète de PAD4 (figure 4B). Enfin, il a également été vérifié que la présence du solvant organique DMSO, couramment utilisé dans les solutions mères de petites molécules, jusqu'à 3% en tant que volume final, ne pas interférer avec le dosage (données non présentées). De même, l'addition de 0,01% de Triton X-100 a donné lieu à siml'évolution de la fluorescence ILAR (données non présentées).

Après avoir montré que le dosage est tolérant à une variété de conditions qui sont généralement rencontrés dans les petites molécules efforts de découverte de médicaments, un examen préalable de 80 composés a été réalisée et un Z 'valeur robuste de 0,71 a été identifié. En favorisant le potentiel de l'essai, la sélectivité de la réaction PAD4 / ZRcoum a été mis en évidence en effectuant la réaction dans des lysats de cellules entières brut. E. cellules de E. coli contenant le vecteur d'expression de GST-PAD4 ont été induites avec de l'IPTG, similaire au mode opératoire utilisé pour l'isolation de GST-PAD4. Après la rupture de la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'ultrasons, le débris cellulaire a été séparé par centrifugation pour obtenir un lysat cellulaire clarifié. Lorsque le lysat cellulaire contenant de PAD4-a été soumis aux mêmes conditions d'essai que l'essai de TPS-PAD4 purifiée, le signal de fluorescence varie en accord avec la présence de PAD4 actif en solution ( > La figure 5). Les lysats cellulaires contiennent un certain nombre de macromolécules biologiques à des concentrations élevées qui pourraient éventuellement interférer avec l'activité de PAD4, les propriétés fluorescentes de ZRcoum, et l'étape de la trypsine. La découverte que l'essai était fonctionnel dans des lysats cellulaires bruts indique qu'il existe une grande sélectivité dans la réaction entre PAD4 et ZRcoum. Pour démontrer en outre que la diminution du signal en présence de lysats cellulaires bruts était spécifique de la présence d'PAD4 actif, l'effet de Cl-amidine, un inhibiteur covalent du PAD4 établi, a été évaluée. L'addition de Cl-amidine a conduit à une restauration du signal de fluorescence, conforme à l'inactivation de PAD4 (Figure 5). Ensemble, il a été démontré le dosage peut être encore simplifiée en utilisant des lysats cellulaires bruts pour la surveillance de l'activité PAD4.

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Figure 1. PAD4 et la conception de son analyse par fluorescence. (A) représentation de dessin animé des assemblées des histones qui composent l'unité de base d'un nucléosome. PAD4 catalyse la citrullination d'un certain nombre de résidus d'arginine sur les protéines histones. (B) ZRcoum recouverte avec le substrat natif (caché pour plus de clarté) de PAD4 (code d'adhésion 2DW5). (C) Représentation des étapes d'un dosage de PAD4 typique. Citrullination par PAD4 de la ZRcoum de substrat réduit sa sensibilité aux amide hydrolyse à la trypsine médiation, provoquant ainsi un changement dans les niveaux de fluorescence. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 2 Figure 2. PAD4 essai dans 96 puits et à 384 puits formats de plaques. La fluorescence a été mesurée (excitation 345 nm / émission 465 nm) à la fois dans un format à 96 puits (A) et un format de 384 puits (B) avec les conditions désignées (37 ° C). L'addition de la protease trypsine conduit à une forte augmentation des niveaux de fluorescence dans les puits sans PAD4 et reste pratiquement inchangée pour puits avec PAD4. Les données sont représentées sous forme de moyenne + SD (n = 3). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 3
Figure 3. Analyse de temps de parcours PAD4 dosage. La fluorescence a été mesurée (excitation 345 nm / émission 465 nm) périodiquement dans un format de plaque à 96 puits pendant 70 mn avec la protéine est incubée à 37 ° C, soit° C (A) ou à température ambiante (B). Les données sont représentées sous forme de moyenne +/- SD (n = 3). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 4
Figure 4. La stabilité et l'inhibition de la protéine (A). L'activité de PAD4 a été mesurée après des intervalles de temps désignés. A titre de comparaison, les niveaux de fluorescence sont représentés en l'absence de PAD4. les niveaux de fluorescence sont montrés avant (rouge) et suivant (vert) l'addition de trypsine. (B) L'introduction de l'inhibiteur de Cl-PAD4 connu amidine (100 uM) a conduit à une restauration du signal de fluorescence dans un format de plaque 384 puits à température ambiante. les niveaux de fluorescence sont montrés avant (rouge) et suivant (vert) l'addition de trypsine. Toutes les données sont represemée en tant que moyenne +/- SD (n = 3). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

Figure 5
Figure 5. cellule dosage de lysat brut. Le dosage a été effectué en l'absence et en présence de lysats cellulaires bruts dans un format de plaque 384 puits à température ambiante. les niveaux de fluorescence sont montrés avant (rouge) et suivant (vert) l'addition de trypsine. Cl-amidine (100 M) a également provoqué une augmentation du signal de fluorescence dans ces conditions. Toutes les données sont représentées sous forme de moyenne +/- SD (n = 3). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de la figure.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter http://www.perkinelmer.com

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Chimie Numéro 93 PAD4 PADI4 citrullination l'arginine la modification post-traductionnelle HTS le dosage la fluorescence la citrulline
Suivi par fluorescence de PAD4 activité via un analogue de substrat Pro-fluorescence
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Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, … More

Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).

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