Détection glycogène dans les cellules mononucléaires du sang périphérique avec l'acide périodique Schiff coloration

Introduction

L'acide périodique Schiff (PAS) est une technique de coloration immunohistochimique qui est largement utilisé dans la recherche et le diagnostic musculaire. Il est également utilisé comme outil de diagnostic dans des échantillons de sang. La technique fonctionne en appliquant une solution d'acide périodique à l'échantillon, qui se oxyde à l'intérieur des unités de polysaccharide créer des groupes aldéhyde qui réagissent avec le réactif de Schiff l'incolore pour produire ainsi un produit de magenta foncé. Les étapes de cette procédure sont représentées sur la figure 1. La tache tourne avec quoi que ce soit, y compris des polysaccharides magenta glycogène, les glycoprotéines, les glycolipides, les mucines, ou d'autres molécules ayant des groupements polysaccharidiques.

Coloration PAS est souvent utilisé pour mesurer les niveaux de glycogène dans les fibres musculaires. Muscles sections de tissus sont idéales pour la technique qu'ils attachent fermement à la diapositive et résister à de multiples étapes de lavage et de coloration. Le glycogène est plus présent dans contraction rapide de type II fibres musculaires, qui ont une forte demandepour la production d'ATP rapide nécessitant glycogène pour ^1,2 de performance maximale. Le glycogène est un polymère ramifié du glucose qui peut être divisé en glucose libre par l'action d'enzymes de la glycogène Phosphorylase. Dans les temps de repos et de suffisance nutritionnelle, le glycogène est reconstitué par le processus de glycogenèse, tandis qu'en temps de l'insuffisance ou de haute énergie nutritionnelle la demande; glycogène est décomposé en glucose par glycogénolyse. De dès les années 1950, les cliniciens-chercheurs ont exploré la coloration PAS sur des échantillons de sang pour analyser le contenu de glycogène dans diverses maladies ^3-7. Par exemple, dans la maladie de Pompe, une glycogénose de bonne foi globules blancs aux maladies accumulent de grandes quantités de glycogène qui diffère sensiblement de ⁸ témoins sains.

Cet article explique-vidéo d'une version adaptée de coloration PAS pour une utilisation sur des cellules périphériques mononucléaires de sang périphérique (PBMC) des échantillons de sang veineux de sujets humains en bonne santé. PBMCs contient essentiellement des lymphocytes du lymphocyte T et les familles de lymphocytes B, ainsi que d'autres cellules du système immunitaire telles que des cellules et des monocytes tueurs naturels. La première étape de purification élimine les erythrocytes, les neutrophiles, les granulocytes et d'autres. Cette technique fournit des données sur une partie de concentré pour la numération des lymphocytes permettant plus robuste de cellules de PAS-positif par rapport à l'aide de frottis de sang total.

Figure 1:. Étape par la méthodologie de l'étape de la coloration PAS sur CMSP (A) d'abord, l'isolement des PBMC est réalisé par gradient de ficoll, le panneau de gauche montre la préparation avant la centrifugation, le panneau de droite montre après centrifugation où la couche leucocytaire contenant les PBMC On observe dans le centre du tube. (B) PBMC isolées sont fixées sur la lame à l'aide de formol-éthanol solu fixantstion. La lame est doucement rincé avec de l'eau distillée dans une bouteille de lavage en matière plastique. (C) La lame est ensuite placé dans un bécher de 100 ml rempli à mi-chemin avec une solution d'amylase, qui dissoudra glycogène. La lame est rincée doucement. (D) La lame est traité avec une solution d'acide périodique, où l'oxydation des saccharides a lieu. Les lames sont rincés doucement; cela va enlever l'excès de l'acide périodique et arrêter l'étape d'oxydation. (E) Lorsque le réactif de Schiff est ajouté aux lames, il va réagir avec des aldéhydes créés au cours de l'étape d'oxydation. Ce réactif incolore va alors donner un produit magenta rouge profond. Les lames sont doucement rincées pour éliminer le réactif Schiff excès.

Protocol

Recherche avec des échantillons de sang humain a été approuvé par le Conseil d'examen éthique de l'Université Concordia, le numéro de certificat 10000618. Le travail sur les muscles de la souris a été approuvé par le Conseil d'examen éthique de l'Université Concordia, numéro de certificat 2010BERG.

1. Isolement PBMC à partir de sang

REMARQUE: Effectuer cette procédure dans une enceinte de biosécurité utilisant une technique stérile et de l'équipement du fabricant stérilisé.

1. Verser soigneusement 10 à 15 ml de sang complet à partir des tubes héparinés (anti-coagulant) collecte de sang dans un tube conique de 50 ml stérile. Pour les déversements de sang mineurs, essuyer avec ddH ₂ O et 70% EtOH en utilisant des tissus de nettoyage.
2. On dilue le sang dans le tube conique à un rapport 1: 1 avec le tampon phosphate salin (PBS 1X) pH 7,4. Assurez-vous que le volume total maximum ne dépasse pas 30 ml.
3. Mélanger doucement à l'aide d'une pipette sérologique pistolet en évitant les bulles.
   NOTE: Ne pas mélanger en inversant le tube pour éviter un sangccumulation dans le bouchon et l'infiltration subséquente pendant la centrifugation.
4. Ajouter 13 ml de Ficoll-Paque (voir Matériels et table Équipement), à un nouveau tube conique de 50 ml de capacité. Gardez le tube vertical dans le rack.
5. Aide d'une pipette de transfert, une prise de sang dilué, toucher la pointe de pipette de transfert à la paroi intérieure du tube près du sommet. Avec une pression lente et régulière, transférer le sang le long de la paroi intérieure du tube formant une couche de sang au-dessus de la couche de saccharose. Effectuez cette opération plusieurs fois jusqu'à ce que tout le sang a été transféré.
6. Boucher le tube hermétiquement et centrifuger le tube à la température ambiante pendant 30 min à 700 xg dans un rotor swing avec l'ensemble de l'accélération moyenne à 5, et la décélération mis à zéro.
7. Sortez lentement le tube et sans déranger les couches, le ramener à l'enceinte de sécurité biologique.
8. Recueillir soigneusement la couche leucocytaire (mince couche blanche trouble), où se trouvent les CMSP, placé entre le PBS / plasma une couches de Ficoll en utilisant une pipette de transfert. Éviter de recueillir couche de saccharose et de ne pas déranger la couche de globules rouges.
9. Transférer la couche leucocytaire dans un nouveau tube de 50 ml conique stérile. Il peut prendre plusieurs fois de répéter l'étape 1.8 de recueillir toutes les CMSP.
10. Ajouter PBS pH 7,4 au tube avec le CMSP et remplir jusqu'à la marque 45 ml. Bien agiter tube. Ne pas vortex.
11. Lavez 1: Centrifugeuse pendant 15 min à 480 xg à la fois avec une accélération maximale et la décélération réglé à 9. Observez formation d'un culot de PBMC au fond du tube conique.
12. Rejeter le PBS (surnageant) dans un bécher en plastique avec 10 ml d'eau de Javel.
13. Desserrer culot cellulaire par doucement "rayonnage" contre une surface ondulée (c.-à-rack vide). Ne pas vortex.
14. Ajouter 25 ml de PBS frais pH 7,4 au tube. Si plus d'un tube est en cours, en commun les pellets ensemble dans cette étape.
15. Lavez 2: Centrifugeuse le tube pendant 12 min à 480 xg with la fois l'accélération et la décélération maximale fixé à 9.
16. Rejeter le PBS (surnageant) dans le bécher en plastique avec un peu d'eau de Javel.
17. Doucement "rack" contre une surface ondulée (c.-à-rack vide). Ne pas vortex.
18. Ajouter 25 ml de PBS frais dans le tube.
    1. Sortez 50 pi des cellules et transférer dans un tube à centrifuger pour le nombre de viabilité.
    2. Ajouter une quantité égale (50 pi) de bleu trypan (une tache de viabilité) et pipette de haut en bas pour mélanger doucement.
19. Sortez 10 pi et le transférer sur un hémocytomètre pour vérifier la viabilité des cellules par ml. Notez le nombre de cellules / ml.
20. Sortez la quantité désirée de cellules et centrifuger le tube pendant 12 min à 480 xg à la fois avec une accélération maximale et la décélération réglé sur neuf.
21. Rejeter le PBS (surnageant) dans le bécher avec l'eau de Javel.
22. Doucement "rack" contre une surface ondulée (c.-à-rack vide). Ajouter 80 pi de PBS dans le tube.

2. Faire le diaporama PBMC

1. Placer 80 ul des cellules sur une lame de microscope. Enduire la goutte à l'aide d'une autre lame ou placer deux gouttes de 40 ul de chacune des deux extrémités de la glissière.
2. Laissez diapositive dans l'enceinte de sécurité biologique à sécher. Étiqueter la lame avec un crayon sur le côté givré.

3. Fixation des échantillons sur les lames

1. Préparer la solution de fixation en mélangeant 0,5 ml de formaldehyde à 37% 4,5 ml d'éthanol à 99%.
2. Une fois que les lames sont séchées, sortir 2 ml de la solution de fixation fraîchement préparé et le verser sur le coulisseau de sorte que toute la surface de la glissière est couverte.
3. Laissez la solution sur la lame pendant 1 min. Rincer la lame pendant 1 min avec de l'eau du robinet et laisser sécher à l'air.

4. Faire la solution amylase pour le contrôle négatif

1. Prendre 0,25 g de poudre d'amylase et dissoudre dans 50 ml de dil'eau calmé. Verser la solution dans un endroit propre bécher de 100 ml.
2. Immerger la lame dans le bécher de sorte que la moitié de la glissière reçoit le traitement et l'autre moitié ne est pas traitée et ensuite incuber pendant 15 min à température ambiante (figure 1C).
3. Faire une note sur le côté de la glissière reçoit le traitement de l'amylase. Tracez une ligne sur le dos de la lame indiquant la frontière entre le traitement et le contrôle.
4. Laver les lames avec ddH ₂ O pour éliminer la solution d'amylase et de laisser la lame sécher à l'air.

5. Effectuez l'acide périodique Schiff (PAS) Coloration et imagerie

NOTE: PAS réactifs sont toxiques par inhalation et sont corrosifs, de sorte que les mesures doivent être fait dans une hotte chimique et les déchets doivent être correctement éliminés conformément aux directives institutionnelles.

1. Placer la lame sur une surface plane et versez 1,50 à 2,00 ml de solution d'acide périodique sur l'échantillon. Incubate pendant 5 min à température ambiante.
2. Rincer les lames dans plusieurs charges d'eau distillée.
3. Verser 1,50 à 2,00 ml de réactif de Schiff sur la lame et incuber à température ambiante pendant 15 min.
4. Laver la lame avec de l'eau distillée pendant 5 minutes et laisser sécher à l'air.
5. Appliquer 10 pi milieu de montage sur la lame et couvrir avec deux petites lamelles, ou d'appliquer 50 pi et utiliser une grande lamelle.
6. Appliquer vernis à ongles transparent sur les bords de la lamelle, laisser sécher pendant la nuit.

6. obtenir des images au microscope optique binoculaire à l'aide de l'objectif 100X

Representative Results

Pour valider les réactifs et la technique de base, PAS coloration a été effectuée selon les instructions du fabricant sur des sections du muscle soléaire de souris. La coloration a été réalisée le même jour que le sacrifice et dans la dernière étape de la coloration, les coupes ont été fixées par du xylène. Le muscle soléaire est connu pour contenir ~ 35% de cellules de glycogène positif ^9. Les cellules musculaires colorées affichent deux granulés ponctuées Caractéristiques- PAS-positifs distincts au sein de la cellule, et une ligne continue qui sépare les la membrane cellulaire (figure 2A). La présence de granules ponctuées est compatible avec les réserves de glycogène, et a été utilisé pour définir une cellule musculaire positive. Traitement des échantillons avec amylase a enlevé les granules ponctuées ce qui est cohérent avec eux étant glycogène (Figure 2B).

Figure 2: PAS- sections musculaires de souris colorées ont été analysées en microscopie optique. sections du muscle soléaire de souris ont été colorées avec PAS. Certains échantillons ont été pré-traitées avec de l'amylase. (A) des particules de PAS-positifs étaient visibles à l'intérieur des cellules musculaires. (B) cellules positives Moins PAS ont été observés lorsque les sections musculaires ont été pré-traitées avec de l'amylase. La coloration autour de la membrane cellulaire est resté après le traitement de l'amylase (barre d'échelle = 100 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le signal est resté membrane coloration même après un traitement d'amylase. Comme prévu, le pourcentage de cellules positives au PAS dans la section de muscle non-amylase était de 37%, tandis que les sections de muscle d'amylase traités avaient significativement moins environ 5% PAS-positifs cellules (Figure 3).

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Figure 3: Quantification des cellules musculaires PAS-positives, la proportion de cellules musculaires qui étaient positifs PAS a été compté à partir d'une diapositive représentant sans ou avec l'amylase de pré-traitement.. Comme prévu, 37% des cellules musculaires étaient positifs pour le glycogène. traitement de l'amylase a réduit significativement le PAS-signal pour 4% (* p <0,001).

Ensuite, PAS-coloration a été réalisée sur des PBMC à partir de sang veineux de sujets humains en bonne santé en utilisant une technique modifiée de la manière décrite dans la section de protocole, et illustré à la figure 1. Les PBMC adhère bien si les étapes de lavage ont été effectués avec soin. Le PAS PBMC colorées affiche une variété de motifs de coloration. Les petites cellules (5 um) avec des granules ont été facilement observés. Une partie des cellules plus grandes avec un profil de coloration diffus ont également été observées (figure 4A, et encadré A.1-6 (figure 4B).

Figure 4:. Acide périodique Schiff (PAS) coloration sur des PBMC humaines (A) PAS-coloration sur des PBMC a été effectuée. Deux types de cellules ont été observées. (A.1-6) cellules plus petites (à 5 um) à lames traitées non-amylase ont montré des particules de magenta compatibles avec glycogène. Ces cellules pourraient être les cellules au repos. Des cellules plus grandes (plus de 5 um) dans les cellules traitées non-amylase avaient diffuse coloration PAS-positif. Ces cellules peuvent être activées lymphocytes. (B) PBMC ont été traités avec une amylase pendant 15 minutes avant la coloration, ce qui diminue le signal de PAS. Représentant de sept sujets humains sains différents. (C) Le PAS et hematoxylin coloration fait sur la diapositive de sang total. La flèche indique un PBMC entouré de nombreux érythrocytes (barre d'échelle = 10 um). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La proportion qui était positif PAS est de 98% pour les cellules plus petites et 40% pour les cellules plus grandes. traitement de l'amylase a éliminé le signal de PAS dans les petites cellules (p <0,001) et diminuée de manière significative le PAS-signal dans les cellules plus grandes à 7% (figure 5).

Figure 5: Quantification des PBMC PAS-positives La proportion de PBMC qui ont été positifs PAS a été compté à partir d'une diapositive représentant sans ou avec l'amylase de pré-traitement.. 98% des cellules de petite taille étaient positifs pour le PAS. 40% des cellules étaient plus grandes positive pour PAS. traitement de l'amylase a éliminé le signal de PAS dans les petites cellules (p <0,001) et diminuée de manière significative le PAS-signal dans les cellules plus grandes à 7% (p <0,001).

Pour confirmer que les PBMC glycogène possèdent une seconde méthode indépendant qui fournit également la quantification de la quantité de glycogène a été utilisé ^10,11, et a été publié antérieurement dans JoVE sur d'autres types de cellules ^12. CMSP ont été lysées dans un tampon hypotonique et glycogène été séparés aussi brièvement décrit dans la légende de la figure 6.

Figure 6: Mesure de glycogène en utilisant une digestion enzymatique avec des enzymes d'hydrolyse. Le glycogène a été mesurée selon les instructions du fabricant. En bref, le protocole implique lyse hypotonique de 1 x 10 ⁶ PBMC suivie par granulation de matière insolublequi contient glycogène. Le culot a été lavé et digéré par des enzymes d'hydrolyse produisant glucose qui a été mesurée par spectrophotométrie et comparée à une courbe standard. Le lysat cellulaire a été diluée selon les rapports indiqués avec un tampon d'hydrolyse. Les données sont représentatives de trois expériences. Des niveaux importants de glycogène ont été détectés dans la dilution 1: 1 (p = 0,02), et ce signal titré comme le lysat a été davantage dilués.

Le glycogène insoluble a été lavé à plusieurs reprises, et ensuite digéré en utilisant des enzymes d'hydrolyse. La quantité de glucose cédé de digestion a été mesurée par spectrophotométrie et comparée à une courbe standard. Un million de PBMC avaient 1,19 pg de glycogène. Le signal de glycogène titrée vers le bas comme le lysat cellulaire a été diluée en outre (figure 6).

Discussion

Les étapes essentielles du présent article vidéo étaient au cours du lavage et de l'amylase traitement des cellules. Alors que le lavage des lames, l'étape clé utilisait une bouteille de lavage compressible plastique et laisser couler l'eau doucement à travers l'échantillon sur la lame et ne visant pas directement sur les échantillons. Même la pression d'eau directe moindre causerait les cellules à venir de la lame. Une autre étape clé était d'utiliser la même diapositive pendant ± conditions d'amylase. Après les PBMC ont été collées sur la diapositive, la diapositive a été soigneusement placé dans un bêcher de sorte que la moitié du frottis a été exposée à la solution d'amylase. Cette étape fournit une commande robuste parce que les globules sont de la même lame, minimisant ainsi les variables confondantes qui peuvent survenir en raison de légères variations de synchronisation. Les cellules ainsi coincés avec l'absence de traitement, de sorte que le coût et le temps additionnels liés à la poly-L-lysine ou de polyéthylène glycol revêtement par exemple ne seraient pas justifiées.

Grâce troubleshooting l'activité optimale de l'amylase a été déterminée. Pour les sections musculaires, on a constaté que l'activité optimale de l'amylase a été observée dans 1 h d'incubation. À plus long fois les sections musculaires seraient lentement décoller la diapositive, tout en court fois amylase n'a pas enlever correctement la PAS de signal. Le calendrier pour l'incubation de l'amylase pour les diapositives CMSP a dû être réduite par rapport à la synchronisation musculaire échantillon (qui était de 1 h), contre seulement 15 min. Des temps plus longs causés CMSP à venir de la lame, tandis que des temps plus courts ne ont pas influé efficacement le PAS de signal. Une modification au protocole standard de coloration PAS changeait le procédé de lavage des lames. Les instructions du fabricant ont indiqué à laver les lames avec de l'eau du robinet, qui a causé les cellules se détachent les diapositives courante. La modification avait pour laver les lames avec une bouteille de lavage compressible pour préserver les cellules. Comme décrit dans la section étapes critique, il était très important de ne pas appliquer directement l'eaupression sur les cellules.

Il ya quelques limitations dans cette technique. La membrane des cellules musculaires a été coloré avec des granules de ponctuées dans le cytoplasme de la cellule musculaire. Les granulés ont été éliminés par traitement de l'amylase et donc susceptible d'être glycogène, tandis que la coloration de la membrane ne était pas sensible à l'amylase. L'identité des particules de PAS-positif sur la membrane cellulaire ne est pas connue. Il pourrait être la membrane basale de muscle (périmysium). Cette membrane entoure les faisceaux musculaires et en raison de sa haute teneur en glycoprotéine il est connu pour être PAS positif. Une autre limite de coloration PAS est que les granules de glycogène doivent avoir au moins 50 nm de diamètre pour être visible par microscopie optique conventionnelle. Ainsi, les petits granules de glycogène pourraient être présents dans une cellule, mais encore vous inscrire négatif sur un test de PAS. La deuxième méthode utilisée surmonte cette limitation en fournissant la détection de glycogène dans un lysat. En combinaison avec une courbe standard, cela peut être utilisé pour DETErmine le montant exact de glycogène. Bien que cette technique est très quantifiable et ne est pas limitée par la taille des granules, elle ne se présentent certaines limitations. granules de glycogène sont des structures ramifiées complexes avec de nombreuses protéines accessoires et des liens croisés chimiques, il est peu probable que les enzymes d'hydrolyse se dissolvent totalement une molécule de glycogène ensemble ^13. Ainsi, la détection enzymatique (comme la technique PAS) peut sous-estimer la quantité réelle de glycogène dans un échantillon. Une façon de gérer cette limitation est en microscopie électronique qui résout même les plus petits granules de glycogène ^14. Il faudrait utiliser une combinaison de ces techniques, PAS-coloration, digestion enzymatique, et la microscopie électronique pour la caractérisation la plus complète de glycogène.

Cet article et la vidéo démontre l'acide Schiff (PAS) technique de coloration périodique adapté pour l'utilisation sur des PBMC. L'importance de cette étude est vu dans le choix d'utiliserCMSP plus de frottis de sang, ce qui a rendu plus facile d'énumérer les lymphocytes. Dans un premier temps, une technique classique de frottis de sang a été testé, mais la majorité des cellules sur la lame sont des globules rouges et éventuellement des neutrophiles (figure 4C). Pour concentrer les lymphocytes, les CMSP ont été purifiés à partir de sang en utilisant une technique à gradient de densité standard. En utilisant une technique similaire à un frottis de sang, les PBMC facilement collé pendant la durée de la procédure de PAS, qui a de nombreuses étapes de lavage vigoureux. La technique de SAP a été utilisé pendant des décennies pour déterminer les niveaux de glycogène dans les biopsies de tissus musculaires, qui sont coupés en sections fines et respectées diapositives. PAS coloration a été choisi parmi d'autres produits chimiques de coloration glucides en raison de sa grande fiabilité et la présence de résultats attendus dans la littérature. A coupes de muscle Mus spretus (de souris) a été utilisé comme témoin positif et ont trouvé, comme on s'y attendait, que 37% des cellules étaient positives ^PAS-9. En termes de coût et de temps, préparer PBMC est plus onéreux qu'un frottis de sang, mais il ya plusieurs avantages. Tout d'abord, la préparation est plus enrichi dans les lymphocytes, qui sont les cellules d'intérêt pour les projets qui se concentrent sur l'auto-immunité. Si des frottis sanguins ont été utilisés, les lymphocytes seraient minoritaires, ce qui rend difficile de trouver la cellule d'intérêt. Il faudrait pour préparer et analyser beaucoup plus de diapositives pour obtenir les mêmes chiffres que vous obtiendriez avec quelques diapositives de CMSP. Les chercheurs seraient très intéressés à l'aide de notre nouvelle technique optimisé dans des projets d'auto-immunité liées au diabète de type 1, la sclérose en plaques, le lupus, la polyarthrite rhumatoïde, etc., où les lymphocytes T et B et les cellules NK jouent un rôle. Bien sûr, pour d'autres applications où les érythrocytes ou neutrophiles sont d'intérêt le frottis de sang serait recommandé. L'autre avantage est que les PBMC peuvent être utilisés pour l'étude de la biologie des lymphocytes humains in vitro.

Une recherche en cours étudie la source de glycogène dans les CMSP. Jen l'avenir, il est prévu de mesurer la teneur en glycogène dans le contexte de la sclérose en plaques, une maladie auto-immune T médiée par les lymphocytes qui touche environ 2,3 millions de personnes dans le monde à partir de 2013 ^15,16. Quels sont les petites et grandes cellules dans les échantillons de PBMC? Cellules à 5 um sont conformes à la lignée lymphoïde dans leur état de repos. Lymphocytes T, les lymphocytes B, les cellules tueuses naturelles, et d'autres sous-ensembles mineurs sont dans cette gamme de taille. Les PBMC sont plus grandes chances composées de lymphocytes activés, qui poussent plus grande car ils reçoivent des signaux inflammatoires du système immunitaire et les monocytes à partir de la lignée myéloïde. Techniques de triage des cellules avancées telles que fluorescente tri cellulaire activé ou tri magnétique de cellules activées sont nécessaires pour affiner le sous-ensemble qui exprime glycogène.

Contre-coloration à l'hématoxyline a été utilisée lors de la coloration a été effectuée sur du sang total. Cela nous a permis de distinguer les monocytes de érythrocytes (Figure 4C). Lorsque la coloration a été réalisée sur des PBMC, puisque toutes les cellules mononucléaires ont été, ne était pas nécessaire pour contrer tache avec de l'hématoxyline pour identifier les cellules. Aussi hématoxyline interférait avec le signal de PAS dans les cellules. En résumé, nous avons démontré une procédure PAS-coloration adaptée pour CMSP. Cette technique est utile pour les scientifiques et les cliniciens recherchent l'auto-immunité, les infections et les allergies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.