Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
El objetivo del análisis fluorométrico es servir como un costo efectivo, método rendimiento eficiente, de alta de analizar la fagocitosis y otros procesos celulares. Esta técnica se puede utilizar en una variedad de tipos de células, tanto adherentes y no adherentes, para examinar una variedad de propiedades celulares. Al estudiar la fagocitosis, la técnica fluorométrica utiliza tipos de células fagocíticas tales como macrófagos, y las partículas opsonizadas marcados con fluorescencia, cuya fluorescencia se puede extinguir en presencia de azul de tripano. Después de chapado de macrófagos adherentes en placas de 96 pocillos, partículas fluorescentes (verde o rojo) se administran y las células se les permite fagocitar por cantidades variadas de tiempo. Después de la internalización de las partículas fluorescentes, las células se lavan con azul de tripano, lo que facilita la extinción de la señal fluorescente a partir de bacterias que no se internalizan, o son simplemente se adhieren a la superficie de la célula. A continuación del lavado de tripano, las células se lavaron con PBS, se fijaron, unand teñidas con DAPI (marcador fluorescente azul nuclear), que sirve para etiquetar núcleos de las células. Por una sencilla cuantificación fluorométrico través de la lectura de la placa nuclear (azul) o de partículas (verde / rojo) de fluorescencia que puede examinar la relación de unidades relativas de fluorescencia de color verde azul y determinar un índice de fagocitosis indicativo de la cantidad de bacterias fluorescentes internalizadas por célula. La duración del ensayo utilizando un método y multicanal 96 pocillos pipetas para el lavado, desde el extremo de la fagocitosis hasta el final de la adquisición de datos, es menos de 45 min. La citometría de flujo podría ser utilizado de una manera similar pero la ventaja de fluorometría es su alto rendimiento, rápido método de evaluación con una mínima manipulación de las muestras y cuantificación rápida de intensidad de fluorescencia por célula. Estrategias similares se pueden aplicar a las células no adherentes, bacterias marcadas en vivo, la polimerización de actina, y esencialmente cualquier proceso que utiliza fluorescencia. Por lo tanto, fluorometría es un método prometedor para su bajo costo, alta throughpcapacidades ut en el estudio de procesos celulares.
Introduction
La cuantificación de la señal fluorescente ha sido ampliamente utilizado en una multitud de métodos científicos que van desde PCR, citometría de flujo, microscopía confocal, y el análisis FRET para multiplexar ELISA. Imágenes de fluorescencia y cuantificación tiene una amplia aplicación y puede ser una gran herramienta para el análisis cuantitativo de diversos procesos celulares. El uso de marcadores fluorescentes y su señal se ha revolucionado en la última década, y la aparición de lectores de placas fluorescentes ha facilitado la cuantificación de alto rendimiento de la fluorescencia emitida durante los procesos celulares.
Análisis Fluorométrico puede servir como una gran herramienta en la cuantificación de la fagocitosis. La fagocitosis se ha estudiado desde el descubrimiento de los fagocitos por Metchnikoff en 1800 1. A través de los años, una variedad de métodos se han utilizado para examinar este importante proceso esencial para la defensa inmune innata contra la invasión bacteriana, viral, fúngica y parásitos patógenos 2-5. Los métodos anteriores de cuantificación utilizado técnicas de microscopía y estereológicos el fin de visualizar las células que se phagocytosing, que luego se cuantificó por recuento de partículas internalizadas (manualmente o con el uso de software) 6-8. Algunas desventajas en el uso de microscopía solo para el análisis cuantitativo son que el recuento manual de las bacterias es una labor intensiva y más propenso a sesgo del observador. Otro método utilizado en la cuantificación de la fagocitosis es la técnica microbiológica de chapado de bacterias de lisados celulares (siguientes fagocitosis) en placas de cultivo de bacterias, pero este método puede fallar para dar cuenta de los mecanismos bactericidas y presencia de bacterias parcialmente internalizadas. Este método es intensivo incluso más mano de obra en comparación con la microscopía y lleva varios días para analizar. La citometría de flujo parece ser la forma más rápida, más eficaz para cuantificar la fagocitosis y ha sido utilizado por muchos grupos de 9-11, pero el alto costo asociado comúnmente con el eninstrumento necesario para el análisis hace que sea el método más caro en comparación con los ensayos mencionados anteriormente.
El método fluorométrico es una buena alternativa a la citometría de flujo para el análisis de la internalización de partículas, ya que ofrece la cuantificación insesgada de fluorescencia utilizando equipo que no es tan costo prohibitivo. Otros beneficios añadidos de fluorometría son de alta eficiencia, y las capacidades de alto rendimiento para la cuantificación de la fluorescencia emitida por las partículas internalizadas etiquetados.
Beneficios de la fluorometría pueden extrapolarse a la cuantificación de los procesos distintos de la fagocitosis. Por ejemplo, el análisis fluorométrico se puede aplicar para estudiar cualquier proceso que conduce a cambios en la expresión intracelular o de receptores unidos a membrana, los cambios en la permeabilidad celular / viabilidad, la eficacia de la transfección, y la modulación en la polimerización de actina. Una desventaja de la técnica fluorométrica es que, dependiendo de las etiquetas utilizadas, puede haber un altoexperimento para experimentar la variabilidad que por lo general puede ser resuelto mediante la demostración de los datos a través de la cuantificación relativa, como el cambio veces o por ciento de aumento de control.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las principales limitaciones de la técnica fluorométrica son varianza experimental, así como la pérdida de células asociada con un lavado extensivo y el uso de células no adherentes.
Varianza se observa en gran parte debido a la variación en partículas fluorescentes como pesaje y de pipeteado durante la preparación de la solución madre no es una manera exacta de mantener números idénticos de partículas de experimento a experimento. Para abordar el problema de la varianza entre l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
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