Abstract
Цель флуорометрического анализа, чтобы служить в качестве эффективного, экономически эффективным, высокой метода пропускной анализа фагоцитоз и другие клеточные процессы. Этот метод может быть использован на различных типах клеток, как адгезивные и не адгезивные, чтобы изучить различные клеточные свойства. При изучении фагоцитоза, флюорометрический техника использует фагоцитарных типов клеток, таких как макрофаги и флуоресцентно меченых частиц, опсонизированных флуоресценции может быть погашен в присутствии трипанового синего. После обшивки адгезивных макрофагов в 96-луночных планшетах, флуоресцентных частиц (зеленый или красный) и вводят клетки позволили фагоцитируют для различных количеств времени. После интернализации люминесцентных частиц, клетки промывают трипановым синим, что облегчает исчезновение флуоресцентного сигнала от бактерий, которые не интернализированных, или просто прилипших к поверхности клетки. После промывки трипанового, клетки промывают PBS с фиксированной,й окрашивали DAPI (ядерная Blue Label люминесцентные), который служит для обозначения ядра клеток. Простым флуорометрического количественного через пластины чтения ядерной (синий) или частицы (красный / зеленый) флуоресценции можно рассмотреть соотношение количества относительных флуоресценции единиц зеленый: синий и определить фагоцитарную индекс, указывающий на количество люминесцентных бактерий интернализованных на ячейку. Продолжительность анализа с использованием 96-луночного метод и многоканальные пипетки для стирки, от конца до конца фагоцитоза сбора данных, меньше, чем 45 мин. Проточная цитометрия может быть использован таким же образом, но преимущество флуорометрии является его высокая пропускная способность, быстрый метод оценки с минимальным манипуляции образцов и быстрого количественного определения интенсивности флуоресценции на клетку. Аналогичные стратегии могут быть применены к не прилипшие клетки, живые меченых бактерий, полимеризации актина и, по существу любой процесс с использованием флуоресценции. Таким образом, флюометрия является перспективным методом его низкой стоимости, высокой throughpут возможности в изучении клеточных процессов.
Introduction
Количественное определение флуоресцентного сигнала широко используются во множестве научных методов, начиная от ПЦР, проточной цитометрии, конфокальной микроскопии и FRET анализ ELISA для мультиплексирования. Флуоресценции изображений и количественное имеет широкое применение и могут быть отличным инструментом для количественного анализа различных клеточных процессов. Использование флуоресцентных маркеров и их сигнал был революцию в последнее десятилетие, и появление люминесцентных читателей плит способствовало высокой пропускной количественного флуоресценции, испускаемого при клеточных процессов.
Флуорометрический анализ может служить отличным инструментом в количественной фагоцитоза. Фагоцитоз был изучен с момента открытия фагоцитов по Мечников в 1800 1. На протяжении многих лет, различные методы были использованы для изучения этого важного процесса важное значение для иммунной защиты против вторжения бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных патогенов 2-5, Предыдущие методы количественного используется микроскопии и стереологических методов для того, чтобы визуализировать клетки, которые phagocytosing, которые затем были количественно путем подсчета интернализованных частиц (вручную или с использованием программного обеспечения) 6-8. Некоторые недостатки использования микроскопа сами по себе для количественного анализа является то, что ручного подсчета бактерий является трудоемким и более склонны к предвзятости наблюдателя. Другой метод, используемый в количественного фагоцитоза является микробиологическое методика обшивки бактерий из клеточных лизатов (следующих фагоцитоза) на бактериальной культуры пластин, но этот метод может не учитывать бактерицидных механизмов и наличием частично интернализированных бактерий. Этот метод еще более трудоемким по сравнению с микроскопией и занимает несколько дней, чтобы анализировать. Проточной цитометрии, кажется, самый быстрый, самый эффективный способ количественного фагоцитоза и была использована многими группами 9-11, но высокая стоимость обычно ассоциируется с инструмент, необходимые для их анализа делает наиболее дорогой метод по сравнению с ранее упомянутых анализов.
Флуорометрический метод хорошей альтернативой проточной цитометрии для анализа интернализации частиц, так как он предлагает объективную количественную оценку флуоресценции с использованием оборудования, которое не так препятствующая стоимость. Другие дополнительные преимущества флуорометрии являются высокая эффективность и высокие возможности пропускную способность для количественной оценки флуоресценции мечеными интернализованных частиц.
Преимущества флуорометрии могут быть экстраполированы на количественной оценки других, чем фагоцитоза процессов. Например, флуорометрического анализа могут быть применены для изучения любой процесс, приводящий к изменениям в экспрессии внутриклеточной или мембраносвязанных рецепторов, изменений в клеточной проницаемости / жизнеспособности, трансфекции эффективности и модуляции в полимеризации актина. Один недостаток флуорометрического техники является то, что, в зависимости от меток, используемых, может быть высокойэксперимента к эксперименту изменчивость, которая, как правило, могут быть решены путем демонстрации данных через относительные количественного, таких как изменение раза или увеличения от контроля процентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Этот протокол может быть использован для различных приложений, таких как количественного фагоцитоза и полимеризации актина, используемый в нашей ранее опубликованной работе 12. Протокол поддается различных модификаций и типов В таблице 1 приведены клеточные частицы и успешно использованы в предыдущих исследованиях. Стандартный использование этого протокола для количественной оценки фагоцитоза или полимеризации актина показано на рисунке 1.
Схема 1:. Схема флуорометрического анализа для количественной оценки фагоцитоза и полимеризации актина После того как клетки высевают, обрабатывают и дают возможность прилипать частицы, меченные зеленой флуоресценции (FITC) добавляют к клеткам для фагоцитоза. Реакцию останавливают трипановый или antibiушные промывки (для устранения не-усвоены частицы) и фиксация осуществляется с помощью 4% параформальдегида. Клетки затем окрашивают красного флуоресцентного актина метки (родамин фаллоидином) и голубой флуоресцентной метки (DAPI). Индексы фагоцитоза и полимеризации актина количественно как отношение относительных флуоресценции единиц зеленый / синий (FITC / DAPI), или красный / синий (родамин / DAPI) флуоресценции.
1. Покрытие и обработки клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом Рекомендуется использовать процедуры, по крайней мере, 4 технических повторов, и включают в себя следующие элементы в макете пластины: только клетки (неокрашенные, с только DAPI или родамин только) и частицы только.
- Провести все добавление реагентов в стадии 1-4, в стерильной капот культуре клеток с целью защиты образцов от загрязнения.
- Пластинчатые макрофаги (мышиный линии клеток J774) в 96-луночный планшет при 1-5 х 10 4 клеток в 50 мкл (на лунку) из дополнить подогретого СМИ. Идеальное пластины для этого метода являются черные 96-луночные планшеты с прозрачным или черным дном, в зависимости от возможностей читателя.
- Для дополненных массовой информации, использовать 10% инактивированной нагреванием FBS, чтобы избежать вмешательства каскада комплемента, и 1% пенициллина / стрептомицина (если не используется живые бактерии для фагоцитоза). Если с помощью адгезивные клетки позволяют 1-2 ч для адгезии, и для не-адгезивных клеток, спин вниз пластины с клетками в течение 10 мин при 500 х г.
- Добавить желаемых агонисты / антагонисты или управления транспортным средством при концентрации 2 × (ресуспендировали в PBS или, более предпочтительно, в средствах массовой информации, дополненной) в 50 мкл до конечного объема 100 мкл (1x) и инкубируют в течение желаемого периода времени. Многоканальные пипетки и реагентов водохранилища будет способствовать быструю обработку.
2. Опсонизация флуоресцентных частиц
ftp_upload / 52195 / 52195table1.jpg "ширина =" 500 "/>
Таблица 1: Проверено типы клеток и флуоресцентных частиц в флуорометрического анализе того, что наша группа использовала через флуорометрического методом фагоцитоза и полимеризации актина Таблица 1 иллюстрирует комбинации типов клеток (клеточных линий и первичных клеток).. Кроме глядя на фагоцитоз и полимеризации актина по клеток дикого типа, мы также использовали некоторые из этих частиц для исследования фагоцитоза трансфицированных клеток, экспрессирующих GFP (зеленого флуоресцентного белка). Флуоресценции клеток, трансфицированных плазмидами, содержащими флуоресцентные репортеров также может быть использован как сотовый маркера в дополнение к таблице DAPI легенды.: A - актина полимеризации; P - фагоцитоз; PT - фагоцитоз GFP помечены трансфекции клеток; OPDex - опсонизированным декстран шарик; HKOP - тепло убитых опсонизированным.
- Убедитесь, что флуоресцентные частицы и этикетки защищенном от света месте в любое время, дурьчисле обработку, промывку, а также во время инкубации, чтобы предотвратить фотообесцвечивания
- Для сухих частиц, взвесить люминесцентных тепла убитых опсонированных (HKOP) бактерии (E2861: Е.coli К-12 штамма), используя спецификации производителя. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что массовые счета для 10: 1 - 20: 1 бактерий: соотношение клеток (или, по крайней мере, соотношение 10: 1 - широко используется в количественного фагоцитоза) 13,14. Число частиц может быть обеспечено производителем или определено с помощью couting серийных разведений 1 мг / мл маточного раствора.
- Ресуспендируют в 50 мкл PBS и вихревые течение 1 минуты при высокой установке. Обеспечить надлежащее вихревание (здесь и далее Протокол), поскольку частицы, как правило, агрегат, который может повлиять на эффективность опсонизации.
- Для частиц в суспензии, такие как декстран флуоресцентно меченных бусы (DEX) бисер, вихревое раствор в течение 1 мин, принимают по 50 мкл суспензии или в зависимости от концентрации борта в том Determine крепление из бисера для облегчения 10: 1 шарик: соотношение клеток.
- Добавить равный объем реагента на opsonizing к частицам и энергично вихрь еще минуту.
- Инкубируйте частицы opsonizing реагента при 37 ° С в течение 1 часа.
- После инкубации центрифуги частицы в течение 5 мин при 500 мкг, и удалить супернатант, содержащий избыток opsonizing реагента. Промыть частицы путем добавления 100 мкл PBS, вихря, чтобы ресуспендируют осадок и центрифугат в течение 5 мин при 500 х г.
- Повторите указанные действия два раза, чтобы обеспечить правильное опсонизации и удаление несвязанного антитела.
- Подготовьте рабочий раствор опсонированных частиц путем ресуспендирования их в 5 мл среды (достаточно для одного 96-луночного планшета) и не хранить в защищенном от света, пока дополнение к клеткам.
3. Фагоцитоз
- Поместите рабочего раствора частиц в стерильном резервуаре реагента. Отсюда, добавить 5056; л опсонированных частиц к клеткам, полученного на стадии 1 (по конечной концентрации 50 нг / мл), и позволяют фагоцитоза происходит при стандартных условиях культивирования клеток. Ниже показаны два способа фагоцитоза, которые могут быть оценены с помощью этого метода (Диаграмма 2).
Схема 2:. Сравнение непрерывного сравнению синхронизации фагоцитоза непрерывной фагоцитоза показывает непрерывное интернализации частиц с течением времени, как они медленно достигают клеток на дне колодца. Контрастные шаг синхронизации (центрифугирования) заставляет частицы оседают на дно, повышение контакта частиц с клетки и приводит к немедленному интернализации клетками. Синхронное фагоцитоз быстрее процесс, который быстрее усваивает частьicles в связи с увеличением клеток: контакт частиц.
- Для непрерывного метода фагоцитоза (Диаграмма 2), которые позволяют клетки постоянно фагоцитировать опсонированных бактерии, как они медленно опускаются на дно и входят в контакт с клетками, использовать более длинные временные рамки, чтобы для бактерий, чтобы достичь дна скважины и получить в связь с клетками. Если проведение эксперимента timecourse, добавить бактерии в различные интервалы времени и остановить всю тарелку реакций, в то же время, чтобы повысить скорость обработки.
- Для синхронизированного метода фагоцитоза (Диаграмма 2), что повышает частиц: клеток контакте через центрифугирования, спин вниз весь пластину, содержащую клетки и частицы (5 мин при 500 мкг), как только частицы добавляют для облегчения синхронизации всех временных точках и чтобы ускорить частицы: взаимодействие клеток.
- Измерение временной ход, начиная сразу после завершения Centrifugation шаг. Если проведение эксперимента курс времени, остановить каждый момент времени независимо друг от друга в разные промежутки времени, как описано ниже.
ПРИМЕЧАНИЕ: синхронизированные методы фагоцитоз является несколько более трудоемкий от предыдущего, но обеспечивает более высокую фагоцитарную индекс в более короткие сроки.
4. Остановка Фагоцитоз
- Для адгезивных клеток, удалить супернатант и добавить 50 мкл разбавленного трипанового синего с PBS (1: 2) разбавления, для того, чтобы погасить флуоресценции не-усвоены бактерий.
- Для не прилипшие клетки, спина вниз пластины и удалить супернатант. Добавить 50 мкл разведенной трипанового синего. Убедитесь, центрифугировать планшет при (5-10 мин при 500 мкг) между каждой стирки для того, чтобы свести к минимуму потерю клеток и обеспечить надлежащее мытье.
- После трипановый инкубации, мыть клетки в два раза с PBS, чтобы удалить остатки Трипановый (до PBS не будет удален из хорошо получается прозрачный). Трypan было показано, чтобы утолить флуоресценции 15,16 не-интернализованных флуоресцентную метку, тепла убит, бактериальных частиц, но не для живых бактерий или шарики OPDex. Для живых бактерий, включают в себя мытье с антибиотиками, такими как пенициллин, стрептомицин, или гентамицин вместо трипана мытья, чтобы избежать смешанное воздействие флуоресценции от не-усвоены частиц.
- Исправить клеток 100 мкл 4% параформальдегида и инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, затем промыть ЗФР (в 100 мкл на лунку для каждой промывки). На этом этапе, сохраните клетки при 4 ° С в течение одной недели, или перейти непосредственно к окрашиванию и количественного определения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги образуют эта точка предисловие может быть сделано за пределами капот культуре клеток. - Удалить все жидкости и добавить 50 мкл DAPI в 5 нг / мл восстанавливали в PBS. Разрешить 5 мин для окрашивания, а затем дважды промывали PBS. После стадии промывки, добавить 50 мкл PBS в каждую лунку и рекордно фагоцитоза.
5. актина Окрашивание
Примечание: В дополнение к фагоцитозу, флюорометрический Способ позволит количественное полимеризации актина путем измерения интенсивности актин, который снижается во время торможения, ламеллиподий pseudopodiae и мембраны растрепав в результате обработки с ингибитором (фиг.1А). Это необязательный шаг Если Вы заинтересованы в количественной полимеризации актина в дополнение к фагоцитозу. Если полимеризации актина является конечной целью, с использованием флуоресцентных частиц для фагоцитоза является обязательным.
- После фиксацией параформальдегидом (шаг 4,3), промыть пластины дважды PBS в 100 мкл на лунку для каждой промывки. Добавить 50 мкл 0,1% Тритона Х-100 в ЗФР в течение проницаемости и инкубировать в течение -5 мин при комнатной температуре.
- Промыть 0,1% Тритон Х-100 2 раза PBS (как описано выше), и блокируют 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 20 мин, чтобы избежать неспецифического связывания из Лабел.
- После блокирования удаления раствора BSA и сразу же добавить родамин фаллоидина. Для приготовления рабочего раствора родамина пятна, используйте 100 мкл метановый раствора (представленной изготовителем) в 5 мл PBS (достаточной для одной пластины). Из рабочего раствора добавить 50 мкл на лунку и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги стиральные и окрашивание DAPI, как в шаге 4,4 клетки будут готовы к количественной оценке.
6. Количественное
- Для количественной оценки фагоцитоза с использованием флуоресцентного планшет-ридер, запись зеленой флуоресценции с помощью фильтра возбуждения на λ = 488 нм и фильтр эмиссии на λ = 518 нм, и синей флуоресценции с помощью фильтра возбуждения на λ = 355 нм и фильтр эмиссии на λ = 460 нм.
- Для количественной оценки полимеризацию актина с помощью флуоресцентного планшет-ридер, запись голубой флуоресценции с помощью λ = 355 нм и λ = 460 нм (как указано выше), и красный гриппаценции с помощью фильтра возбуждения на λ = 584 нм и фильтра излучения λ = 620 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Орбитальная или центральная обнаружения является приемлемым для записи. Некоторые типы клеток собрать больше к краю колодца, чем в центре, и в этом случае орбитальной записи может быть предпочтительным. В частности, среднее значение трех точках по всему орбите также могут быть использованы, чтобы получить более точные результаты. - Разделите общее РФС зеленого или красного флуоресценции синей флуоресценции для вывода (от DAPI), в зависимости от метки частиц или фагоцитарной против актина количественного (Диаграмма 1). Из-за высокой дисперсии пластины к планшету, использовать относительные показатели (например, по отношению к Т = 0 контроль), лучше всего иллюстрируют тенденции, наблюдаемые и содействовать более надежной статистического анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Два основных способа количественного фагоцитоз и последующее полимеризацию актина посредством использования этого протокола состоит в наблюдении непрерывного или синхронизированный фагоцитоз.
Микроскопический анализ (рис 1B) иллюстрирует флуоресцентные изображения, сравнимые с тем, что записи флуорометр (также см Диаграмму 1). На рисунке 1В красной флуоресценции актина, зеленый 268 флуоресценция FITC этикетки HKOP Е. палочка, ядерная DAPI пятно, и объединенный образ все три 269 Флуорофоры вместе. Это изображение показывает эффективную фагоцитоз, полимеризацию актина и 270 эффективного трипановый тушение не-усвоены частиц.
Непрерывная фагоцитоз опсонированных и unopsonized частиц вполне сопоставима, как показано на рисунке 2А и С соответственно, где J774 клетки интернализации декстрановые бусы. Интересно, что полимеризация актина после opsonophagocytosis возрастает, замедление в более поздних временных точках (фиг.2В), в то время как полимеризация актина следующие интернализации unopsonized частиц не увеличивается (рисунок 2, г). Это важно учитывать для будущих исследований по изучению этих процессов, так как opsonophagocytosis приводит к гораздо большей полимеризации актина, чем интернализации частиц, которые не опсонированных. Ни один из методов, использующих фагоцитирующих декстран частиц приводит к изменениям в жизнеспособности клеток, как было подтверждено с помощью анализа МТТ (фиг 2Е).
В отличие от постоянно растет тенденций, наблюдаемых в процессе непрерывного фагоцитоза (рис 2), синхронизированный фагоцитоз опсонированных декстрана бисером имеет форму колокола тренд (рис 3A), демонстрируя снижение интернализации следующий 30 мин. Это следовало ожидать с учетом времени обработки и природы протокола. Эта тенденция подтверждается также актина PolДанные ymerization (рис 3b) этих клеток, где самая высокая точка время полимеризации на ранней стадии timecourse, в то время как в 30 возвращается мин полимеризации от исходного уровня. Хотя более трудоемким, этот метод имеет значение изучения фагоцитоза сразу после синхронизации, следовательно, рассматривать непосредственные фагоцитарных эффекты.
Рисунок 1:. Конфокальной микроскопии фагоцитоза и полимеризации актина Клетки разрешено интернализации FITC конъюгированной OPDex шарик (зеленый) при 20: 1 шарик: соотношение клеток в течение 60 мин, затем клетки промывали PBS и трипановым, фиксировали paraforlmaldehyde, permeabilised с ацетон, и окрашивают в течение Ф-актина с использованием родамина фаллоидина (красный), и DAPI (синий). Изображения показывают конфокальной микроскопический анализ на 60X с дополнительным цифровым увеличением; () ничутье бар = 10 мкм (Б) белая полоса = 50 мкм. (А) иллюстрирует изменения в полимеризации актина следующие добавлением ингибитора. Наконечники указывают на образование псевдоподий, а стрелки указывают на изменения мембранного рассердило. 1А которые были изменены с Нинкович и Рой 12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: флуорометрического анализа. После непрерывной фагоцитоза мышиных макрофагов J774 высевали на 96-луночный планшет и подвергали воздействию декстрана шариков в различные количества времени, начиная с 90, 60, 45, 30 и 15 мин. Бусины были добавлены в различные моменты времени и фагоцитарных процессов все реакции были остановлены, в то же время. Ячейкипромывали трипановым, фиксированной, окрашивали и анализировали на фагоцитоза опсонизированного (а) или unopsonized (C) декстрана частиц и полимеризации актина, связанного с каждым (B, D, соответственно). (Е) МТТ-анализ проводили сразу после фагоцитоза при разных моменты времени. Эта цифра была изменена с Нинкович и Рой 12.
Рисунок 3:. Флуорометрического анализа следующие синхронизированного фагоцитоза меченное ФИТЦ шарики OPDex были добавлены J774 мышиный макрофагов клеток высевали в 96-луночные планшеты при плотности клеток 4 10 клетки / лунку. После 30 мин инкубации планшет центрифугировали при 500 х г в течение 5 мин. Фагоцитоз был остановлен по одному, в моменты времени, указанных в х-оси на трипана стирки, а затем PBS стирок, параформальдегидом fixatiна и окрашивание актина. Эта цифра была изменена с Нинкович и Рой 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основные ограничения флуорометрического техники являются экспериментальными дисперсия, а также потеря клеток, связанная с тщательной промывки и использования не прилипшие клетки.
Разница наблюдается в основном за счет изменения флуоресцентных частиц, как взвешивание и пипетки во время подготовки исходного раствора не точный способ поддержания одинаковых числа частиц от эксперимента к эксперименту. Для решения этой проблемы расхождений в экспериментах, данные могут быть выражены в относительных терминах, например, в виде% фагоцитоза или сбросить переход от контроля (управления - Т = 0, добавлена частицы и удаляются немедленно). Эта форма анализа генерирует воспроизводимые тенденции, а значения% фагоцитоза из-под контроля похож от эксперимента к эксперименту. Этот вид анализа данных будет способствовать статистической значимости с 3-6 экспериментальных повторов. Флуорометрический методика может быть использована для эффективной изучить и воспроизвести наблюдаемые тенденции DЕСМОТРЯ его изменчивости, если использование адекватного анализа данных. С освоением техники это возможно для одного ученого, чтобы запустить около шести 96-луночные планшеты или 600 процедур в день.
Потерю клеток в значительной степени наблюдалось в исследованиях с неприлипающими типов клеток. Прикрепленные типы клеток лучше всего использовать в таких методов, как этот, потому что они могут выдержать многочисленные и уже трудоемкой процедуры промывки.
Основные критические шаги должны быть предприняты, чтобы сохранить флуоресцентные компоненты от прямого света, чтобы избежать фото отбеливание. Частицы, этикетки и табличка с указанием каждого или все компоненты должны храниться в темноте (или просто заворачивают в алюминиевую фольгу). Другим важным компонентом является важность технических повторов в тарелку. В связи с высокой и хорошо дисперсии очень важно, чтобы смешать все реагенты хорошо перед отбором и иметь 6-8 технических дубликатов на лечение (что эквивалентно одной строке), для того, чтобы тOST точно наблюдаем тенденции в данных.
Дополнительные сведения, важные для использования форматов пластин, таких как они, в том, что пластина скважины содержат относительно малые объемы реагентов и часто подвержены испарению. Если процедуры больше, чем 24 ч, желательно использовать периферийные лунки планшета (строк и столбцов рядом с краем), содержащий PBS один, для того, чтобы служить в качестве увлажнителей и уменьшить испарение клеточной культуральной среде и агонистов.
Этот метод достаточно прост в освоении и устранение неисправностей участие является минимальным. Важно правильно выбрать фагоцитарную метод изучения и будьте осторожны при мытье (особенно при использовании неадгезированных клетки) для того, чтобы избежать потери клеток.
Важное значение в флуорометрического техники является то, что оно обеспечивает способ с высокой пропускной для скрининга флуоресцентного интернализации частиц или полимеризации актина. Большинство тechniques используемые на сегодняшний день, такие как микроскопия или микробиологии более трудоемким и больше времени в сравнении. Проточная цитометрия использует очень похожие принципы, как флуорометрии, но занимает несколько часов, чтобы количественно по сравнению с минут, необходимых флуорометрии. Таким образом, флуорометрический метод хорошей альтернативой современных методов фагоцитарной количественного многом благодаря своим возможностям с высокой пропускной способностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50 μl of PBS and combine with 50 μl opsonizing reagent for 30 min at 37 °C before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| The items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers: | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/streptomycin; warm in 37 °C before use | |
| Fluorescent plate reader - Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96-well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom - black plates |
| Multichannel pipette (8 - 12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. Janeway's Immunobiology. , 8th edn, Garland Science. New York, NY. (2012).
- Burke, D. W., O'Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
