Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания

Introduction

Шиффа (PAS) окрашивание периодического кислота иммуногистохимическое метод, который широко используется в исследованиях мышц и диагностики. Он также используется в качестве диагностического инструмента на образцах крови. Методика работы с применением раствор периодной кислоты в образце, который окисляет единиц в создании полисахаридных альдегидных групп, которые вступают в реакцию с реагентом бесцветным Шиффа в результате чего получают глубокий пурпурный продукт. Этапы этой процедуры показаны на рисунке 1. Пятно превращается ничего с полисахаридами пурпурного, в том числе гликогена, гликопротеинов, гликолипидов, муцинов или других молекул с полисахаридных фрагментов.

ПАС окрашивание часто используется для определения уровня гликогена в мышечных волокнах. Разделы Мышцы ткани идеально подходят для техники, поскольку они прочно прикрепить к слайду и выдержать многочисленные стирки и окрашивания шаги. Гликоген является самым присутствуют в быстро сокращающиеся Тип II мышечные волокна, которые имеют высокий спросдля быстрого производства АТФ, требующей гликогена для максимального ^1,2 производительности. Гликоген представляет собой разветвленный полимер глюкозы, который может быть разбит на свободной глюкозы под действием ферментов гликогенфосфорилазы. Во время отдыха и питательной-достаточности, гликоген пополняется в процессе гликогенеза, в то время как во время питательной недостаточности или высоких энергий спроса; гликоген распадается на глюкозу гликогенолиза. Уже с изучили 1950-х годов клиницисты ученые PAS окрашивания образцов крови для анализа содержания гликогена в различных заболеваний ^3-7. Например, в Помпа болезней-добросовестного гликогена болезням лейкоциты накапливать большие количества гликогена, что существенно отличается от здоровых ^8.

Это видео-статья демонстрирует адаптированную версию окрашивания PAS для использования на мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) образцов из венозной крови здоровых людей. PBMCs в основном содержат лимфоцитов Т-лимфоцит и семей лимфоцитов B, а также других иммунных клеток, таких как естественных клеток-киллеров и моноцитов. Первый этап очистки удаляет эритроциты, нейтрофилы, гранулоциты и другие. Этот метод позволяет получать данные о концентрированной доли лимфоцитов, позволяющих более надежной подсчета PAS-положительных клеток в сравнении с использованием целых мазки крови.

Рисунок 1:. Шаг за шагом методологии PAS окрашивания на РВМС () Во-первых, изоляция РВМС достигается за счет фиколл градиента, левая панель показывает подготовку перед центрифугированием, правая панель показывает его после центрифугирования, где Баффи пальто, содержащий РВМС наблюдается в центре трубки. (B), выделенные РВМС закреплены на слайде с помощью формалина-этанол фиксирующие Солуния. Ползун осторожно промывают дистиллированной водой из пластиковой бутылки для стирки. (С) слайд помещают в 100 мл химический стакан на полпути, заполненной раствором амилазы, которые будут растворяться гликогена. Ползун осторожно промывали. (D) скольжения обрабатывают раствором йодной кислотой, где окисление происходит сахаридов. Слайды мягко промыть; это будет удалить избыток периодический кислоту и остановить стадию окисления. (е) если реагент Шиффа добавляют к слайдам, он будет реагировать с альдегидами, созданных в ходе стадии окисления. Это бесцветное реагента будет приводить к темно-красного пурпурного продукта. Слайды осторожно промывают, чтобы удалить избыток реагента Шиффа.

Protocol

Исследования с образцами крови человека была одобрена в университете Конкордия этики наблюдательного совета, номер сертификата 10000618. Работа на мышцы мыши было одобрено Университет Конкордия этики наблюдательного совета, номер сертификата 2010BERG.

1. РВМС изоляции из цельной крови

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте эту процедуру в биозащитой с использованием стерильной техники и производитель стерилизовать оборудование.

1. Осторожно залить 10-15 мл цельной крови из гепаринизированной (антикоагулянт) для сбора крови труб в 50 мл стерильные конические пробирки. При незначительных разливов крови, протрите DDh ₂ O и 70% этанола при помощи чистящего ткани.
2. Развести крови в конической трубе в соотношении 1: 1 с фосфатным буфером физиологический раствор (PBS 1X), рН 7,4. Убедитесь, что Максимальный общий объем не превышает 30 мл.
3. Осторожно перемешать с помощью серологических пипеток пистолет, избегая пузырьков.
   Примечание: Не перемешать переворачивая пробирку, чтобы избежать кровиccumulation в кепке и последующей фильтрации во время центрифугирования.
4. Добавить 13 мл Ficoll-Пак (см Материалы и настольные принадлежности), к новому конической трубе 50 мл мощности. Держите трубку вертикально в стойку.
5. Использование передачи пипетки, принимают разбавленной крови, сенсорный наконечник пипетки к внутренней стенке трубы в верхней. При медленном и устойчивом давлении, передавать кровь вдоль внутренней стенки трубы, образующей слой крови в верхней части слоя сахарозы. Сделать этот шаг несколько раз, пока вся кровь не была передана.
6. Закройте пробирку крышкой плотно и центрифуги трубки при комнатной температуре в течение 30 мин при 700 мкг в качели ротора с множеством среднего ускорения до 5, и замедление устанавливается в ноль.
7. Медленно извлеките трубку и, не нарушая слои, принять его обратно в кабинет биологической безопасности.
8. Осторожно собрать Баффи пальто (тонкий облачно белый слой), где МНПК расположены, расположенный между PBS / плазменнойй фиколл слои с помощью пипетки передачи. Избегайте сбора сахарозы слой и не беспокоить слой красных клеток крови.
9. Передача поглощающее покрытие в новый 50 мл стерильные конические пробирки. Это может занять несколько раз повторяющихся шаг 1,8, чтобы собрать все РВМС.
10. Добавить PBS рН 7,4 в трубке с РВМС и заполнить до отметки 45 мл. Встряхнуть пробирку тщательно. Не вихрь.
11. Промыть 1: Центрифуга течение 15 мин при 480 мкг как с максимальным ускорением и замедлением, установленного до 9. Заметим, формирование гранул из РВМС в нижней части конической трубки.
12. Отменить PBS (надосадочную) в пластиковый стакан с 10 мл отбеливателя.
13. Ослабить осадок клеток осторожно "ломают" против волнообразной поверхности (например, пустой стойке). Не вихрь.
14. Добавить 25 мл свежего PBS рН 7,4 в трубе. Если более чем одна трубка обрабатывается, бассейн гранул вместе в этом шаге.
15. Вымойте 2: центрифуги трубку в течение 12 мин при 480 мкг в Wiго как максимальное ускорение и замедление набор до 9.
16. Откажитесь от PBS (надосадочную) в пластиковом стакане со всплеском отбеливателя.
17. Осторожно "стойку" против волнообразной поверхности (например, пустой стойке). Не вихрь.
18. Добавить 25 мл свежего PBS на пробирку.
    1. Выньте 50 мкл клеток и передачи в микроцентрифужных трубки для подсчета жизнеспособности.
    2. Добавить равное количество (50 мкл) трипанового синего (жизнеспособность пятен) и пипетки вверх и вниз, чтобы аккуратно перемешать.
19. Выньте 10 мкл и перенести его на гемоцитометре, чтобы проверить жизнеспособность клеток на мл. Запишите количество клеток / мл.
20. Вынуть желаемое количество клеток и центрифуги трубки в течение 12 мин при 480 х г и с максимальным ускорением и замедлением, установленным в 9.
21. Откажитесь от PBS (надосадочную) в стакан с отбеливателем.
22. Осторожно "стойку" против волнообразной поверхности (например, пустой стойке). Добавить 80 мкл PBS в трубку.

2. Создание РВМС слайд

1. Поместите 80 мкл клеток на предметное стекло микроскопа. Намажьте падение с помощью другого слайда или поместить 2 капли 40 мкл каждого на обоих концах слайда.
2. Оставьте слайд в кабинете биологической безопасности для просушки. Этикетка слайд с карандашом на матовом стороны.

3. Крепление образцов на слайдах

1. Подготовка Фиксирующий раствор путем смешивания 0,5 мл 37% формальдегида в 4,5 мл 99% -ного этанола.
2. После того, как слайды сушат, вынуть 2 мл свежеприготовленного фиксатора раствора и вылейте его на слайде, чтобы вся поверхность слайда покрыта.
3. Оставьте раствор на слайде в течение 1 мин. Промыть слайд в течение 1 мин с водопроводной водой и оставить высохнуть на воздухе.

4. Создание Амилаза решение для отрицательного контроля

1. Возьмем 0,25 г порошка амилазы и растворяют в 50 мл дизамер воды. Налейте раствор в чистую 100 мл химический стакан.
2. Погрузите слайд в химический стакан, так что половина слайда получает лечение, а другая половина не лечить, а затем инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре (рис 1С).
3. Запишите, на какой стороне слайда получающего лечение амилазы. Нарисуйте линию на задней части слайда с указанием границы между лечения и контроля.
4. Вымойте слайды с DDh ₂ O, чтобы удалить амилазы решение и оставить слайд высохнуть на воздухе.

5. Выполните йодной кислотой Шифф (PAS) окрашивания и визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: PAS реагенты являются токсичными при вдыхании и вызывают коррозию, поэтому шаги должны быть сделаны в химическом вытяжном шкафу, и отходы должны быть надлежащим образом утилизированы в соответствии с ведомственным руководящим принципам.

1. Поместите слайд на плоской поверхности и льют 1,50-2,00 мл раствора кислоты Периодической на образце. Incubaте в течение 5 мин при комнатной температуре.
2. Промыть слайдов в нескольких зарядов дистиллированной воды.
3. Налейте 1,50-2,00 мл реагента Шиффа на предметное стекло и инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
4. Вымойте слайд с дистиллированной водой в течение 5 мин и оставить высохнуть на воздухе.
5. Применить 10 мкл крепления СМИ на слайде и накрыть двумя маленькими покровные, или применить 50 мкл и использовать одну большую покровное.
6. Применить ясный лак для ногтей по краям покровного стекла, просушить в течение ночи.

6. Получение изображений с бинокулярного оптического микроскопа, используя объективные 100X

Representative Results

Для проверки реагентов и основную технику, окрашивание PAS было выполнено в соответствии с инструкциями изготовителя по разделам мышечных мыши камбаловидной. Окрашивание было сделано в тот же день в жертву и на последнем этапе окрашивания, срезы фиксированной ксилолом. Камбаловидной мышцы, как известно, содержат ~ 35% гликогена-положительных клеток ^9. Окрашенные клетки мышц отображается два различных PAS-положительных гранул Особенности- точечные внутри клетки, а сплошная линия демаркации клеточной мембраны (фиг.2А). Наличие точечных гранул согласуется с гликогена, и был использован для определения положительный мышечную клетку. Обработка образцов амилазы удалены гранулы точечные что согласуется с ними быть гликоген (рис 2б).

Рисунок 2: PAS- окрашенных срезов мышц мыши были проанализированы с световой микроскопии. разделы мышечные мыши камбаловидной окрашивали PAS. Некоторые образцы были предварительно обработаны амилазы. (A) PAS-положительных частицы были видны внутри мышечных клеток. (B) менее PAS-позитивных клеток наблюдали, когда секции мышцы были предварительно обработаны амилазы. Окрашивание вокруг клеточной мембраны, оставшиеся после амилазы лечения (масштаб бар = 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Сигнал мембраны окрашивания оставался даже после лечения амилазы. Как и ожидалось, процент PAS-положительных клеток в секции без амилазы мышц был 37%, в то время как амилаза обрабатывают участки мышц было значительно меньше, примерно на 5% PAS-положительных клеток (фиг.3).

">
Рисунок 3: Количественное PAS-положительных клеток мышц доля мышечных клеток, которые были PAS, позитивно отсчитывается от представительного слайд или без амилазы предварительной обработки.. Как и ожидалось, 37% мышечных клеток были положительными гликогена. Лечение амилазы значительно сократить Па-сигнал 4% (* р <0,001).

Далее, PAS-окрашивание проводили на PBMC из венозной крови здоровых людей с помощью модифицированной методики, как описано в разделе протокола, и показано на рисунке 1. ОКПК хорошую адгезию, если тщательно выполняются шаги стирки. PAS-окрашенных МНПК показанные разнообразие моделей окрашивания. Маленькие клетки (5 мкм) с гранул легко наблюдать. Наблюдались также доля крупных клеток с диффузной картине окрашивания (рис 4А и вставка A.1-6 (рис 4б).

Была проведена йодная кислота-Шиффа (PAS) пятна на человека МНПК () PAS-окрашивание на МНПК: Рисунок 4.. Наблюдались два типа клеток. (A.1-6) Меньшие клетки (в 5 мкм) в не-амилазы, получавших слайдов показал пурпурный частиц в соответствии с гликогена. Эти клетки могут быть покоящихся клеток. Большие клетки (более 5 мкм), не амилазы обработанных клеток было диффузное PAS-положительных окрашивания. Эти клетки могут быть активированных лимфоцитов. (B) РВМС обрабатывали амилазы в течение 15 мин до окрашивания, которая уменьшилась сигнал PAS. Представитель семи различных здоровых людей. (C) PAS и hematoxyОкрашивание Лин цельную слайд крови. Стрелка показывает РВМС в окружении многих эритроцитов (масштабная линейка = 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Доля, что было положительным ПАС составила 98% для меньших клеток и 40% для более крупных клеток. Лечение Амилаза устранили PAS сигнал в мелких клеток (р <0,001) и значительно уменьшилась па-сигнал в больших клетках до 7% (рисунок 5).

Рисунок 5: Количественная оценка PAS-положительных МНПК доля МНПК, которые были PAS, позитивно отсчитывается от представительного слайд или без амилазы предварительной обработки.. 98% малых клеток были положительными для PAS. 40% крупных клеток были рositive для PAS. Лечение Амилаза устранили PAS сигнал в мелких клеток (р <0,001) и значительно уменьшилась па-сигнал в больших клетках до 7% (р <0,001).

Чтобы подтвердить, что РВМС обладают гликоген второй, независимый способ, который также обеспечивает количественное определение количества гликогена было использовано ^10,11 и ранее опубликованной в JOVE на других типах клеток ^12. РВМС лизировали в гипотонического буфера и гликоген отделяли, как описано кратко в подписи к фигуре 6.

Рисунок 6: Измерение гликогена с помощью ферментативного расщепления с гидролиза ферментами. Гликоген была измерена в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, протокол предусматривает гипотонический лизис 1 × 10 ⁶ РВМС с последующим гранулированием нерастворимого материалакоторый содержит гликоген. Осадок промывали и расщепляли ферментами гидролиза с образованием глюкозо которое было измерено с помощью спектрофотометрии и по сравнению со стандартной кривой. Клеточный лизат разводили в указанных соотношениях с буфером гидролиза. Данные представитель трех экспериментов. Значительные уровни гликогена были обнаружены в разведении 1: 1 (р = 0,02), и этот сигнал титруют, как лизата дополнительно разбавляли.

Нерастворимый гликогена промывают несколько раз, а затем переваривают с помощью гидролиза ферментами. Количество глюкозы получали из пищеварения была измерена с помощью спектрофотометрии и по сравнению со стандартной кривой. Один миллион МНПК было 1,19 мкг гликогена. Гликоген сигнал титруют вниз, как клеточного лизата в дальнейшем был разбавлен (рисунок 6).

Discussion

Критические шаги этого видео статьи были во время стирки и амилазы обработки клеток. При промывке слайды, ключевым шагом было с помощью пластиковой податливый стиральная бутылку и вода мягко запустить через образец на слайде и не стремимся непосредственно на образцах. Даже малейшее прямое давление воды может вызвать клетки оторваться от слайда. Другим ключевым шагом было использовать тот же слайд для ± условиях амилазы. После того, как РВМС прикреплен к слайд, слайд был осторожно помещают в химический стакан так что только половина мазок подвергается воздействию амилазы раствора. Этот шаг обеспечивает надежный контроль, потому что клетки крови от одной и той же слайде, таким образом минимизируя искажающих факторов, которые могут возникнуть в связи с небольшими вариациями синхронизации. Клетки застрял и без обработки, так что не будет оправданным дополнительные затраты и время связаны с поли-L-лизин или полиэтиленгликоль, например, покрытия.

Через TRoubleshooting оптимального деятельность амилазы определена. Для секций мышцы, было отмечено, что оптимальная активность амилазы наблюдалось в течение 1 ч инкубации. При более длительном разделы мышечные бы Медленно снимите слайд, в то время как более короткие интервалы времени амилазы не в полной мере удалить Па-сигнал. Время для амилазы инкубации в течение РВМС слайдов должно было быть уменьшена по сравнению с мышечной-образец синхронизации (который был 1 час) до всего лишь 15 мин. Более длительное время вызвало МНПК оторваться слайд, в то время как более короткие времена не эффективно воздействовать па-сигнал. Одна из модификаций со стандартным протоколом окрашивания PAS меняется метод промывки слайдов. Инструкции производителя указано мыть слайды с проточной водой, что вызывало клетки оторваться слайды. Модификация была мыть слайды с податливый стиральной бутылки, чтобы сохранить клетки. Как описано в шагах раздела критической, это было очень важно не непосредственно применять водуДавление на клетках.

Есть некоторые ограничения в этой технике. Мышечных клеток мембрану окрашивают наряду с точечными гранул в цитоплазме мышечных клеток. Гранулы были устранены путем обработки амилазы и, следовательно, скорее всего, будет гликогена, в то время как окрашивание мембраны был нечувствителен к амилазы. Идентичность частиц PAS-положительных на клеточной мембране, не известно. Это может быть мышечная подвал (perimysium) мембрана. Эта мембрана окружает мышечные пучки и из-за высокого содержания гликопротеина известно, что ПАС положительным. Другим ограничением окрашивания PAS в том, что гранулы гликогена должно быть не менее 50 нм в диаметре, чтобы быть видимыми с помощью обычного светового микроскопа. Таким образом, мелкие гранулы гликогена может присутствовать в клетке, но все еще зарегистрировать отрицательный тест на PAS. Второй метод преодолевает это ограничение, обеспечивая обнаружение гликогена в лизате. В сочетании со стандартной кривой это может быть использовано, чтобы Determine точное количество гликогена. Хотя этот метод является очень количественно и не ограничивается размером гранул, она сама по себе имеет некоторые ограничения. Гликоген гранулы представляют собой сложные разветвленные структуры со многими вспомогательными белками и химических поперечных связей, что делает маловероятным, что гидролиз ферменты полного растворения всей молекулы гликогена ^13. Таким образом, ферментативная обнаружения (например, техники PAS) может при-представляют собой реальную сумму гликогена в образце. Единственный способ справиться с это ограничение с электронной микроскопии, который решает даже самые маленькие гранулы гликогена ^14. Можно было бы использовать комбинацию этих методов, PAS-окрашивание, ферментативного расщепления и электронной микроскопии для наиболее полной характеристики гликогена.

Эта статья и видео демонстрирует кислоты Шифф (PAS) метод периодического окрашивания, предназначенную для использования на МНПК. Значение этого исследования видно в выборе использованияМНПК более мазке крови, что сделало его более возможным перечислить лимфоцитов. Первоначально классический метод крови мазок был протестирован, однако большинство клеток на слайде были красные кровяные клетки и, возможно, нейтрофилы (рис 4в). Концентрировать лимфоциты, РВМС выделяли из крови с использованием стандартной техники в градиенте плотности. Используя методику, аналогичную кроваво-мазке, РВМС легко придерживаться на протяжении процедуре PAS, которая имеет множество активные стадии промывки. Техника PAS был использован на протяжении десятилетий для определения уровня гликогена в тканях биопсии мышц, которые разрезают на тонкие секции и присоединились к слайдам. Окрашивание PAS был выбран по сравнению с другими химическими веществами окрашивания углеводов из-за его высокой надежностью и наличием ожидаемых результатов в литературе. Мышь (Mus spretus) участки мышц был использован в качестве положительного контроля и обнаружили, как и ожидалось, что 37% клеток были PAS-положительных ^9. С точки зрения стоимости и времени, готовясь PBMС более обременительным, чем мазке крови, но есть несколько преимуществ. Во-первых, препарат более обогащены лимфоцитов, которые являются клетки, представляющие интерес для проектов, которые сосредотачиваются на аутоиммунных заболеваний. Если были использованы мазки крови, лимфоциты будет меньшинство, что делает его сложно найти ячейку интерес. Можно было бы готовить и анализировать гораздо больше слайдов, чтобы получить те же самые номера вы получите с несколькими горками РВМС. Исследователи были бы очень заинтересованы в использовании наш новый оптимизированный метод в АУТОИММУНИТЕТ проектов, связанных с сахарным диабетом 1 типа, рассеянный склероз, волчанка, ревматоидный артрит, и т.д., где Т- и В-лимфоциты и NK-клетки играют роль. Конечно, для других применений, где эритроциты или нейтрофилов интерес мазка крови будет рекомендовано. Другим преимуществом является то, что РВМС могут быть использованы для изучения биологии лимфоцитов человека в лабораторных условиях.

Текущие исследования расследует источник гликогена в МНПК. Яп будущее, планируется для измерения содержания гликогена в контексте рассеянный склероз, Т-лимфоцитами аутоиммунные заболевания, поражающего насчитывалось 2,3 миллиона человек во всем мире в 2013 ^15,16. Каковы малые и большие клетки в образцах РВМС? Клетки в 5 мкм согласуются с лимфоидного в их состоянии покоя. Т-лимфоцитов, В-лимфоциты, природные клетки-киллеры и другие незначительные подмножества в пределах этого диапазона размера. Более крупные РВМС, вероятно, состоит из активированных лимфоцитов, которые растут больше, так как они получают воспалительные сигналы от иммунной системы, а также моноцитов с миелоидной линии. Передовые технологии сортировки клеток, например, люминесцентных активирована сортировки клеток или магнитного активирована сортировки клеток требуется для улучшения результативности подмножество, которое выражает гликогена.

Гематоксилин счетчика окрашивание используется, когда окрашивание было сделано на цельной крови. Это позволило нам выделить моноцитов эритроцитов (Фиг.4С). Когда окрашивание было сделано на РВМС, так как все клетки мононуклеарных, нет никакой необходимости, чтобы противостоять пятна гематоксилином выявления клеток. Также гематоксилин вмешивается с PAS сигнала в клетках. Таким образом, мы показали, процедуру PAS-окрашивание, приспособленный для РВМС. Этот метод полезен для ученых и клиницистов, исследующих АУТОИММУНИТЕТ, инфекции и аллергии.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.