マクロファージ食作用およびアクチン重合の評価のためのハイスループット蛍光技術
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
蛍光分析の目的は、食作用および他の細胞プロセスを分析する効率的な、費用対効果の高い、高スループットの方法を提供することです。この技術は、細胞の種々の特性を調べるために、接着性および非接着性の両方の細胞型の、さまざまに使用することができる。食作用を研究する場合、蛍光技術は、マクロファージなどの貪食細胞型を利用し、蛍光が蛍光パンブルーの存在下で消滅させることができ、オプソニン化粒子を標識した。 96ウェルプレート中の付着マクロファージのメッキに続いて、蛍光粒子（緑色または赤色）が投与された細胞は、時間の種々の量のために貪食させる。蛍光粒子の内在化に続いて、細胞が内在化されていない、または単に細胞表面に付着している細菌からの蛍光シグナルの消滅を促進するトリパンブルーを用いて洗浄される。パンの洗浄の後、細胞を固定し、PBSで洗浄し、NDの細胞の核を標識するのに役立つDAPI（核青色蛍光ラベル）、で染色した。核（青）または粒子（赤/緑）蛍光のプレート読み取りを通して、簡単な蛍光定量によって、我々は緑の相対蛍光単位の比率調べることができます：青を、セルごとに内部移行し、蛍光細菌の量の貪食指数が示す決定する。洗浄のために96ウェル方式とマルチチャンネルピペットを用いたアッセイの持続時間は、データ収集の最後に、食作用の端部から、45分未満である。フローサイトメトリーを同様に使用することができるが、蛍光法の利点は、高スループット、サンプルの最小限の操作および細胞あたりの蛍光強度の迅速な定量化と評価の迅速な方法である。同様の戦略は、非接着細胞、生標識細菌、アクチン重合、および蛍光を利用する本質的に任意のプロセスに適用することができる。そのため、蛍光法は、低コスト、高throughpのための有望な方法であり、細胞プロセスの研究ではUT機能を提供します。
Introduction
蛍光シグナルの定量は、広く、フローサイトメトリー、PCRに至るまでの科学的方法の多数で使用される共焦点顕微鏡法、およびELISAを多重化分析をFRETされている。蛍光イメージングと定量化は、広範なアプリケーションがあり、様々な細胞プロセスの定量分析のための素晴らしいツールとなることができます。蛍光マーカーとその信号を使用すると、10年間で革命をもたらしてきた、蛍光プレートリーダーの出現は、細胞プロセスの間に放出される蛍光のハイスループット定量化が容易になった。
蛍光分析は、食作用の定量化に大きなツールとして役立つことができる。食作用は、1800 1メチニコフによる食細胞の発見以来研究されてきた。長年にわたり、種々の方法が、細菌、ウイルス、真菌および寄生虫病原体2-5侵入に対する自然免疫防御に必須のこの重要なプロセスを調べるために利用されている。その後、内在化粒子（手動でまたはソフトウェアを用いて）6~8の計数によって定量した貪食された細胞を可視化するために、定量化に利用顕微鏡および立体解析技術の従来の方法。定量分析のために単独で、顕微鏡を使用するいくつかの欠点は、細菌の手動カウントが労働集約的であり、観察者の偏りが発生しやすくなることである。食作用の定量化に使用される別の方法は、細菌培養プレート上（食作用の後）細胞溶解物からの細菌のメッキの微生物学的手法であるが、この方法は、殺菌メカニズムと部分的に内在化細菌の存在を考慮するために失敗することができる。この方法は、顕微鏡に比べ、より労働集約的であると分析するのに数日かかります。フローサイトメトリー食作用を定量化するための最速、最も効果的な方法であると思われると多くのグループ9-11により利用されてきたが、高コストは、一般的で関連付けられている前述のアッセイと比較した場合、分析に必要なトゥルメントは最も高価な方法になります。
蛍光測定法は、それがコスト法外としてではない機器を使用して蛍光の公平な定量化を提供するので、粒子の内在化の分析のためのフローサイトメトリーには良い代替手段です。蛍光測定の他の追加の利点は、高効率、および標識された内在化粒子によって放出される蛍光を定量するための高スループット能力である。
蛍光法の利点は、食作用以外のプロセスの定量化に外挿することができる。例えば、蛍光分析は、細胞内または膜結合型受容体、細胞透過性/生存率の変化、トランスフェクション効率、およびアクチン重合における変調の発現の変化をもたらす任意のプロセスを研究するために適用することができる。蛍光技術の一つの欠点は、使用されるラベルに応じて、高があってもよい、ということである通常、そのようなコントロールからの倍変化またはパーセント増加として、相対的な定量化を介してデータを示すことによって解決することができる可変性を実験する実験。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛍光技術の主要な制限は、実験の分散、ならびに十分に洗浄し、非接着細胞の使用に関連する細胞の喪失である。
分散は、実験を実験からの粒子の同一の番号を維持する正確な方法ではないストック溶液の調製時に秤量し、ピペッティングなどの蛍光粒子の変化によるところが観察される。 （ – ;粒子がすぐに追加および削除t = 0の対照）実験間の変動の問題に対処する?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
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