Abstract
점막 병원균에 대한 초기 방어는 상피 장벽과 선천성 면역 세포로 구성됩니다. 모두의 immunocompetency, 그들의 상호는 감염에 대한 보호를 위해 매우 중요하다. 병원체와 상피 및 선천성 면역 세포의 상호 작용은 가장 복잡한 문제는 시간과 공간에 펼쳐지는 생체 내에서 조사하고 있습니다. 그러나, 기존 모델은 점막 수준에서 병원균과 전투의 쉬운 공간 - 시간 영상을 허용하지 않습니다.
여기에 개발 된 모델은 청소년 제브라 피쉬의 swimbladder에 곰팡이 병원균, 칸디다 알비 칸스의 직접 주입하여 점막 감염을 만듭니다. 얻어진 감염 질환의 점막 상피에 걸쳐 개발 및 선천성 면역 세포 행동의 고해상도 영상화를 가능하게한다. 이 방법의 다양성은 산도로 이어지는 면역 이벤트의 상세한 순서를 조사하기 위해 호스트의 심문을 허용agocyte 모집 특정 세포 유형과 보호 분자 경로의 역할을 조사하고. 또한, 면역 공격의 함수로서 병원체의 동작은 형광 단백질 발현을 C. 동시에 사용하여 묘화 될 수 알비 칸스. 호스트 병원체 상호 작용의 증가 된 공간 해상도는 설명 빠른 swimbladder 해부 기술을 사용하는 것도 가능하다.
여기에 기재된 점막 감염 모델은 점막 칸디다증의 연구를위한 가치있는 도구 만드는 간단하고 높은 재현성이다. 이 시스템은 또한 일반적으로 상피 표면을 통해 감염, 마이코 박테리아 세균 또는 바이러스 성 미생물로 다른 점막 병원균에 광범위하게 번역 될 수있다.
Protocol
참고 : 모든 제브라 피쉬의 치료 프로토콜과 실험 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜 A2012-11-03에서 NIH의 지침에 따라 수행되었다.
4 일 포스트 시비 1. Zebrafish의 양육
- 다른 동영상 34에 도시 된 바와 같이, 제 3 시간 포스트 시비 내에 AB 제브라 피쉬, 또는 다른 형질 전환 계통 모아서.
- (0.17 mM의 KCl을 0.33 mM의 염화칼슘이 0.33 mM의의 MgCl 2, 2 mM의 HEPES, pH가 6.8 5 mM의 NaCl을) 메틸렌 블루 (0.3 ㎍ / ml의 최종 E3 미디어 150 ㎖를 포함하는 15cm 페트리 접시에 120 알을 품어 12/12 / 암 광주와 33 ° C 배양기에서 농도).
- E3 + PTU (1- 페닐 -2- 티오, 10 ㎍ / ml의 최종 농도)와 6 시간 후 용지를 교체하고 죽은 계란을 제거합니다.
- 이일 후 신선한 E3 + PTU와 미디어를 교환, 33 ° C에서 4 일 동안 품어.
2.에서켜졌 마이크로 니들 준비
- 다음 설정을 사용하여 바늘 풀러를 사용하여 미세 바늘로, 붕 규산염 모세관 (ID 0.69 mm OD 1.2 mm)를 당겨 (550 열을 0 풀을 130 속도 110 시간).
주 : 설정 필라멘트 다를 것이다 (도 1 참조)와 마찬가지로 형상의 미세 니들을 얻었다 필라멘트와 새로운 필라멘트가 설치 될 때마다 재조정 될 필요가있을 것이다. - 0.4 μm의 필터링 된 인산 완충 식염수 3 μL와 마이크로 바늘을 채우기 (137 mM의 NaCl을, 2.7 mM의 KCl을, PBS 10 mM의 나 2 HPO 4 1.8 mM의 KH 2 PO 4 7.4의 pH) 20 μL의 microloader 피펫을 사용하여 팁.
- 압력 분사 시스템에 부착 된 미세 조작기에 마이크로 피펫 홀더에 마이크로 바늘을 설정합니다. 30 PSI 및 분사 압력에서 30 msec의 펄스 지속 시간을 설정한다.
- 바늘의 1/5이 될 때까지 물을 증류수로 페트리 접시를 사용하여, 미세 니들을 낮출. 마이크로 니들 위스콘신 클립그냥 물 수준 이하로 미세 핀셋을 토륨. 물 밖으로 미세 바늘을 가져오고 러스가 나타날 때까지 페달을 여러 번 누릅니다.
- 한 방울 형 침지 오일 계층화 혈구에 마이크로 바늘을 하강시킴으로써 루스의 직경을 측정한다. 원하는 부피를 얻기 위해 펄스 폭을 조정한다 (표 1 참조).
- 기름에 안정적으로 유지 (루스가 볼륨을 증가하면 압력을 낮추고 일시 볼륨이 감소하면 배압을 증가) 할 러스에 대한 배압을 설정합니다. 각각의 마이크로 니들의 펄스 지속 시간을 기록한다.
- microloader 피펫 팁을 사용하여 흡입하여 미세 바늘에서 PBS를 제거하고 인젝터에 다시 배치하고 연속 펄스 스위치를 젖혀 왼쪽 위에 PBS를 추방. 각각의 마이크로 바늘을 보유합니다.
3. 칸디다 준비
- 킬 칸디다 알비 칸스 코돈 최적화 dTomato, GFP, BFP, EOS 또는 원거리로 형질 전환효모 peptine 덱 스트로스 (YPD) 한천 플레이트 (10g /의 L 효모 추출물, 20g / L 펩톤에 멸균 나무 앵커를 사용하여 냉동 주식에서 (-80 ° C 주식 25 % 글리세롤) 레드, 20g / L의 포도당 , 20g / L의 한천은, 멸균 및 배양 접시에 25 ml에 부어) 30 ° C에서 하룻밤 배양한다.
- 멸균 나무 앵커를 사용하여 하나의 식민지를 선택하고 YPD 액체 (10g /의 L 효모 추출물, 20g / L 펩톤, 20g / L의 포도당을 5 ml에 접종, 멸균 및 무균 16 × 150mm 유리 문화 5ml에 분주 튜브).
- 60 rpm에서 롤러 드럼에서 30 ° C에서 밤새 인큐베이션.
- C. 1 ㎖를 수집 1.7 ml의 멸균 원심 분리기 튜브에 알비 칸스 문화 및 전송.
- 초 몇 5,000 XG에 원심 분리기. 뜨는을 비우고 철저하게 멸균 PBS, 소용돌이 1 ㎖를 추가합니다. 이 두 번 반복합니다.
- 멸균 PBS에서 1,000 : 1 ml의 수량 1 개를 희석하여 혈구를 사용하여 식민지를 계산합니다.
4에 Zebrafish의 주입Swimbladder
- 33 ° C의 배양기에서 30 분 동안 주입 접시 (2 % 아가 로스)을 따뜻하게.
- 원하는 시간에, 어떤 제브라 피쉬를 흡입하지 않고 25ml를 피펫을 사용하여 주입하는 물고기를 포함 15cm 페트리 접시에서 E3 + PTU의 150 ml의 100를 제거합니다.
- 나머지 50 ㎖ 미디어 (최종 농도 200 ㎍ / ㎖)에 4 ㎎ / ㎖ 버퍼 tricaine 메탄 설포 네이트 재고 (TR) 2 ㎖를 추가하여 제브라 피쉬 DPF (4) 마취 15 분 동안 기다립니다.
- 해부 현미경, 팽창 swimbladder 물고기를 선택합니다. 물고기는 또한 MPO에서 호중구 분포로, 균일 한 표현형을 위해 그 시간에 상영 할 수 있습니다 GFP 라인은 해부 현미경 표면 형광을 사용.
- C. 희석 원래의 농도에서 알비 칸스의 재고 1.5 × 10 7 식민지 PBS에서 ㎖ (CFU / ㎖) 당 단위를 형성한다 (단계 3.8).
- 플라스틱 전열관을 사용하여 사출 접시 (30) 상으로 전송 지브라 피쉬TTE 및 초과 용지를 제거합니다.
- 낚시 선 도구 (0.012 인치 직경 낚시 줄 보로 실리케이트 모세관에 슈퍼 접착)를 사용하여, 수직 사출 접시를 들고 10 물고기의 3 선을 수직으로 물고기의 방향을.
- 초과 한 용지를 제거합니다.
- 철저히 1.5 × 107 CFU로 튜브 와동 / ㎖ C. 알비 칸스.
- C. 3 ㎕를 하나의 마이크로 바늘을 채우기 알비 새로운 microloader 피펫 팁을 사용하여 적절한 설정으로 펄스 지속 시간을 설정한다 (단계 2.9 참조).
- swimbladder (도 3a)의 후방을 향해 조준, 미세 니들 및 물고기의 머리 사이의 20 °의 각도를 만들기 위해 분사 접시 돌린다.
- , swimbladder로 마이크로 바늘을 밀어 바늘의 구멍은 루멘에 확인하고, 한 번 페달을 누르십시오.
- 각각의 물고기를 반복 E3와 함께 요리를 홍수에 의해 복구 접시 (25 ml의 E3 + PTU)로 전송D 복구 접시에 그것을 비우는.
- 사출 접시에 다른 30 물고기를 전송합니다.
- 철저하게 가득 새로운 마이크로 바늘 반복 주입은 C를 와동 알비 칸스.
- 필요한 경우 오염을 방지하고 별도의 복구 접시 (단계 4.10)로 전송하기 위해 다른 주사 접시를 사용하여, PBS 제어를 주입하여 마침.
5. 원하는 접종의 물고기 상영
- 용해 될 때까지 레인지 작동, 37 ° C로 냉각 비등, E3의 40 ml의 0.4 % 아가로 오스 솔루션 (LMA) 낮은 용융 160 mg을 추가하여 낮은 용융 아가로 오스 40 ml의를 준비합니다. 한 번 냉각 TR (최종 농도 200 ㎍ / ㎖)의 400 μl를 추가합니다.
- (25 ㎖ E3 + PTU, 최종 농도 200 ㎍ / ㎖의에 TR 만 1 ml의 사용 단계 4.3) 기술로 30 분 복구 후 물고기를 마취시키다.
- 무게 보트 LMA 2 ㎖에 (가능한 한 작은 매체) 전송 (30) 물고기.
- 기음 개별 전송 피펫과 물고기와 만 10 × 6 중앙 우물을 사용하여, 96 웰 이미징 플레이트에 LMA 1 방울과 물고기를 접시.
- 화면에 모든 물고기가 이미징 플레이트에 장착 될 때까지 반복합니다.
- 미디어가 5 분 동안 실온에서 고화하자.
- 그들은 유리 바닥과 접촉 확인하고, 그들의 편에서 물고기를 놓습니다.
- 반전 표면 형광 / 공 초점 현미경 및 적절한 필터 20X 대물 렌즈를 사용하면, C.의 수를 기록 각 물고기의 swimbladder에 알비 칸스의 효모 세포.
- , swimbladder 15-25 효모 세포와 물고기 (또는 원하는 접종)을 선택 안락사 선택되지 않은 물고기 (E3에서 TR 800 μg의 / ㎖)에 의해 E3 + PTU 50 ml로 깊은 페트리 접시에 선택한 생선을 반환 촬상 선택된 웰 플레이트 E3의 3 방울을 첨가하고, 플라스틱 전송 피펫으로 흡입 물고기.
- 원하는 기간 동안 33 ° C에서 품어.
6. 물고기 사후 심사 이미징
- 원하는 시간, 이미지를 포함하는 어류 깊은 페트리 접시에서 E3 + PTU 매체의 50 ㎖의 25을 제거한다.
- (25 ml의 E3 + PTU 나머지, 최종 농도 200 ㎍ / ㎖의에 TR 만 1 ml의 사용 단계 4.3) 기술로 물고기를 마취시키다.
- 적절하게 96 웰 이미징 플레이트와 위치로 물고기 플레이트 (5.7 - 5.3 단계).
- 적절한 레이저와 방출 필터를 사용하여 공 초점 현미경을 스캔하여 이미지. 제 1 차동 간섭 대비 (DIC) 하에서 4X 목적을 사용 물고기 초점과 2 마이크로 초 / 화소 속도 및 1,024 × 600 화소 종횡비 스캔 모드에서, 공 초점 레이저를 20X 대물 렌즈를 이용하여 관심 영역의 화상을 취득. 3 프레임 칼만 필터 모드를 적용, 1 ㎛의 크기를 갖는 Z-스택을 획득.
- 50 ㎖ E3 + PTU 또는 individua에 깊은 페트리 접시로 돌아 가기L 우물 (24 웰 배양 접시, 3 ㎖ E3 + PTU), 33 ° C에서 품어.
7. Swimbladder 해부
- 높은 진공 그리스와 10 ML의 주사기를 입력합니다.
- 2 % LMA (아가로 오스 E3 8 ml의 낮은 녹는 160 MG와 단계 5.3)을 준비합니다.
- 원하는 시간, 물고기 (단계 5.2)를 마취시키다.
- 이전 10 E3 1 ㎖와 함께 1.7 ㎖의 원심 분리 관에 물고기와 원심 분리 튜브에 4 ㎎ / ㎖ Tricaine (최종 농도 800 ㎍ / ㎖) 200 μL를 첨가하고, 실온에서 15 분 동안 인큐베이션에 의해 안락사.
- 마이크로 슬라이드 (75 X 25mm, 그림 2)에 1cm 간격, 광장에 진공 그리스의 4 방울을 배치하여 영상 유리 슬라이드를 준비합니다.
- 광장의 중앙에 2 % LMA 2 방울을 놓습니다.
- 해부 현미경 별도의 유리 슬라이드에 하나의 물고기를 놓고 심장이 박동을 멈 추면 확인, 여분의 수분을 제거합니다.
- 소화 기관에서 분리, 왼쪽 핀셋 공기 덕트에 의해 swimbladder을 선택하고,이 응고되기 전에 2 % LMA의 중심에 배치합니다.
- 이미징 유리 슬라이드의 상단에 커버 슬립 (18 X 18mm)를 놓고는 진공 그리스뿐만 아니라 LMA (그림 2)에 닿을 때까지 밀어 넣습니다.
- 해부의 10 분 내 이미지 단계 6.4에 설명 된대로. 단계를 반복 7.7-7.11 다른 물고기와.
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Representative Results
후방 swimbladder에 미세 주입
여기에 제시된 실험 방법은 C의 일관된 용량의 주입을 설명 제브라 피쉬 DPF 4의 swimbladder에서 알비 칸스의 효모 세포. 침지 모델과 이전 작업 제안이 C.에 swimbladder 면역 반응 알비 칸스 (Candida albicans)는 포유류의 점막 칸디다증 (32)와 유사하다. 여기에서 우리는 더 간단 재현하고 빠르다 수정 감염 방법을 보여; 제브라 피쉬의 수백 주입하고 몇 시간 내에 검사를 할 수 있습니다.
swimbladder의 정확하고 재현성있는 감염은 미세 주입하여 기관의 후방 지역을 대상으로하여 수행됩니다. swimbladder에 주입 애벌레 또는 배아 제브라 피쉬 (예를 들어, 정맥 또는 후뇌 뇌실)에 대한 대부분의 다른 미세 주입 경로보다 배우기 쉽다. 주입 전에 물고기의 준비는 미입니다물고기가 오래된 있도록 swimbladder 필요한 것을 제외하고 다른 주사 부위에 대한 그 고맙다는 팽창한다. 33 ° C로 승온 물고기의 약 75 %가 (4)에 의해 DPF가 팽창 swimbladder (데이타 미기재). swimbladder가 물고기를 분사 사용 표피뿐만 아니라 얇은 근육층 및 미세 바늘 아래에 위치하는 경 사진 될 필요가있다. 물고기가 주입되는 각도 (도 3A)도 크게 절차의 속도 및 용이성을 개선시킨다. 그것은 모든 선별 효모 세포의 가시화를 허용하고 선출 범위 스큐 것이다 swimbladder 양쪽 효모 세포의 존재를 없앴 swimbladder의 뒤쪽의 볼 루스 주입 중요하다. swimbladder의 뒤쪽으로 주입하면 공기 덕트를 통해 다음 소화관 아래로 접종의 가능한 손실을 방지 할 수 있습니다. 루스가 기포와 변위로 주입 된 생선 확인은 비교적 쉽다다시 swimbladder의 후속 미디어 (그림 3C)으로 가득합니다. 이것은 분사 될 때 쉽게 가시화되는, 페놀 레드를 사용하는 것도 가능하다. 때문에 C.의 크기 알비 칸스 효모 세포 (3-4 μm의)을 접종 도즈 인해 미세 니들의 막힘 ㎖를 5 × 107 CFU / 농도 이하로 제한된다. 이것은 5 NL 루스 내의 하나 내지 250 효모 세포의 주입을 허용한다. 우리의 손에, 1.5 × 10 7 CFU에서 4 NL을 주입 / ㎖가 가장 일관된 결과를 주었다. 이것은 어류 당 10-50 효모 세포의 범위에서 귀착되었다. 15-25 효모 세포 (그림 3B)에 접종을 좁히는 것은 엄격한 표현형 및 응답을 제공합니다. 이러한 조건을 사용하여, 주입 물고기의 약 50 % (데이터는 제시하지 않음) 95 % 이상의 생존율 24 시간 포스트 분사와 적절한 접종 범위를 갖는다. 또한 병원균에 부담의 효과를 조사하기 위해 낮은 / 높은 접종원 물고기를 유지하는 것도 가능하다질병 개발.
swimbladder은 (400 X 200 X 200 μm의은, L x 높이 x 폭은 타원체의 볼륨에 대한 공식을 사용하여) 그래서 더 높은 볼륨의 주입하는 것도 가능하다 약 100 NL 전체 볼륨 (4 NL 3 펄스까지왔다 물고기의 생존에 현저한 영향없이 사용, 데이터는 도시하지 않음).
개별 물고기의 종 생체 내에 영상은 호스트와 병원체의 행동을 모두 따르도록
호스트와 병원체 모두의 동작은이 모델을 사용하여 몇 일 동안 비 침습적으로 올 수 있습니다. 이미지 능력 생체 내에서 높은 해상도에서 감염의 발달과 점막 칸디다증의 발병 기전을 조사하는데 사용될 수있다. 호중구는 생쥐와 인간 35-38에서 칸디다에 저항하는 데 중요한 역할을합니다. 사용 MPO : GFP 지브라 피쉬 39 (호중구 녹색 형광 단백질을 발현) 및 C. 알비 칸스 (Candida albicans)는 dTom을 표현적색 형광 단백질 (32) 아토, 우리는 감염 초기 (그림 4) 동안 neutrophil- 칸디다 역학을 관찰했다.
호중구 점막 감염 부위로 보충되는 제 선천성 세포 유형과 함께 살아있는 C. swimbladder 감염 아르 알비 칸스 (Candida albicans)은 호중구 (그림 4A, B)의 신속하고 지속적인 채용 리드. 열 살해 효모 세포 (그림 4A, B) 주사 하였다 흥미롭게도, 호중구는 실질적으로 swimbladder에 채용되지 않습니다.
필라멘트는 효모 세포와 C의 주입 후 신속하게 개발 알비 칸스 (Candida albicans)는 최초의 48 시간 포스트 분사 (HPI)에 대한 발아하고 있습니다. 그러나, 필라멘트의 수가 감소이 시점 (도 4d)과 효모 증가 비율 후 (도시 생략). 능력은 개인의 물고기가 비 침습적 이러한 종 연구를 가능하게 준수 (24 웰 플레이트조직 배양 접시) 및 질병의 진행 및 호스트 응답 (그림 4C)의 개별 차이를 강조한다. 며칠 동안 감염 부위에 곰팡이와 면역 세포를 열거 이러한 상세한 연구는 마우스에 실용적이지 남아있다.
빠른 swimbladder 해부 기술은 이미지를 개선하기 위해
C. 면역 함께 또는 상피 세포의 상호 작용을 이미징 알비 칸스 (Candida albicans)는 여기에 제시된 모델에 상대적으로 용이하다. 그러나, 특정 상황에서, 기포의 존재 swimbladder, 피부 및 근육을 둘러싼 조직의 두께는, 상세한 공간 해상도를 손상시킨다. 이미지 품질을 개선하기 위해 우리가 초점 현미경 (도 5a)에 의해 (10 분 이내) 지브라 피쉬 빠르게 화상을 밖으로 swimbladder 해부하는 방법을 개발 하였다. 형광 편재 발현 형질 전환 어류 라인을 묘화 할 때 특히 유용GFP 40 α-catenin의 : 황 선 (41, 42) (그림 5B, C) 및 NF-κB와 주변 조직의 외부 형광이있다. 이 기술은 빠르게 수행 할 수 손재주와 연습이 필요하지만, 시도 모든 물고기의 완전히 이미지 95 %까지 가능하다.
그림 1 : swimbladder 주입을위한 마이크로 바늘 모양. 미세 바늘 형상의 측정 (A) 개요. A.로부터 미세 니들 팁의 (B)의 각 배율 B 주요 수직선 간격 0.2 mm이다.
그림 2 : 슬라이드 이미징. 2 % LMA 강하 유리 슬라이드에 1cm 간격 진공 그리스, 4 점의 중간에 배치된다. 너가 너무cted의 swimbladder은 LMA의 중앙에 배치하고 LMA와 진공 그리스에 닿을 때까지 커버 슬립 위에 저하된다.
그림 3 : swimbladder에서 C. albicans에의 주입 주사 부위에 국부 남아있다. (A) 지브라 피쉬 유충 DPF 4 swimbladder 뒷면에 C. 알비 칸스를 주입 미세 니들의 방위 및 위치의 회로도. (B) 표면 형광 현미경으로 15-25 효모 세포의 주입 루스 한 선택 이후 주제 균액 물고기의 3 가지 그룹. C.의 그룹 N = A, B, 및 C는 각각 17, 17, 20. (C) 대표 화상, 평균 및 평균의 표준 오차 나타낸다 알비 칸스 (Candida albicans)는 인제 직후 AB 청소년의 제브라 피쉬에 감염 (CaF2를-dTom는, 적색 형광은 칸디다 균을 표현)ction의. 이미지 (각각 왼쪽과 오른쪽 패널) 10 배와 20 배 목표에 인수 DIC 채널의 단일 슬라이스 빨강 채널 (12, 19 조각, 각각)에서 최대의 돌기가 복합되어 있었다. 기포 (노란색)과 상피 (흰색)의 개요는 왼쪽 패널에 표시됩니다. 스케일 바 (250) 및 50 μm의 표현, 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Swimbladder 주입 호스트 병원체 역학의 시공간적 해부 수 있습니다. (A) MPO의 대표 이미지 : 4 DPF에서 swimbladder 라이브 또는 열 사망 (HK)의 CaF2-dTom 주입 및 GFP 물고기 라인은 48 HPI 군데. 이미지는 녹색에 최대 투사의 복합 아르차 빨간색 채널 (20 조각)과 DIC 채널의 한 조각. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. (B, C). C.에 대한 응답으로 호스트 알비 칸스 (Candida albicans) 감염. 호중구는 빠르면 6 HPI 등의 감염 (SOI)의 사이트에 모집 48 시간 이상 수의 계속 증가하고 있습니다. 이미지에 대한 가능성과 (24 웰 플레이트)로 구분 개별 물고기를 유지 자세한 면역 역학이 가시화 될 수 있습니다. (D) 병원체 응답. C.를 알비 칸스 (Candida albicans) 효모 세포는 처음 24 HPI에 대한 발아하지만 24 HPI에서 효모 세포로 되돌릴 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 미세한 세부 사항이 몇 군데의 swimbladder의 해부 할 수 있습니다. t의 (A) 도식 표현그는 4-5 DPF의 제브라 피쉬의 swimbladder의 해부에 참여 단계를 반복합니다. 파란색 화살표는 핀셋 (오른쪽 떠났다에 대한 L과 R)과 당기의 방향을 나타냅니다. (B, C). α-catenin의 해부 swimbladder의 대표 이미지 : 황수정 물고기 라인 41, 42 (녹색 꽉 접합) C. albicans에 4 DPF (CaF2를-dTom)에 주입 공 초점 현미경이 HPI에 의해 촬영. 패널은 빨간색과 녹색 채널에서 최대의 돌기 복합 (B 25 슬라이스와 C 3 조각) 및 패널 B. 스케일 바의 DIC에 대한 한 조각입니다 B 100 μm의 100 μm의 C. 10 μm의 하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 볼륨 (NL) | (1) | 이 | 3 | 4 | (5) |
| 지름 (mm) | 0.124 | 0.156 | 0.179 | 0.197 | 0.212 |
표 1 : 직경 관계에 일시 볼륨.
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Discussion
swimbladder의 미세 주입 질환 모델의 발전과 한계
여기에 제시된 모델은 Gratacap 등에 설명 된 점막 칸디다증 침수 모델의 확장이다 (2013).; 이는 제어 된 감염 시간의 장점, 높은 재현성 감염 도즈, 따라서 효율 향상을 추가한다. 우리는 여기서 비 침습적 훌륭한 세부 사항에 감염 역학의 시간적 문서뿐만 아니라 swimbladder의 높은 해상도 생체 이미징을 허용하는 새로운 방법을 보여줍니다. 이러한 절차는 C의 연구를 촉진한다 알비 칸스 (Candida albicans)은 점막에 면역 체계의 상호 작용의 역 동성을 -innate. 점막 감염 모델의 제한된 수 제브라 설명되었지만, 모든 소화관 장해 / 감염 24,43 한정. 여기에 제시된 swimbladder 모델은 폐에 약간의 유사성을 공유하고 밀폐 된 사이트를 제공하는 기관에 감염의 사이트를 확장병원균 덜 가능성이 감염의 씻겨합니다.
이러한 기술을 습득 할 때 고려되어야 여러 중요한 요인이있다. 가장 중요한 점은 팽창 swimbladder에 대한 요구 사항입니다. 이는 33 ℃에서 28 ° C 또는 4 DPF에서 사육 할 때 5 DPF에 세되는 물고기가 필요합니다 이 높은 온도는 물고기의 개발을 가속화 나은 포유류 상피 온도 (마우스 피부 온도는 33.1 ° C 44 임)의 생리 학적 범위를 근사화하기 위해 사용된다. 그러나,이 특정 온도 범위에서이 모델의 제한은 염두에 보관하고 관찰 표현형이 더 완전한 해석 포유류 시스템에서 확인해야합니다 필요합니다. 공기 덕트 physostomous 물고기 열려 (제브라 피쉬 포함)과 같이 주사 부위 (후방 swimbladder)는,도 중요 고압 INJswimbladder 과거와 소화 기관에 병원균을 밀어 수있는 기관의 다른 곳에서의 ection. 트렁크 물고기의 두께가 곤란 swimbladder의 양측을 가시화 할 수 있기 때문에, 효모 세포, swimbladder 뒤쪽의 모든 경우를 접종 정량은 덜 정확하다. swimbladder의 해부는 손재주가 필요하며 영상 인해 절차의 물리적 외상에 유물을 방지하기 위해 즉시 자리를 차지할 필요가있다.
기술의 한계는 물고기의 발달 단계에 주로 관련이 있습니다. 이 연구의 며칠 모르 기술의 사용을 제한 및 최저 효능 신중 전체 또는 부분 효능을 구별하기 위해 테스트되어야한다. 모르 폴리 노 활동은 개발에서이 말은 이전에보고 된, 우리는 성공적으로 5 DPF 여전히 효과적 검증 스플 라이스 차단으로,이 모델에 morpholinos을 사용했다. 알약의 사용물고기의 나이 제한이 없기 때문에 acological 약물이 특정 모델의 좋은 대안이 될 수 있습니다. 72 시간 게시물 수정 과거 물고기의 사용은 때때로, 애벌레 제브라 피쉬와 협력 기관 동물 관리 및 사용위원회에 따라보다 더 많은 감독이 필요합니다. 제브라 피쉬의 정적 실험실 조건 (45)에 10 일 이상 높은 가격에 생존하지 않는 연구의 길이도 제한됩니다. 반면에, 대신 젊은 배아 또는 애벌레의 개발 DPF 5의 치어를 사용하여 이러한 신장, 간이나 췌장 등 모든 기관이 46 ~ 49 완전히 기능적인 공부를 할 수 있습니다. 시험 관내 세포 배양 또는 생체 내 뮤린 모델에서 비교, (항체 및 화학 작용제 - 길항제) 시약을 사용할 수는 제브라 피쉬 제한된다; 그러나, 매체에 직접 화학 물질을 추가 할 가능성이 장점이다. 녹아웃 토너먼트에 제브라 피쉬의 수는 여전히 제한되지만 RIS됩니다대상 게놈 편집 전자는 돌연변이의 발생에 대한 흥미로운 가능성을 엽니 다. 상대적 용이성의 조합은 형광 리포터 라인 (세포 유형 또는 특정 경로 특정 시그널링) 청소년 지브라 피쉬의 투명성이 시스템의 기본 및 독특한 장점 중 하나이다 구축 하였다.
기대
제브라 피쉬 swimbladder 감염 모델은 상피를 통해 침입하는 병원균에 대한 감염의 새로운 경로를 제공하고 척추 질환을 프로빙이 기관의 유틸리티를 강조, 척추 동물의 점막 상피 세포에서 호스트 병원체 상호 작용에 대해 질문 할 수 있습니다 질문의 범위를 확장 .
점막 수준에서 상피 감염 Zebrafish의 모델은 약물이나 병원균 24,43에 의한 장관 교란의 영향을 조사가 발표되었다. 그러나,이 점막 칸디다증 모델 swimb을 활용하는 최초사다리 따라서 소화 기관 이상으로 제브라 피쉬에서 조사 할 수 있습니다 감염 부위의 범위를 확장합니다. swimbladder 점막 표면 및 포유 동물의 폐의 차이점은 완전히 해명되지 않는 이상이 척추 동물 모델에서의 데이터의 해석 / 번역 조심스럽게 이루어져야한다.
swimbladder 감염은 척추 동물 감염 모델에서 현재의 격차를 채우고 병원균과 선천성 면역 / 상피 세포의 상호 작용을 영상화 창을 엽니 다. 이제 이전에 출입 금지 질문의 다양한 범위는 탐험 가능하다. 서로에게 상피 세포 및 그들의 시공간 채용하여 다른 선천성 면역 세포의 상호 작용을 결정하고, C. 수의 자연 알비 칸스 증식 및 비 면역 억제 숙주에서 면역 공격 및 질병 진행에 관련된 형태 학적 전환. 이미지 가능성 GRE에서 일 몇 시간 동안 그대로 호스트세부에서이 시스템의 명백하고 중요한 이점을 나타냅니다.
마지막으로, swimbladder 및 포유 동물의 폐 사이의 존재 론적 및 유전자 발현의 유사성은 더욱 유전자 최저 또는 화학 약물이 기관을 대상으로하는 미생물 - 폐 상호 작용 및 면역학 50-52의 보존 메커니즘을 밝힐 수 있음을 시사한다.
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Acknowledgments
저자는 아낌없이 α-catenin의를 제공하기 위해 박사 르 트린 박사 토빈 감사 : 황수정 물고기 라인과 빌 잭맨 우리 자신의 실험실에서 촬영을 할 수 있도록합니다. 저자는 자금 출처 국립 보건원 (보조금 5P20RR016463, 8P20GM103423 및 R15AI094406)과 USDA 인정 (프로젝트 # ME0-H-1-00517-13). 이 원고는 주요 농업 및 임업 실험 역 게시 번호 3371로 게시됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Deep Petri dishes | Fisher Scientific | 89107-632 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Yeast Extract | VWR Scientific | 90000-726 | |
| Peptone | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Fine tweezers (Dumont Dumoxel #5) | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Wooden dowels | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Low melt agarose | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Flaming Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Borosilicate capillary | Sutter Instruments | BF120-69-10 | |
| MPPI-3 injection system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Magnetic base | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic Base | |
| Tricaine methane sulfonate | Western Chemical Inc. | MS-222 | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 top SZX-ILLB2-100 base | |
| Confocal microscope | Olympus | IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system | |
| 20X microscope objective | Olympus | UPlanSApo 20x/0.75 | |
| Roller drum | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Glass culture tubes (16 x 150 mm) | VWR Scientific | 60825-435 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| HEPES (Corning) | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Children clay (Play-Doh) | Hasbro | ||
| CaCl2 | Fisher Scientific | C69-500 | |
| Methylene blue | VWR Scientific | VW6276-0 | |
| PTU | Sigma | P7629-10G | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Hemocytometer (Hausser scientific) | VWR Scientific | 15170-172 | |
| Type A immersion oil | Blue Marble Products | 51935 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| Agarose (Lonza) | VWR Scientific | 12001-870 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Fishing wire | Stren | ||
| 96 well imaging plate (Sensoplate) | Greiner Bio-One | 655892 | |
| High vacuum grease (Dow Corning) | VWR Scientific | 59344-055 | |
| Microslide (25 x 75 mm) | VWR Scientific | 48300-025 | |
| Cover slips (18 x 18 mm), No 1.5 | VWR Scientific | 48366-045 | |
| 15 cm Petri dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 32-106 | |
| Glycerol (EMD chemicals) | VWR Scientific | EMGX0185-5 | |
| 24-well culture dish (Olympus plastics) | Genesee Scientific | 25-107 | |
| Weight boats (8.9 cm) | VWR Scientific | 89106-766 |
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