טכניקת התפוקה Fluorometric גבוהה להערכה של מקרופאג phagocytosis ויקטין פלמור

Summary

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Abstract

המטרה של ניתוח fluorometric היא לשמש ככלי עזר יעילים, חסכוני, תפוקה גבוהה של ניתוח phagocytosis ותהליכים תאיים אחרים. טכניקה זו ניתן להשתמש במגוון רחב של סוגי תאים, שני חסיד ולא חסיד, לבחון מגוון רחב של תכונות הסלולר. כאשר לומדים phagocytosis, טכניקת fluorometric מנצלת סוגי תאי phagocytic כגון מקרופאגים, וחלקיקי opsonized שכותרתו fluorescently הקרינה שיכולים להיות כבוי בנוכחות trypan הכחולה. בעקבות ציפוי של מקרופאגים חסיד ב96-גם צלחות, חלקיקי ניאון (ירוק או אדום) מנוהלים ותאים מותר phagocytose לכמויות שונות של זמן. בעקבות הפנמה של חלקיקי ניאון, תאים נשטפים עם trypan כחול, המאפשר הכחדה של אות ניאון מחיידקים אשר לא הפנימו, או שהם רק הקפדה על פני התא. בעקבות לשטוף trypan, תאים נשטפים עם PBS, קבועה,nd מגואלות DAPI (תווית ניאון כחולה גרעינית), המשמש לסימון גרעינים של תאים. על ידי כימות fluorometric פשוט באמצעות קריאת צלחת גרעינית (כחולה) או חלקיקי הקרינה (אדום / ירוקה) אנחנו יכולים לבחון את היחס של יחידות יחסית הקרינה של ירוק: כחולות ולקבוע מדד phagocytic מעיד על כמות חיידקי ניאון הפנימו לכל תא. משך assay באמצעות טפטפות שיטה ורבות ערוצים 96-גם לשטיפה, מסוף phagocytosis לסיים רכישת נתונים, הוא פחות מ 45 דקות. Cytometry זרימה יכולה לשמש באופן דומה, אך היתרון של fluorometry הוא התפוקה הגבוהה שלה, שיטה מהירה של הערכה עם מניפולציה מינימאלית של דגימות וכימות מהיר של עוצמת ניאון לכל תא. ניתן ליישם אסטרטגיות דומות לתאים שאינם חסיד, שכותרתו חיידקים חי, פילמור אקטין, ובעצם כל תהליך ניצול הקרינה. לכן, fluorometry היא שיטה מבטיחה עבור העלות נמוכה, הגבוה throughpיכולות ut במחקר של תהליכים תאיים.

Introduction

כימות של אות ניאון כבר בשימוש נרחב במגוון רחב של שיטות מדעיות החל PCR, cytometry זרימה, מיקרוסקופיה confocal, וסריג ניתוח זמנית ELISA. יש הדמיה הקרינה וכימות יישום רחב והוא יכול להיות כלי נהדר לניתוח כמותי של תהליכים תאיים שונים. שימוש בסמני ניאון והאות שלהם כבר מהפכה בעשור האחרון, והופעתה של קוראי צלחת ניאון יש להקל כימות תפוקה הגבוה של הקרינה הנפלטת במהלך תהליכים תאיים.

ניתוח Fluorometric יכול לשמש כלי נהדר בכימות של phagocytosis. Phagocytosis נחקר מאז גילוי phagocytes ידי Metchnikoff בשנת 1800 ^1. במהלך השנים, במגוון שיטות כבר נוצל כדי לבחון תהליך חשוב זה חיוני להגנה חיסונית מולדת נגד פלישת חיידקים, נגיפיות, פטריות וטפילות פתוגנים ^2-5. שיטות קודמות של מיקרוסקופיה כימות מנוצל וטכניקות stereological כדי להמחיש תאים הphagocytosing, שהיו לכמת אז על ידי ספירה של חלקיקים הפנימו (ידני או עם שימוש בתוכנה) ^6-8. חסרונות מסוימים לבאמצעות מיקרוסקופ לבד לניתוח כמותי הם שספירה ידנית של חיידקים היא עבודה אינטנסיבית ונוטה יותר להטית משקיף. שיטה נוספת המשמשת בכימות של phagocytosis היא טכניקת המיקרוביולוגית של ציפוי של חיידקים מהתא lysates (להלן phagocytosis) על צלחות תרבית חיידקים, אך שיטה זו יכולה להיכשל לתת דין וחשבון למנגנונים ונוכחות של חיידקים הפנימו באופן חלקי bactericidal. שיטה זו היא עוד יותר עבודה אינטנסיבית בהשוואה למיקרוסקופיה ולוקחת כמה ימים כדי לנתח. נראה cytometry זרימה להיות דרך המהירה והיעילה ביותר לכימות phagocytosis ונוצל על ידי קבוצות רבות ^9-11, אבל העלות הגבוהה נפוצה הקשורים במחוונים דרושים לניתוח עושה את זה בשיטה יקרה ביותר בהשוואה למבחנים שהוזכרו קודם לכן.

שיטת fluorometric היא אלטרנטיבה טובה לcytometry זרימה לניתוח של הפנמת חלקיקים שכן הוא מציע כימות משוחד של ציוד הקרינה באמצעות שאינו כעלותו. יתרונות נוספים אחרים של fluorometry הם יעילות גבוהה, ויכולות תפוקה גבוהות לכימות הקרינה הנפלטת על ידי שכותרתו החלקיקים הפנימו.

יתרונות של fluorometry ניתן להסיק לכימות של תהליכים אחרים מאשר phagocytosis. לדוגמא, ניתוח fluorometric ניתן ליישם ללמוד כל תהליך מוביל לשינויים בביטוי של תאית או קולטני קרום הנכנס, שינויים בתא חדירות / כדאיות, יעילות transfection, ואפנון בפילמור אקטין. חיסרון אחד של טכניקת fluorometric הוא ש, בהתאם לתוויות שימוש, ייתכנו גבוהניסוי לניסוי שונות אשר בדרך כלל ניתן לפתור על ידי הוכחת נתונים באמצעות כימות יחסי, כגון שינוי קיפול או עליית אחוזים מהשליטה.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש עבור יישומים רבים כגון כימות של פילמור phagocytosis ויקטין הכמשמש בעבודה שפורסמה בעבר שלנו 12. הפרוטוקול משאיל את עצמו למגוון רחב של שינוי, וסוגי תאי טבלה 1 וחלקיקים נוצלו בהצלחה בלימודים האחרונים. שימוש סטנדרטי של פרוטוקול זה לכימ…

Representative Results

שתי דרכים עיקריות לכימות phagocytosis ופילמור אקטין לאחר מכן באמצעות פרוטוקול זה היא להתבונן phagocytosis רציף או מסונכרן. ניתוח מיקרוסקופי (איור 1) מדגים תמונות ניאון דומות למה שfluorometer הוא ההקלטה (ראה גם תרשים 1). באיור 1 הן ?…

Discussion

מגבלות עיקריות של טכניקת fluorometric הן שונות ניסיוני כמו גם אובדן תא הקשורים לכביסה ושימוש בתאים שאינם חסיד נרחבים.

שונות הוא ציינה בעיקר בשל השינוי בחלקיקי ניאון כמו המשקל וpipetting במהלך תקופת ההכנה של מניות הפתרון הוא לא דרך של שמירה…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Opsonizing reagent	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers
RPMI Cell growth media	Gibco		Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use
Fluorescent plate reader-Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	dilute to 4% before use
96 well plates	Greiner	655097	clear or black or clear bottom – black plates
Multichannel pipette (8-12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)