Abstract
荧光分析的目的是作为一种有效的，成本有效的，高通量分析的吞噬作用和其他细胞过程的方法。这种技术可以用在各种细胞类型，包括粘附和非粘附的，以检查各种细胞特性。当研究吞噬作用，荧光技术利用吞噬细胞类型如巨噬细胞，和荧光标记的调理粒子的荧光可以以台盼蓝的存在而熄灭。下面粘附的巨噬细胞的电镀在96孔板中，荧光发色粒子（绿或红）施用和允许细胞吞噬对于不同量的时间。以下荧光体颗粒的内在化，细胞用台盼蓝，这有利于荧光信号的消光从其中不内化，或仅仅是附着于细胞表面的细菌。继锥虫洗涤，将细胞用PBS洗涤，固定，一次用DAPI染色（蓝色核荧光标记），其用于标记细胞的细胞核。通过板的核（蓝）读取或颗粒的简单荧光定量（红/绿）荧光我们可以检查的绿色相对荧光单位的比例：蓝色和确定一个表示每个细胞内在荧光的细菌量的吞噬指数。测定使用96孔的方法和多道移液器用于洗涤的持续时间，从吞噬数据采集结束的结束，是小于45分钟。流式细胞术以类似的方式也可以使用，但荧光的优点是它的高通量，评价与样品最小操纵和每个细胞的荧光强度的快速定量快速方法。类似的策略可以应用到非粘附细胞，活标记的细菌，肌动蛋白聚合，并且基本上任何利用荧光过程。因此，荧光是一种有前途的方法，其成本低，高throughpUT能力的细胞过程的研究。
Introduction
荧光信号的量化已被广泛应用于许多科学的方法，从PCR检测，流式细胞术，激光共聚焦显微镜和FRET分析复ELISA分析。荧光成像和定量有着广泛的应用，并且可针对各种细胞过程的定量分析的一大利器。使用的荧光标记物和它们的信号已经彻底改变了在过去十年中，并且荧光板阅读器的出现促进了荧光期间的细胞过程发出的光的高通量定量。
荧光分析可以作为吞噬量化一个伟大的工具。由于吞噬细胞的发现通过Metchnikoff在1800 1吞噬了研究。多年来，各种方法已被用于研究这个重要过程抵御入侵细菌，病毒，真菌和寄生虫病原体2-5先天免疫防御必需。量化利用显微镜和体视技术，以以前的方法以可视化的细胞被吞噬，然后将其通过计算内化颗粒（手动或使用利用软件）6-8的定量。一些缺点单独使用显微镜进行定量分析是细菌人工计数是劳动密集，更容易观察偏见。在吞噬的量化使用的另一种方法是从细胞裂解物（以下吞噬）上的细菌培养板细菌电镀的微生物技术，但这种方法可能会失败占杀菌机制和部分内在的细菌的存在。相比显微镜此方法甚至更多的劳动密集和需要几天的时间来分析。流式细胞术似乎是量化吞噬的最快，最有效的方法，并已用于通过许多组9-11，但成本高，通常与在相关联的所需的分析仪器使得它的最昂贵的方法时，相比于前面提到的测定。
该荧光法是一个很好的替代流式细胞仪粒子内部的分析，因为它提供了用荧光设备偏见的量化，是不是因为成本太高。荧光的其它额外的好处是效率高，高吞吐量能力用于定量荧光的标记的内化的颗粒排出。
荧光的好处是可以外推到比吞噬其它过程定量。例如，荧光分析，可用于研究任何导致肌动蛋白聚合的变化在细胞内或膜结合的受体，改变细胞通透性/生存力，转染效率，以及调制的表达过程。荧光技术的一个缺点是，根据所使用的标签，可能有一个高实验实验变异性可通常通过证明通过相对定量数据，如倍数变化或从控制增加的百分比来解决。
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Protocol
注意：此协议可以如在我们先前发表的作品12使用用于多种应用，如吞噬作用和肌动蛋白聚合的定量。的协议适合于各种变形例， 表1列出的细胞类型和颗粒在过去的研究中成功地使用。规范使用该协议的吞噬作用或肌动蛋白聚合的定量说明了图1。
图1：荧光分析对吞噬作用和肌动蛋白聚合的量化的图后，将细胞铺板，处理，并使其附着，标有绿色荧光素（FITC）的粒子加入到细胞吞噬作用。反应通过锥虫或antibi停止耳部清洗（以排除非内化的颗粒），并固定在4％多聚甲醛进行。细胞随后用红色荧光标记的肌动蛋白（罗丹明鬼笔）和蓝色荧光标记（DAPI）。吞噬作用和肌动蛋白聚合的索引被量化为绿/蓝（FITC / DAPI），或红/蓝（罗丹明/ DAPI）荧光的相对荧光单位的比率。
1.电镀和细胞治疗
注：在开始之前，考虑与至少4技术重复运行的治疗，并包括在板布局以下控件：只有细胞（未染色的，单独或DAPI罗丹明单独）只和粒子。
- 开展1-4在无菌细胞培养罩，以防止样品污染的措施都加入试剂。
- 板的巨噬细胞（鼠J774细胞系）在一个96孔板在1-5×10 4个细胞在50μl（每孔）为辅预热媒体。理想板此方法是黑色的96孔板用透明或黑色的塔底，取决于读者的能力。
- 用于补充培养基，用10％热灭活的FBS，以避免补体级联的干扰，和1％青霉素/链霉素（如果不使用活细菌吞噬作用）。如果使用贴壁细胞允许1-2小时用于粘附，并用于非粘附细胞，降速板与细胞在500×g 10分钟。
- 在50μl中添加期望的激动剂/拮抗剂或车辆控制在2倍浓度（悬浮于PBS或更优选，在补充培养基）为100微升（1×）的最终体积并孵育时间所需量。多道移液器和试剂水库将有利于最快的处理。
2.荧光体颗粒的调理作用
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表1：测试的细胞类型并在荧光分析荧光颗粒吞噬作用和肌动蛋白聚合的表1示出的细胞类型的组合（细胞系和原代细胞），我们的小组通过荧光法使用。除了看吞噬作用和肌动蛋白聚合由野生型细胞中，我们还利用一些这些颗粒用于通过转染的细胞表达GFP（绿色荧光蛋白）检查吞噬。用含有荧光报告质粒的细胞的荧光，也可以用作除了DAPI 表说明一个细胞标记：A -肌动蛋白聚合; P - 吞噬; PT - 吞噬了GFP标记的转染细胞; OPDex - 调理葡聚糖珠; HKOP - 热杀调理。
- 确保荧光颗粒和标签避光在任何时候，杜尔为了防止光致漂白，以及在孵育荷兰国际集团的处理，洗涤
- 对于干颗粒，称出荧光热灭活调理（HKOP）菌（E2861： 大肠杆菌 K-12株），使用制造商的规格。小心确保质量占10：1 - 20：1的细菌：细胞比率（或至少10：1的比率-在吞噬量化常用）13,14。可以由制造商提供，或者经由couting为1mg / ml储备液的连续稀释测定颗粒的数目。
- 悬浮在50微升PBS，涡旋在最高设置1分钟。确保适当的涡流（在这里和在整个协议）作为颗粒倾向于聚集可能影响调理作用的功效。
- 为粒子在悬浮液中，如荧光标记的葡聚糖珠（DEX珠），涡流原液1分钟，取50μl的悬浮液，或根据对在卷D的胎圈浓度珠etermine安装方便10：1珠子：细胞比例。
- 添加opsonizing试剂等体积的粒子，大力旋涡振荡为一分钟。
- 与opsonizing试剂在37℃下1小时孵育颗粒。
- 继温育后，在500×g离心离心颗粒5分钟，并除去含有过量opsonizing试剂的上清。通过加入100微升的PBS洗涤颗粒，涡旋重悬沉淀，并离心5分钟，在500×g下。
- 重复这些步骤两次，以确保正确的调理作用，并除去未结合的抗体。
- 通过重新悬浮它们的5ml培养基（足够一个96孔板）制备调理粒子的工作溶液，并存储避光直到除细胞。
3.吞噬
- 放置颗粒在无菌试剂槽的工作溶液。从这里出发，加5056;升调理粒子在步骤1（对于50毫微克/ ml的终浓度）中制备的细胞，并允许细胞吞噬发生在标准细胞培养条件。下面所示是吞噬的两种方法，可使用该方法（ 图2）来评估。
图2：连续与同步吞噬比较连续吞噬表示颗粒随时间的连续的内化，因为它们慢慢到达细胞上的井的底部。甲对比同步步骤（离心）迫使粒子到沉底，提高与细胞的颗粒接触，并导致立即的内化的细胞。同步吞噬是一个更快的过程，更迅速内化的一部分icles由于增加的细胞：颗粒接触。
- 对于连续吞噬方法（图2），允许细胞以不断吞噬调理细菌作为它们慢慢沉底和进来与细胞接触时，利用较长的时间帧，以允许所述细菌到达井的底部，并获得在与细胞接触。如果进行一个时间过程实验，在不同时间间隔添加细菌和停止反应的整个板的同时，提高处理速度。
- 对于同步吞噬方法（图2），可提高颗粒：通过离心细胞接触，降速含有细胞和颗粒（5分钟，在500×g离心）只要颗粒加入，以促进所有时间点的同步整板和加速粒子：细胞相互作用。
- 测量时间过程完成CENTRI后右起fugation一步。如果导通的时间过程实验，如下所述独立地停止各时间点在不同的时间间隔。
注：同步吞噬方法是与前一个较为费力，但在较短的时间提供了更高的吞噬指数。
4.停止吞噬
- 对于贴壁细胞，除去上清液，并添加50微升稀释台盼蓝的PBS（1:2稀释）中，为了扑灭非内化的细菌的荧光。
- 对于非粘附细胞，降速板并除去上清液。加入50微升稀释台盼蓝。确保到离心机每次洗涤之间的板上于（在500×g离心5-10分钟），以便最大限度地减少细胞的损失和使足够的洗涤。
- 以下锥虫孵育，洗涤细胞2次，用PBS以除去任何残留锥虫（直到PBS除去从井变为清楚）。 TRypan已经显示以猝灭未内在化的荧光标记，热灭活，细菌颗粒的荧光15,16，但不适用于活细菌或OPDex珠。活的细菌，包括使用抗生素，如青霉素，链霉素，庆大霉素或代替的锥虫洗涤，以避免荧光的非内化颗粒混杂影响洗涤。
- 固定的细胞用100μl的4％多聚甲醛，并孵育15分钟，在室温下，然后用PBS（以每孔100μl的每次洗涤）。在此步骤中，保存的细胞在4℃下进行长达一周，或直接进行染色和定量。
注意：所有的后续步骤，形成该点序可以在细胞培养罩的外面来完成。 - 删除所有的液体，并添加50微升的DAPI的重组在PBS 5毫微克/毫升。允许5分钟进行染色，然后用PBS洗两次。在洗涤步骤中，加入50微升PBS至每个孔，并记录吞噬作用。
5.肌动蛋白染色
注意：除了吞噬作用，荧光法将使肌动蛋白聚合的量化通过测定肌动蛋白，这是抑制片状伪足，pseudopodiae期间减少的强度，并且膜皱裂，与抑制剂（ 图1A）处理的结果。这是，如果除了吞噬感兴趣的肌动蛋白聚合的量化可选步骤。如果肌动蛋白聚合是最终目标，使用荧光颗粒吞噬作用是可选的。
- 下列的多聚甲醛固定（ 步骤4.3），用PBS洗涤平板两次，每孔100μl每次洗涤。加50微升0.1％的Triton X-100的PBS透化对孵育在室温-5分钟。
- 用PBS洗出0.1％的Triton X-100的2倍（如上述），并用1％牛血清白蛋白（BSA）20分钟阻断，以避免拉贝的非特异性结合升。
- 封闭后，取出BSA解决方案，并立即加入罗丹明鬼笔。为了制备罗丹明染色的工作溶液中，在5毫升PBS（足够用于一个板）的使用100微升methanoic溶液（由生产商提供）。从工作溶液中添加50微升每孔，并孵育20分钟，在室温下进行。
注：继洗涤步骤和DAPI染色如在步骤4.4的细胞将准备定量。
6.定量
- 用在λ= 355 nm，发射滤波器激发滤光片在λ= 460nm的量化使用荧光板读数器，记录绿色荧光使用激发滤光片在λ= 488 nm和发射滤波器的吞噬在λ= 518纳米，和蓝色荧光。
- 以通过λ= 355纳米和λ= 460nm的（如上），和红色感量化使用荧光板读数器，记录蓝色荧光的肌动蛋白聚合通过激发滤光片orescence在λ= 584 nm，发射滤波器λ= 620纳米。
注：轨道或中心的检测是可以接受的记录。某些类型的细胞收集更多到阱比中心，在这种情况下，轨道记录可以是优势的边缘。特别是，平均大约轨道三个点也可以被用于获得更准确的结果。 - 划分的绿色或红色荧光由蓝色荧光读数（来自DAPI）总RFU，根据粒子标签或吞噬与肌动蛋白定量（ 图1）。由于高的板到板方差，使用相对指标（如相对于T = 0的控制），以最好地说明观察到的趋势，并促进更可靠的统计分析。
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Representative Results
通过使用该协议的量化吞噬作用和随后的肌动蛋白聚合的两种主要方法是观察连续或同步吞噬作用。
显微镜分析（ 图1B）示出了荧光图像媲美什么荧光正在记录（也参见图1）。在图1B是红色荧光的肌动蛋白，绿色荧光268 FITC的标签HKOP E.大肠杆菌 ，核DAPI染色，三个人269的合并后的图像荧光团在一起。这个图像显示有效的吞噬作用，肌动蛋白聚合和非内化颗粒270有效锥虫淬火。
调理和unopsonized颗粒连续吞噬是相当类似如在图2A和C分别看出，其中J774细胞内化的葡聚糖珠。有趣的是，肌动蛋白聚合以下opsonophagocytosis增加，减缓在稍后的时间点（ 图2B），而unopsonized颗粒的肌动蛋白聚合下列内在不增加（ 图2D）。这是很重要的考虑未来的研究研究这些过程，因为调理吞噬导致更大的肌动蛋白聚合比未调理的颗粒内部。既不使用葡聚糖颗粒的吞噬方法导致改变细胞生存力，经由MTT分析（ 图2E）中得到证实。
不像连续增加期间连续吞噬（ 图2）观察到的趋势，调理葡聚糖珠同步吞噬具有钟形的趋势（ 图3A），表示下面的30分钟减少内化。这是可以预料的考虑处理时间和协议的性质。这一趋势也证实了肌动蛋白聚合酶ymerization数据（ 图3B），这些细胞，其中最高的聚合的时间点是在初期的时间变化过程，而在30分钟的聚合返回到基线。尽管更多的劳动力密集的，该方法具有检查吞噬同步后右，因此检查即时吞噬作用的一个值。
图1：吞噬作用和肌动蛋白聚合的共焦显微镜使细胞内化的FITC缀合的OPDex珠（绿色），在20：1的珠子：细胞比例为60分钟，然后细胞用台盼和PBS，固定paraforlmaldehyde，透化与丙酮，和染色用罗丹明鬼笔环肽（红色）F-肌动蛋白，和DAPI（蓝色）。图片说明共聚焦显微镜分析，在60X提供额外的数字放大;（A）白衣Ë棒=10μm的（B）的白条= 50微米。（a）表示以下加成抑制剂在肌动蛋白聚合的变化。箭头指示伪足的形成，箭头表示。 图1A已经被修改Ninkovic和罗伊12膜皱裂变化。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：荧光分析下列连续吞噬 J774巨噬细胞铺板到96孔板中并暴露于葡聚糖珠在不同的时间量，从90，60，45，30和15分钟。珠在不同的时间和对于所有的反应均停止，同时细胞吞噬过程中加入。细胞液用台盼，固定，染色，以及用于调理（A）的与每个（B，D分别）。（E）的 MTT法进行之后立即吞噬在不同相关吞噬作用或unopsonized（C）的葡聚糖颗粒和肌动蛋白聚合分析的时间点。这个数字已经被修改Ninkovic和罗伊12。
图3：荧光分析下列同步吞噬 FITC标记OPDex珠粒加入到接种在96孔板在10 4个细胞的细胞密度/孔J774小鼠巨噬细胞。 30分钟温育之后将板离心，在500×g离心5分钟。吞噬作用被停止一次一个，在x轴通过锥虫洗涤，随后PBS洗涤，低聚甲醛fixati指出的时间点在和肌动蛋白染色。这个数字已经被修改Ninkovic和罗伊12。
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Discussion
所述荧光技术的主要限制是实验方差以及与广泛洗涤和使用非粘附细胞的细胞相关的损失。
方差很大程度上观察到由于在荧光发色粒子作为制备储液的过程中称重和分注的变化不保持从实验的颗粒进行实验的相同数量的精确方式。为了解决实验之间方差的问题，数据可以表示为相对术语，例如，作为％吞噬作用或折叠从控制变更（控制 - T = 0;加入和除去颗粒立即）。这种形式的分析，产生重复的趋势，吞噬％，从控制值是实验实验相似。这种数据的分析将促进与3-6实验重复统计意义。荧光技术可以用来有效地检查和重现观察到的趋势ðespite其变异，如果利用充足的数据分析。与掌握的技术中，有可能为一个单一的科学家运行约6 96孔板，或在一天600治疗。
信元丢失已经结合非粘附细胞类型的研究已在很大程度上观察到。贴壁细胞类型是最好的方法来使用，如这一个，因为他们可以承受的众多和广泛的清洗步骤。
应采取的主要关键步骤，以保持荧光成分远离光线直射，避免光漂白。颗粒，标签，和含有每个或所有部件的板应保存在暗（或简单地包裹在铝箔）。另一必要成分是的技术重复的板内的重要性。由于高井井方差是必不可少的移液前混合所有试剂非常好，并具有每治疗6-8技术重复（相当于1行），以米OST准确地观察数据的趋势。
额外的考虑因素的使用盘格式，如这些重要，是该板孔包含一个相对较小体积的试剂和往往容易蒸发。如果治疗是超过24小时，最好是要使用的板的周边孔（行和列旁边的边缘）含有单独的PBS，以充当加湿器和降低细胞培养基和激动剂的蒸发。
这种技术是相当简单的掌握和所涉及的故障是最小的。选择用于该研究的权利吞噬方法和边洗（尤其是在使用非粘附细胞时），以避免细胞的损失要小心是很重要的。
所述荧光技术的重大意义在于，它提供了一个高通量方法的荧光颗粒内化，或肌动蛋白聚合的筛选。大多数吨使用最新的echniques如显微镜或微生物是更多的劳动力密集，耗费更多的时间的比较。流式细胞仪采用非常相似原理为荧光，但需要时间来量化比较，通过荧光需要几分钟。因此，荧光法是一种很好的替代吞噬量化主要是由于它的高通量能力的电流的方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
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