Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Introduction

Perjodsyra Schiff (PAS) färgning är en immunhistokemisk teknik som ofta används i muskelforskning och diagnostik. Det är också utnyttjas som ett diagnostiskt verktyg på blodprov. Tekniken fungerar genom att tillämpa periodisk syralösning till provet, som oxiderar enheter inom polysackarid skapa aldehydgrupper som reagerar med den färglösa Schiffs reagens vilket skulle skapa en djup magenta produkt. Stegen i detta förfarande visas i figur 1. Fläcken vänder allt med polysackarider magenta, inklusive glykogen, glykoproteiner, glykolipider, muciner, eller andra molekyler med polysackarid-molekyldelar.

PAS-färgning används ofta för att mäta glykogennivåer i muskelfibrerna. Muskler vävnadssnitt är idealiska för den teknik som de ordentligt fästa på bilden och tål flera tvätt- och färgningssteg. Glykogen är mest närvarande i snabb ryckning typ II muskelfibrer, som har en stor efterfråganför snabb ATP produktionen kräver glykogen för maximal prestanda ^1,2. Glykogen är en grenad polymer av glukos som kan brytas till fri glukos genom verkan av glykogenfosforylas enzymer. I tider av vila och näringsförsörjningen, är glykogen fylls genom processen att glykogenes, medan det i tider av närings insufficiens eller hög energi efterfrågan; glykogen bryts ner till glukos genom glykogenolys. Från så tidigt som på 1950-talet kliniker forskare har undersökt PAS färgning på blodprov för att analysera glykogeninnehållet i olika sjukdomar ^3-7. Till exempel i Pompes sjukdom-en Bonafide glykogenlagrings sjuk- doms vita blodkroppar ansamlas stora mängder glykogen som skiljer sig avsevärt från friska kontroller ^8.

Denna video-artikel visar en anpassad version av PAS-färgning för användning på perifera mononukleära blodceller (PBMC) prover från venöst blod från friska humana individer. PBMCs innehåller mestadels lymfocyter i T-lymfocyter och B-lymfocyt familjer, liksom andra immunceller såsom naturliga mördarceller och monocyter. Det första reningssteget avlägsnar erytrocyter, neutrofiler och andra granulocyter. Denna teknik tillhandahåller data på en koncentrerad andel av lymfocyter som möjliggör mer robust räkning av PAS-positiva celler jämfört med användning av hela blodutstryk.

Figur 1:. Steg för steg metodik PAS färgning på PBMC (A) Först isolering av PBMC uppnås genom ficoll lutning, visar den vänstra panelen förberedelserna före centrifugering, visar den högra panelen den efter centrifugering där lättcellskoncentratet innehåller PBMC observeras i mitten av röret. (B) Isolerade PBMC fixeras på objektglaset med hjälp formalinetanolfästlösningartion. Sliden är försiktigt sköljas med destillerat vatten från en plasttvättflaska. (C) Objektglaset placeras därefter i en 100 ml bägare till hälften fylld med amylas-lösning, vilket kommer att lösa glykogen. Glid är försiktigt sköljas. (D) Glid behandlas med periodisk syralösning, där oxidation av sackarider sker. Diabilder är försiktigt sköljas; detta kommer att ta bort överskottet av perjodsyra och stoppa oxidationssteget. (E) När Schiff-reagens tillsätts till objektglasen, kommer den att reagera med aldehyder som skapats under oxidationssteget. Denna färglösa reagens kommer sedan att resultera i en djup röd magenta produkt. Slides varsamt sköljas för att avlägsna överskottet av Schiffs reagens.

Protocol

Forskning med blodprov mänskliga godkändes av Concordia University etikprövningsnämnden, certifikatnummer 10000618. Arbetet med musen muskel godkändes av Concordia University etikprövningsnämnden, certifikatnummer 2010BERG.

1. PBMC Isolering från helblod

OBS: Utför denna procedur i en biosäkerhet skåp med steril teknik och tillverkare-steriliserad utrustning.

1. Häll försiktigt 10-15 ml helblod från hepariniserade (antikoagulant) bloduppsamlingsrören i en 50 ml sterilt koniska rör. För mindre blodspill, torka med DDH ₂ O och 70% EtOH använder rengöringsvävnad.
2. Späd blodet i det koniska röret till en 1: 1-förhållande med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS 1x) pH 7,4. Se till att den maximala totala volymen inte överskrider 30 ml.
3. Blanda försiktigt med hjälp av en serologisk pipett pistol undvika bubblor.
   OBS: Blanda inte genom att vända röret för att undvika blod accumulation i hatten och efterföljande läckage under centrifugering.
4. Lägg 13 ml Ficoll-Paque (se Material och utrustning tabell), till en ny 50 ml kapacitet koniska rör. Håll röret upprätt i racket.
5. Med användning av en överföringspipett, ta utspädda blod, vid överförings pipettspetsen innervägg av röret nära toppen. Med långsam och stadig tryck, överföra blodet längs insidan väggen av röret bildar en blodskikt ovanpå det sackaros skiktet. Gör detta steg flera gånger tills allt blod har överförts.
6. Cap röret ordentligt och centrifugera röret i rumstemperatur i 30 minuter vid 700 xg i en gunga rotor med medelhög inställda accelerations till 5, och retardation till noll.
7. Ta långsamt ut röret och utan att störa lagren, ta den tillbaka till biosäkerhet skåpet.
8. Samla lättcellskoncentratet (tunt grumlig vitt lager), där PBMC finns, placeras mellan PBS / plasma and Ficoll skikt med hjälp av en pipett. Undvik samla sackaros lager och stör inte den röda blodcellager.
9. Överför lättcellskoncentratet in i en ny 50 ml sterilt koniskt rör. Det kan ta flera gånger av att upprepa steg 1,8 för att samla all PBMC.
10. Lägg PBS pH 7,4 till röret med PBMC och fyll upp till 45 ml markeringen. Skaka röret noggrant. Inte virvel.
11. Tvätta 1: Centrifugera i 15 min vid 480 xg med både maximal acceleration och retardation inställd på 9. Observera bildning av en pellet av PBMC på botten av det koniska röret.
12. Kassera PBS (supernatant) in i en plastbägare med 10 ml blekmedel.
13. Lossa cellpelleten genom att försiktigt "omdragning" mot en vågformad yta (dvs tom rack). Inte virvel.
14. Lägg 25 ml färsk PBS pH 7,4 till röret. Om mer än ett rör är under behandling, pool pelletsen tillsammans i detta steg.
15. Tvätta 2: Centrifugera röret i 12 minuter vid 480 xg with både maximal acceleration och retardation inställd på 9.
16. Kassera PBS (supernatanten) i plastbägare med ett stänk av blekmedel.
17. Försiktigt "rack" mot en vågformad yta (dvs tom rack). Inte virvel.
18. Tillsätt 25 ml färsk PBS till röret.
    1. Ta ut 50 ul av cellerna och överför till ett mikrocentrifugrör för viabilitet count.
    2. Tillsätt en lika mängd (50 | il) av trypanblått (en viabilitet fläck) och pipet upp och ned för att blanda försiktigt.
19. Ta ut 10 pl och överföra den till en hemocytometer att kontrollera livskraft celler per ml. Registrera antalet celler / ml.
20. Ta ut önskad mängd celler och centrifugera röret i 12 minuter vid 480 xg med både maximal acceleration och retardation inställd på 9.
21. Kassera PBS (supernatanten) i bägaren med blekmedel.
22. Försiktigt "rack" mot en vågformad yta (dvs tom rack). Lägg 80 il PBS i röret.

2. Göra PBMC Slide

1. Placera 80 | il av cellerna på ett objektglas. Smörj droppe med hjälp av en annan slid eller placera 2 droppar av 40 ul var på båda ändarna av sliden.
2. Låt bild i biologiskt säkerhetsskåp för att torka. Märk bilden med en penna på frostat sidan.

3. Fastställande Samples på Slides

1. Förbered fixeringslösning genom att blanda 0,5 ml av 37% formaldehyd till 4,5 ml av 99% etanol.
2. Efter sliderna torkas, ta ut 2 ml av den nygjorda fixeringslösning och häll den på sliden så att hela ytan av objektglaset är täckt.
3. Låt lösningen på sliden under 1 min. Skölj objektglaset i 1 min med kranvatten och låt den lufttorka.

4. Göra Amylas lösning för negativ kontroll

1. Ta 0,25 g amylas pulver och lös upp i 50 ml distillas vatten. Häll lösningen i en ren 100 ml bägare.
2. Sänk bilden i bägaren så att hälften av sliden får behandling och den andra hälften förblir obehandlade och sedan inkubera i 15 minuter i rumstemperatur (Figur 1C).
3. Anteckna på vilken sida av bilden tar emot amylas behandlingen. Rita en linje på baksidan av bilden indikerar gränsen mellan behandling och kontroll.
4. Tvätta bilderna med DDH ₂ O att avlägsna amylas lösningen och lämna bilden lufttorka.

5. Utför periodiska Acid Schiff (PAS) Färgning och Imaging

OBS: PAS reagenser är giftig vid inandning och är frätande, så åtgärder måste göras i en kemisk dragskåp, och avfallsprodukter måste kasseras enligt lokala behandlingsrekommendationer.

1. Placera bilden på en plan yta och häll 1,50-2,00 ml Periodic Acid Solution på provet. Incubate för 5 min vid rumstemperatur.
2. Skölj objektglasen i flera laddningar av destillerat vatten.
3. Häll 1,50-2,00 ml Schiffs reagens på bilden och inkubera den i rumstemperatur i 15 min.
4. Tvätta objektglaset med destillerat vatten i 5 min och låt den lufttorka.
5. Applicera 10 pl montering media på bilden och täck med två små täck, eller tillämpa 50 pl och använda en stor täck.
6. Applicera genomskinligt nagellack på kanterna av täck, låt torka över natten.

6. Skaffa bilder med Kikare ljusmikroskop Använda 100X mål

Representative Results

För att validera reagenser och grundläggande teknik, var PAS-färgning utförs enligt tillverkarens anvisningar om musen soleusmuskeln sektioner. Färgningen gjordes samma dag som offer och i sista steget av färgning, var sektionerna fastställs av xylen. Den soleusmuskel är känd för att innehålla ~ 35% glykogen-positiva celler ^9. De färgade muskelceller visas två distinkta PAS-positiva funktioner- punktat granuler inom cellen, och en kontinuerlig linje demarking cellmembranet (Figur 2A). Närvaron av punktuell granuler är förenlig med glykogenlager, och användes för att definiera en positiv muskelcell. Behandling av prover med amylas bort de punktat granulat som är förenlig med dem är glykogen (Figur 2B).

Figur 2: passa- färgade mus muskelsektioner analyserades med ljusmikroskop. Mus soleusmuskeln sektioner färgades med PAS. Vissa prover förbehandlade med amylas. (A) PAS-positiva partiklar var synliga inne i muskelcellerna. (B) Mindre PAS-positiva celler observerades när muskelsektionerna var förbehandlade med amylas. Den färgning runt cellmembranet kvar efter amylas behandling (skala bar = 100 nm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Membranet-färgning signal förblev även efter amylas behandling. Som väntat andelen PAS-positiva celler i den icke-amylas muskelsektionen var 37%, medan amylas behandlat muskelsektioner hade signifikant lägre, cirka 5% PAS-positiva celler (Figur 3).

">
Figur 3: Kvantifiering av PAS-positiva muskelceller Andelen muskelceller som var PAS positiva räknades från ett representativt bild utan eller med amylas förbehandling.. Som väntat, var 37% av muskelceller positiva för glykogen. Amylas behandling minskade signifikant PAS-signalen till 4% (* p <0,001).

Därefter sattes PAS-färgning utfördes på PBMC från venöst blod från friska humana individer med användning av en modifierad teknik såsom beskrivs i protokollet sektionen, och illustreras i figur 1. PBMC vidhäftade väl om tvättningsstegen var noggrant utföras. PAS-färgade PBMC visas en mängd olika färgningsmönster. Små celler (5 | im) med granulerna lätt observeras. En del av större celler med ett diffust färgningsmönster observerades också (Figur 4A, och infälld A.1-6 (Figur 4B).

Figur 4:. Perjodsyra-Schiff (PAS) färgning på mänskliga PBMC (A) PAS-färgning på PBMC utfördes. Två typer av celler observerades. (A.1-6) Mindre celler (vid 5 um) i icke-amylas behandlade diabilder visade magenta partiklar som överensstämmer med glykogen. Dessa celler kunde vilande celler. Större celler (mer än 5 pm) i icke-amylas behandlade celler hade diffus PAS-positiv färgning. Dessa celler kan aktiveras lymfocyter. (B) PBMC behandlades med amylas i 15 min före färgning, vilket minskat PAS signalen. Representant för sju olika friska människor. (C) PAS och hematoxylin färgning görs på helblod slide. Pilen visar en PBMC omgiven av många erytrocyter (skala bar = 10 mikrometer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Andelen som var PAS positiva var 98% för de mindre cellerna och 40% för de större cellerna. Amylas behandling elimineras PAS signalen i de små cellerna (p <0,001) och signifikant minskat PAS-signalen i de större cellerna till 7% (Figur 5).

Figur 5: Kvantifiering av PAS-positiva PBMC Andelen PBMC som var PAS positiva räknades från ett representativt bild utan eller med amylas förbehandling.. 98% av de små stora celler var positiva för PAS. 40% av de större cellerna var positive för PAS. Amylas behandling eliminerade PAS signalen i små celler (p <0,001) och signifikant minskat PAS-signalen i de större cellerna till 7% (p <0,001).

För att bekräfta att PBMC besitter glykogen ett andra, oberoende metod som också ger kvantifiering av mängden glykogen användes ^10,11, och har tidigare publicerats i JUPITER på andra celltyper ^12. PBMC lyserades i hypoton buffert och glykogen avskildes som beskrivs kortfattat i bildtext i figur 6.

Figur 6: Mätning av glykogen använder enzymatisk spjälkning med hydrolys enzymer. Glykogen mättes enligt tillverkarens instruktioner. I korthet innebär det protokoll hypotonisk lys av 1 x 10 ⁶ PBMC följt av pellete olösligt materialsom innehåller glykogen. Pelleten tvättades och spjälkades med hydrolys enzymer som ger glukos som mättes genom spektrofotometri och jämfördes med en standardkurva. Cellysatet späddes vid de angivna förhållandena med hydrolys buffert. Data är representativa för tre experiment. Signifikanta nivåer av glykogen detekterades i 1: 1 utspädning (p = 0,02), och denna signal titreras ut som lysatet späddes ytterligare.

Den olösliga glykogen tvättades flera gånger, och digererades därefter med hjälp av hydrolys enzymer. Mängden glukos gav från digere mättes med användning av spektrofotometri och jämfördes med en standardkurva. En miljon PBMC hade 1,19 pg av glykogen. Den glykogen signalen titreras ned som cellysatet späddes ytterligare (Figur 6).

Discussion

De kritiska stegen i denna video artikeln var under tvättning och amylas behandling av cellerna. Medan tvätta bilderna var viktigt steg med hjälp av en plast squeezable tvättflaska och låta vattnet rinna sakta genom provet på bilden och inte siktar direkt på proverna. Även den minsta direkta vattentrycket skulle få cellerna att lossna bilden. En annan viktig steg var att använda samma bild för ± amylas förhållanden. Efter det att PBMCs vidhäftades vid sliden, var sliden placerades försiktigt i en bägare så att endast hälften av utstryket exponerades för amylas lösningen. Detta steg ger en robust kontroll eftersom blodcellerna är från samma objektglas, vilket minimerar störande variabler som kan uppstå på grund av små tidsstyrningsvariationer. Cellerna fastnat väl med ingen behandling, så den extra kostnaden och tiden inblandade med poly-L-lysin eller polyetylenglykol beläggning till exempel inte skulle vara motiverat.

Genom troubleshooting den optimala aktiviteten hos amylas bestämdes. För muskel sektioner, noterades det att den optimala aktiviteten hos amylas observerades inom en timme av inkubation. Vid längre tider muskelsektionerna skulle sakta dra av bilden, medan kortare tider amylas inte adekvat bort PAS-signalen. Tidpunkten för amylas inkubation för PBMC diabilder måste minskas i förhållande till muskelprovet timing (vilket var 1 timme) till endast 15 minuter. Längre tider orsakade PBMC snabbt värma upp bilden, medan kortare tider inte effektivt påverka PAS-signalen. En modifiering av standardprotokoll för PAS färgning ändra metoden för att tvätta objektglasen. Tillverkarens instruktioner indikerade att tvätta glasen med rinnande kranvatten, vilket orsakade cellerna att lossna bilderna. Modifieringen var att tvätta glasen med klämtvättflaska för att bevara cellerna. Som beskrivs i steg avsnittet kritiska, var det mycket viktigt att inte direkt tillämpa vattentrycket på cellerna.

Det finns vissa begränsningar i denna teknik. Den muskelcellmembranet färgades tillsammans med punktuell granulat i cytoplasman hos muskelcellen. Granulerna eliminerades genom amylas behandling och därför sannolikt glykogen, medan membranfärgning var okänslig för amylas. Identiteten av PAS-positiva partiklar på cellmembranet är inte känd. Det kan vara muskel källaren (perimysium) membran. Detta membran omger muskel fascicles och på grund av dess höga glykoprotein halt det är känt för att vara PAS positiva. En annan begränsning med PAS-färgning är att glykogen granuler måste vara minst 50 nm i diameter för att vara synlig genom konventionell Ijusmikroskopi. Sålunda kunde mindre glykogen granuler vara närvarande i en cell, men ändå registrera negativa på en PAS-test. Den andra metod som används övervinner denna begränsning genom att tillhandahålla detektion av glykogen i ett lysat. I kombination med en standardkurva kan detta användas för att DeTermine den exakta mängden glykogen. Även om denna teknik är mycket kvantifierbar och är inte begränsad av storleken på granulerna, betyder sig ha vissa begränsningar. Glykogen granulat är komplexa grenade strukturer med många tillbehör proteiner och kemiska tvärbindningar, vilket gör det osannolikt att hydrolys enzymer upplösa fullt en hel glykogen molekyl ^13. Således den enzymatiska-detektion (som PAS teknik) kan under representera den faktiska mängden glykogen i ett prov. Ett sätt att hantera denna begränsning är med elektronmikroskopi som löser även de minsta glykogen granulat ^14. Man skulle behöva använda en kombination av dessa tekniker, PAS-färgning, enzymatisk uppslutning, och elektronmikroskopi för den mest omfattande karakterisering av glykogen.

Denna artikel och video visar perjodsyra Schiff (PAS) färgningsteknik anpassad för användning på PBMC. Betydelsen av denna studie ses i valet av att användaPBMC över blodutstryk, vilket gjorde det mer realistiskt att räkna lymfocyter. Initialt gjordes en klassisk blod-utstryk teknik testas, men majoriteten av celler på objektglaset var röda blodkroppar och möjligen neutrofiler (Figur 4C). Att koncentrera lymfocyterna, var PBMC renas från blod med standard densitetsgradient teknik. Med användning av en teknik som liknar en blod-utstryk, den PBMC lätt vidhäftade för varaktigheten av PAS förfarandet, som har många kraftfulla tvättsteg. PAS teknik har använts i decennier för att bestämma glykogennivåer i muskel vävnadsbiopsier, som skärs i tunna sektioner och anslöt sig till diabilder. PAS-färgning valdes framför andra kolhydratfärgningskemikalier på grund av dess höga tillförlitlighet och förekomsten av förväntade resultat i litteraturen. En mus (Mus spretus) muskelsektioner användes som en positiv kontroll och fann, som väntat, att 37% av cellerna var PAS-positiva ^9. I fråga om kostnader och tid, förbereda PBMC är mer betungande än en blodutstryk, men det finns flera fördelar. För det första är preparatet mer anrikat i lymfocyter, som är de celler av intresse för projekt som satsar på autoimmunitet. Om blodutstryk användes, skulle lymfocyter vara minoritet, vilket gör det svårt att hitta cellen av intresse. Man skulle behöva förbereda och analysera långt fler bilder för att få samma nummer som du skulle få med några PBMC diabilder. Forskare skulle vara mycket intresserad av att använda vårt nya optimerade teknik autoimmunity projekt relaterade till typ 1-diabetes, multipel skleros, lupus, reumatoid artrit, etc. där T- och B-lymfocyter och NK-celler spelar en roll. Naturligtvis, för andra tillämpningar där erytrocyter eller neutrofiler är av intresse i blodutstryk skulle rekommenderas. Den andra fördelen är att PBMC kan användas för att studera den mänskliga lymfocyter biologi in vitro.

Ett pågående forskning undersöker källan till glykogen i PBMC. Jagn framtiden är det tänkt att mäta glykogeninnehåll i samband med multipel skleros, en T-lymfocyt-medierad autoimmun sjukdom som drabbar uppskattningsvis 2,3 miljoner människor över hela världen och med 2013 ^15,16. Vilka är de små och stora celler i PBMC prover? Celler vid 5 xm är förenliga med den lymfoida härstamningen i sitt vilotillstånd. T-lymfocyt, B-lymfocyter, naturliga mördarceller, och andra mindre delmängder är inom detta storleksintervall. De större PBMC sannolikt består av aktiverade lymfocyter, som växer större eftersom de får inflammatoriska signaler från immunförsvaret, och monocyter från myeloid härstamning. Avancerade cellsorteringstekniker såsom fluorescensaktiverad cellsortering eller magnetisk aktiverad cellsortering krävs för att ytterligare förfina den delmängd som uttrycker glykogen.

Hematoxylin motfärgning användes när färgning gjordes på helblod. Detta gjorde det möjligt att skilja monocyter från erytrocyter (Figur 4C). När färgning gjordes på PBMC, eftersom alla celler var mononukleära, fanns det ingen anledning att motverka fläcken med hematoxylin att identifiera celler. Också hematoxylin störde PAS signal i cellerna. Sammanfattningsvis har vi visat en PAS-färgningsprocedur anpassad för PBMC. Denna teknik är användbar för forskare och kliniker forskar autoimmunitet, infektion och allergi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.