Introduction
שיף צביעת חומצה תקופתית (PAS) היא טכניקה immunohistochemical כי נעשתה שימוש נרחב במחקר שריר ואבחון. כמו כן הוא משמש ככלי אבחון בדגימות דם. הטכניקה עובדת על ידי יישום פתרון חומצה תקופתי למדגם, אשר מתחמצן יחידות בתוך קבוצות אלדהיד פוליסכריד יצירת המגיבות עם המגיב של שיף חסר הצבע וכך לייצר מוצר מגנטה עמוק. צעדיו של נוהל זה מוצגים באיור 1. הכתם הופך כל דבר עם מגנט רב-סוכרים, כולל גליקוגן, גליקופרוטאינים, glycolipids, mucins, או מולקולות אחרות עם moieties פוליסכריד.
צביעת PAS משמשת לעתים קרובות כדי למדוד את רמות הגליקוגן בסיבי שריר. חלקי רקמות שרירים הם אידיאליים עבור הטכניקה כמו שהם מייחסים היטב לשקופית ולעמוד שלבי כביסה וצביעה מרובים. גליקוגן הוא ההווה ביותר בעווית מהירה סוג II סיבי שריר, שבו יש ביקוש גבוהלייצור ATP מהיר הדורש גליקוגן ל1,2 ביצועים מרבי. גליקוגן הוא פולימר מסועף של גלוקוז שיכול להיות שבור לגלוקוז החופשי דרך הפעולה של אנזימי phosphorylase הגליקוגן. בימים של מנוחה ותזונה-הסתפקות, גליקוגן מתחדש בתהליך של גליקוגנזה, ואילו בתקופות של ביקוש אי ספיקה או אנרגיה גבוהה תזונתי; גליקוגן מתפרק לגלוקוז על ידי "גליקוגנוליסיס". ממוקדם ככל 1950 מדעני קלינאי בחנו צביעת PAS על דגימות דם כדי לנתח תוכן גליקוגן במחלות שונות 3-7. לדוגמא, במחלת-אחסון גליקוגן bonafide Pompe תאי דם לבנים disease- לצבור כמויות גדולות של גליקוגן ששונה באופן משמעותי מנבדקי ביקורת בריאים 8.
וידאו-מאמר זה מדגים גרסה מותאמת של מכתים PAS לשימוש בתאי הדם היקפי mononuclear (PBMC) דגימות מהדם ורידים של בני אדם בריאים. PBMCs מכיל בעיקר לימפוציטים של הלימפוציטים T ומשפחות הלימפוציטים B, כמו גם תאים חיסוניים אחרים, כגון תאי הרג טבעיים ומונוציטים. הצעד הראשון לטיהור מסיר אריתרוציטים, נויטרופילים, וגרנולוציטים אחרים. טכניקה זו מספקת נתונים על שיעור מרוכז של לימפוציטים מסוג המאפשר לספירה חזקה יותר של תאי PAS-חיובי בהשוואה לשימוש במשטחי דם כולה.
איור 1:. צעד אחר צעד המתודולוגיה של מכתים PAS על PBMC () ראשית, בידוד של PBMC מושגת באמצעות שיפוע ficoll, הלוח השמאלי מציג את ההכנה לפני צנטריפוגה, הפנל הימני מראה את זה אחרי צנטריפוגה בי המעיל באפי המכיל את PBMC הוא ציין במרכז של הצינור. PBMCs מבודדת (ב ') הם קבועים לשקופית באמצעות solu מקבע פורמלין-אתנולtion. השקופיות היא שטפו בעדינות עם מים מזוקקים מבקבוק פלסטיק לשטוף. (C) השקופית ממוקמת אז במחצית דרך 100 מיליליטר כוס מלאה פתרון עמילאז, שיתמוסס גליקוגן. השקופיות היא שטפו בעדינות. הוא טיפל (D) השקופיות עם פתרון חומצה תקופתי, שבו חמצון של סוכרים מתרחש. שקופיות הם שטופים בעדינות; זה יסיר את החומצה התקופתית העודפת ולעצור את צעד החמצון. (E) כאשר מגיב שיף מתווסף לשקופיות, זה יגיב עם אלדהידים נוצרו במהלך שלב החמצון. אז מגיב חסר צבע זה יגרום מוצר מגנטה אדום עמוק. שקופיות הם שטופים בעדינות כדי להסיר את מגיב שיף העודף.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר עם דגימות דם אדם אושר על ידי אוניברסיטת קונקורדיה האתיקה המועצה לביקורת, מספר תעודת 10000618. העבודה על שריר עכבר אושרה על ידי אוניברסיטת קונקורדיה האתיקה המועצה לביקורת, מספר תעודת 2010BERG.
1. בידוד PBMC מדם מלא
הערה: לבצע הליך זה בקבינט בטיחות ביולוגי באמצעות טכניקה סטרילית וציוד מעוקר יצרן.
- יוצק בזהירות 10-15 מיליליטר של דם מלא מצינורות heparinized (נוגדת קרישה) איסוף דם לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מיליליטר. לנשפך דם קטין, לנגב עם DDH 2 O ו- 70% EtOH באמצעות רקמת ניקוי.
- לדלל את הדם בצינור חרוטי ליחס של 1: 1 עם פוספט הצפת מלוח (PBS 1x) pH 7.4. ודא שעוצמת הקול המרבית הכוללת אינו עולה על 30 מיליליטר.
- מערבבים בעדינות באמצעות אקדח פיפטה סרולוגיות הימנעות בועות.
הערה: אל מערבבים על ידי היפוך הצינור כדי למנוע דםccumulation בכובע והחלחול שלאחר מכן במהלך צנטריפוגה. - להוסיף 13 מיליליטר של Ficoll-Paque (ראה חומרים וציוד שולחן), לצינור חרוטי 50 מיליליטר קיבולת חדש. שמור את הצינור זקוף במעמד.
- בעזרת פיפטה העברה, לקחת דם מדולל, לגעת בקצה פיפטה ההעברה לקיר הפנימי של הצינור סמוך לראש. עם לחץ איטי ויציב, להעביר את הדם לאורך הקיר הפנימי של הצינור ויוצר שכבת דם על גבי שכבת סוכרוז. לעשות את הצעד הזה כמה וכמה פעמים עד שכל הדם הועבר.
- שווי הצינור בחוזקה וצנטריפוגות הצינור בטמפרטורת חדר למשך 30 דקות ב 700 XG בהרוטור נדנדה עם סט ההאצה בינוני עד 5, והאטה לאפס.
- לאט לאט להוציא את הצינור ומבלי להפריע את השכבות, לקחת אותו בחזרה לארון הבטיחות הביולוגי.
- לאסוף את המעיל באפי (שכבה לבנה דקה מעונן), שבו PBMCs נמצאות, ממוקם בין PBS / פלזמה בזהירותnd שכבות ficoll בעזרת פיפטה העברה. הימנע מאיסוף שכבת סוכרוז ולא להפריע את שכבת תאי דם האדומה.
- העבר את המעיל באפי לתוך צינור חרוטי חדש 50 מיליליטר סטרילי. זה עלול לקחת כמה פעמים לחזור על צעד 1.8 לאסוף את כל PBMC.
- להוסיף PBS pH 7.4 לצינור עם PBMC ולמלא עד הסימן 45 מיליליטר. Shake צינור ביסודיות. לא מערבולת.
- שטוף 1: צנטריפוגה במשך 15 דקות ב XG 480 עם שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9. שימו לב היווצרות של גלולה של PBMCs בחלק התחתון של צינור חרוטי.
- מחק את PBS (supernatant) לתוך כוס פלסטיק עם 10 מיליליטר של אקונומיקה.
- שחרר תא גלולה בעדינות על ידי "צוברים" נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). לא מערבולת.
- להוסיף 25 מיליליטר של pH PBS הטרי 7.4 לצינור. אם צינור אחד או יותר נמצא בתהליך עיבוד, בריכת הכדורים יחד בשלב זה.
- לשטוף 2: צנטריפוגה צינור דקות 12 ב 480 XG with שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9.
- מחק את PBS (supernatant) לתוך כוס הפלסטיק עם התזה של אקונומיקה.
- בעדינות "מדף" נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). לא מערבולת.
- להוסיף 25 מיליליטר של PBS הטרי הצינור.
- להוציא 50 μl של התאים ולהעביר לתוך צינור microcentrifuge לספירת כדאיות.
- להוסיף סכום השווה (50 μl) של trypan כחול (כתם כדאיות) ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב בעדינות.
- להוציא 10 μl ולהעביר אותו לhemocytometer כדי לבדוק את הכדאיות של תאים לכל מיליליטר. רשום את מספר תאים / מיליליטר.
- להוציא את הכמות הרצויה של תאים וצנטריפוגות צינור דקות 12 ב 480 XG עם שתי ההאצה המרבית והאטה מוגדרת 9.
- מחק את PBS (supernatant) לתוך הכוס עם אקונומיקה.
- בעדינות "מדף" נגד פני השטח התנחשל (כלומר, מדף ריק). הוסף 80 μl של PBS לתוך הצינור.
2. ביצוע Slide PBMC
- מניחים 80 μl של התאים לשקופית מיקרוסקופ. למרוח הטיפה בעזרת שקופיות אחרת או להציב 2 טיפות של 40 μl כל בשני הקצוות של השקופית.
- השאר שקופיות בארון הבטיחות הביולוגית לייבוש. תווית השקופיות עם עיפרון בצד החלבית.
3. תיקון דוגמאות על השקופיות
- הכן את הפתרון מקבע על ידי הערבוב של 0.5 מיליליטר של פורמלדהיד 37% ל- 4.5 מיליליטר של 99% אתנול.
- לאחר השקופיות הן יבשות, להוציא 2 מיליליטר של הפתרון מקבע הטרי ושופכים אותו בשקופית, כך שכל פני השטח של השקופית מכוסה.
- השאר את הפתרון בשקופית 1 דקות. יש לשטוף את שקופית 1 דקות במים ברז ולהשאיר לייבוש באוויר.
4. ביצוע פתרון עמילאז לבקרה שלילית
- קח 0.25 גרם של אבקת עמילאז ולפזר ב 50 מיליליטר של diמים דוממים. יוצקים את הפתרון בכוס 100 מיליליטר נקייה.
- לטבול את השקופית בכוס כך שמחצית מהשקופית מקבלת טיפול ואת החצי השני נותר ללא טיפול ולאחר מכן דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (איור 1 ג).
- רשום באיזה צד של השקופיות מקבל טיפול עמילאז. למתוח קו על הגב של השקופית המציין את הגבול בין הטיפול והשליטה.
- שטוף את השקופיות עם DDH 2 O להסיר את פתרון עמילאז ולהשאיר את השקופיות לייבוש באוויר.
.5 בצע תקופתי חומצה שיף (PAS) מכתים והדמיה
הערה: ריאגנטים PAS רעילים על ידי שאיפה ומאכלים, ולכן הצעדים צריכים להיעשות במנדף הכימי, וחומרי הפסולת יש להשליכם כהלכה על פי הנחיות מוסדיות.
- מניחים את השקף על משטח שטוח ולשפוך 1.50-2.00 מיליליטר של חומצת פתרון התקופתי על המדגם. אינקובטורים לte במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
- יש לשטוף את השקופיות בכמה אישומים של מים מזוקקים.
- יוצקים 1.50-2.00 מיליליטר של המגיב של שיף בשקופית ודגירה אותו בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
- לשטוף את השקופית במים מזוקקים למשך 5 דקות ולהשאיר לייבוש באוויר.
- החל תקשורת הרכבה 10 μl בשקופית ומכסה בשני coverslips קטן, או להחיל 50 μl ולהשתמש coverslip אחד גדול.
- החל לק ברור בקצוות של coverslip, בואו לילה יבש.
6. השג תמונות עם משקפת האור מיקרוסקופ באמצעות מטרת 100X
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לאמת את חומרים כימיים וטכניקה בסיסית, צביעת PAS בוצעה בהתאם להוראות יצרן על חלקי שריר סולית עכבר. הצביעה נעשתה באותו יום כקורבן ובשלב האחרון של הצביעה, החלקים תוקנו על ידי קסילן. שריר הסוליה ידוע מכיל ~ תאי גליקוגן חיובי 35% 9. תאי השריר המוכתמים מוצגים שני גרגרי punctate תכונות- PAS-חיובי מובהקים בתוך התא, וקו רציף demarking קרום תא (איור 2 א). הנוכחות של גרגרי punctate עולה בקנה אחד עם מאגרי הגליקוגן, ומשמשת להגדרת תא שריר חיובי. טיפול בדגימות עם עמילאז הסירו את גרגרי punctate שעולה בקנה אחד עם אותם להיות גליקוגן (איור 2).
איור 2: PAS- חלקי שריר עכבר צבעוניים נותחו עם מיקרוסקופ אור. חלקי שריר סולית העכבר הוכתמו PAS. טופלו לפני כמה דוגמאות עם עמילאז. חלקיקי PAS-חיובי () היו גלויים בתוך תאי שריר. תאים חיוביים PAS פחות (B) נצפו כאשר חלקי השריר היו עם עמילאז שטופל מראש. ההכתמה סביב קרום התא נשארה לאחר טיפול עמילאז (בר = 100 מיקרומטר בקנה מידה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אות קרום המכתימה נשארה גם לאחר טיפול עמילאז. כצפוי, אחוז התאים PAS-חיוביים בסעיף השרירים שאינם עמילאז היה 37%, ואילו חלקי שריר עמילאז טופל באופן משמעותי פחות, כ 5 PAS-חיוביים% תאים (איור 3).
">
איור 3: כימות של תאי שריר PAS-חיובי חלקם של תאי שריר שהיו חיובי PAS נספר משקופית נציג בלי או עם עמילאז מראש הטיפול.. כצפוי, 37% מתאי שריר היו חיוביים לגליקוגן. טיפול עמילאז מופחת באופן משמעותי PAS-האות ל -4% (* p <0.001).
בשלב הבא, PAS מכתים בוצע על PBMC מהדם ורידים של בני אדם בריאים תוך שימוש בטכניקה שונה כמתואר בסעיף הפרוטוקול, ושמודגם באיור 1. PBMC דבק גם אם בוצעו פעולות כביסה בזהירות. PBMCs PAS המוכתמת מוצגת מגוון רחב של דפוסים מכתים. תאים קטנים (5 מיקרומטר) עם גרגירים נצפו בקלות. חלקם של תאים גדולים עם דפוס מכתים מפוזר גם נצפה (איור 4 א, והבלעת A.1-6 (איור 4).
איור 4:. חומצה שיף-תקופתית הכתמה (PAS) על PBMCs האנושי () PAS מכתים על PBMCs בוצע. שני סוגים של תאים נצפו. (A.1-6) תאים קטנים יותר (בשעה 5 מיקרומטר) בשקופיות שאינם מטופלים עמילאז הראו חלקיקי מגנט בקנה אחד עם גליקוגן. תאים אלה יכולים להיות במנוחה תאים. תאים גדולים (יותר מ 5 מיקרומטר) בתאים שטופלו לא-עמילאז היו מכתים PAS-חיובי מפוזר. תאים אלה יכולים להיות מופעלים לימפוציטים. טופלו PBMCs (B) עם עמילאז במשך 15 דקות לפני מכתים, שצמצם את אות PAS. הנציג של שבעה בני אדם בריאים שונים. (ג) PAS וhematoxyצביעת lin נעשתה בשקופית דם כולה. החץ מראה PBMC מוקף אריתרוציטים רבים (בסולם בר = 10 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
השיעור שהיה חיובי PAS היה 98% לתאים הקטנים יותר ו- 40% לתאים גדולים יותר. טיפול עמילאז ביטל את אות PAS בתאים הקטנים (p <0.001) ומשמעותי פחת PAS-האות בתאים הגדולים עד 7% (איור 5).
איור 5: כימות PBMCs PAS-חיובית שיעור PBMCs שהיו חיובי PAS נספר משקופית נציג בלי או עם עמילאז מראש הטיפול.. 98% מהתאים בגודל הקטנים היו חיוביים לPAS. 40% מהתאים גדולים יותר היו positive לPAS. טיפול עמילאז ביטל את אות PAS בתאים הקטנים (p <0.001) ומשמעותי פחת PAS-האות בתאים הגדולים עד 7% (p <0.001).
כדי לוודא שPBMCs להחזיק גליקוגן שיטה שנייה, עצמאית, שמספקת גם לכמת את כמות הגליקוגן שימש 10,11, וכבר פורסם בעבר ביופיטר על סוגי תאים אחרים 12. PBMCs היו lysed במאגר hypotonic וגליקוגן הופרד כתאר בקצרה בכיתוב של איור 6.
איור 6: מדידה של גליקוגן באמצעות עיכול אנזימטי עם אנזימי הידרוליזה. גליקוגן נמדד על פי הוראות יצרן. בקיצור, הפרוטוקול כרוך תמוגה hypotonic של 1 x 10 6 PBMCs אחרי pelleting של חומר מסיסהמכיל גליקוגן. גלולה נשטפה ומתעכלת עם אנזימי הידרוליזה מניב גלוקוז אשר נמדד על ידי spectrophotometry ובהשוואה לעקומה סטנדרטית. Lysate התא היה מדולל ביחסים מצויינים עם חיץ הידרוליזה. הנתונים הוא נציג של שלושה ניסויים. רמות משמעותיות של גליקוגן אותרו בדילול 1: 1 (p = 0.02), ואותות זה טיטרציה כlysate היה מדוללים נוסף.
גליקוגן מסיס נשטף מספר פעמים, ולאחר מכן מתעכל באמצעות אנזימי הידרוליזה. כמות הגלוקוז הניבה מעיכול נמדדה באמצעות spectrophotometry ובהשוואה לעקומה סטנדרטית. הייתה לי מיליון PBMCs 1.19 מיקרוגרם של גליקוגן. אות גליקוגן טיטרציה למטה כמו lysate התא הייתה מדוללת נוספת (איור 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים של מאמר זה וידאו היו במהלך טיפול כביסה ועמילאז של התאים. בזמן שטיפת השקופיות, צעד מפתח השתמש בבקבוק שטיפת סָחִיט פלסטיק ולתת את המים בעדינות להפעיל באמצעות המדגם בשקופית ולא מכוון ישירות על הדגימות. אפילו לחץ המים ישיר הקל היה לגרום לתאים לרדת שקופיות. עוד צעד מפתח היה להשתמש באותה השקופית ל± תנאי עמילאז. לאחר PBMCs דבקה בשקופיות, השקופיות הונחו בזהירות לתוך כוס, כך שרק מחצית מהמריחה נחשפה לפתרון עמילאז. צעד זה מספק שליטה חזקה, כי תאי הדם הם מאותו השקופיות, ובכך לצמצם משתנים מבלבלים שעלולה להתרחש כתוצאה משינויי עיתוי קלים. התאים תקועים גם ללא טיפול, ולכן העלות נוספת והזמן כרוך בציפוי גליקול פולי-L ליזין או פוליאתילן למשל לא תהיינה מוצדקת.
דרך TRoubleshooting הפעילות האופטימלית של עמילאז נקבע. עבור חלקי שריר, צוין כי הפעילות האופטימלית של עמילאז נצפתה בתוך שעה 1 של דגירה. בפעמים יותר חלקי השריר יהיו לאט לקלף את השקופית, ואילו בעמילאז זמנים קצר יותר לא הולם להסיר את PAS-האות. העיתוי לדגירת עמילאז לשקופיות PBMC היה צריך להיות מופחת ביחס לעיתוי שריר המדגם (שהיה שעה 1) עד 15 דקות בלבד. פעמים יותר גרמו PBMCs לרדת שקופיות, ואילו זמנים קצרים יותר לא יעיל להשפיע על PAS-האות. שינוי אחד לפרוטוקול הסטנדרטי של מכתים PAS היה שינוי שיטת שטיפת השקופיות. הוראות יצרן מצויינים לשטוף את השקופיות במים זורמים ברז, שגרמו לתאים לרדת שקופיות. השינוי היה לשטוף את השקופיות עם בקבוק שטיפת סָחִיט לשמר את התאים. כפי שתואר בסעיף השלבים הקריטי, זה היה מאוד חשוב שלא להחיל מים ישירותלחץ על התאים.
ישנן מספר מגבלות בטכניקה זו. קרום תא השריר היה מוכתם יחד עם גרגרי punctate בציטופלסמה של תא השריר. הגרגרים בוטלו על ידי טיפול עמילאז וסביר ולכן להיות גליקוגן, תוך הכתמת הקרום הייתה רגישה לעמילאז. זהותם של חלקיקי PAS-חיובי על קרום התא אינה ידועה. זה יכול להיות הקרום במרתף שריר (perimysium). קרום זה מקיף את fascicles השריר ובשל התכולה הגבוהה שלה גליקופרוטאין זה ידוע להיות PAS חיובי. מגבלה נוספת של צביעת PAS היא שגרגרי גליקוגן חייבים להיות לפחות 50 ננומטר בקוטר להיות גלויים על ידי מיקרוסקופ אור הרגילה. לפיכך, גרגרים קטנים יותר גליקוגן יכולים להיות נוכחים בתא, אבל עדיין להירשם שלילי במבחן PAS. השיטה השנייה משמשת מתגברת על מגבלה זו על ידי מתן גילוי של גליקוגן בlysate. בשילוב עם עקומת סטנדרט זה יכול לשמש כדי Determine הסכום של גליקוגן המדויק. למרות שטכניקה זו היא כימות מאוד ואינה מוגבלת על ידי הגודל של גרגרים, האם יש לו את עצמו מגבלות מסוימות. גרגרי גליקוגן הם מבני קנים מורכבים עם חלבוני אבזר רבים וקישורים צולבים כימיים, מה שהופך את זה סביר כי אנזימי הידרוליזה לפזר כל מולקולת הגליקוגן 13 באופן מלא. לפיכך, האנזימטית האיתור (כמו טכניקת PAS) עשוי לייצג-פי הסכום בפועל של גליקוגן במדגם. דרך אחת להתמודד עם מגבלה זו היא עם מיקרוסקופ אלקטרונים הפותר גם את גרגירי גליקוגן הקטנים ביותר 14. אחד יצטרך להעסיק שילוב של טכניקות אלה, PAS מכתים, עיכול אנזימטי, ומיקרוסקופיה אלקטרונית לאפיון המקיף ביותר של גליקוגן.
מאמר ווידאו זה מדגים את טכניקת הצביעה התקופתית חומצה שיף (PAS) מותאמת לשימוש על PBMCs. משמעותו של מחקר זה באה לידי ביטוי בבחירה של שימושPBMCs על משטח דם, אשר עשתה את זה אפשרי יותר למנות לימפוציטים. בתחילה, טכניקת דם למרוח קלאסית נבדקה, אולם רוב התאים בשקופית היו תאי דם אדומים ואולי נויטרופילים (איור 4C). להתרכז לימפוציטים, PBMCs היו מטוהרת מן הדם באמצעות טכניקת שיפוע צפיפות סטנדרטית. תוך שימוש בטכניקה דומה לדם-מריחה, PBMCs דבקה בקלות למשך הליך PAS, שבו יש הרבה שלבי כביסה נמרצים. טכניקת PAS הייתה בשימוש כבר עשרות שנים כדי לקבוע רמות הגליקוגן בביופסיות רקמת שריר, שנחתכים למקטעים דקים ודבקו בשקופיות. צביעת PAS נבחרה על כימיקלים צביעת פחמימות אחרים בשל האמינות הגבוהה שלה ואת הנוכחות של תוצאות צפויות בספרות. עכבר חלקים (spretus Mus) שריר שימשו כביקורת חיובית ומצאו, כצפוי, כי 37% מתאים היו PAS-חיובי 9. במונחים של עלות וזמן, הכנת PBMC הוא יותר מכביד יותר מאשר כתם דם, אבל יש כמה יתרונות. ראשית, ההכנה היא יותר מועשרת בלימפוציטים, שהם התאים של עניין לפרויקטים המתמקדים בתהליך אוטואימוני. אם מריחות דם שמשו, לימפוציטים יהיו המיעוט, מה שהופך את מאתגר למצוא את התא של עניין. אחד יצטרך להכין ולנתח הרבה יותר שקופיות כדי לקבל את אותם מספרים שהיית מקבל עם כמה שקופיות PBMC. חוקרים היינו מעוניינים מאוד בשימוש בטכניקה מותאמת החדשה שלנו בפרויקטים הקשורים לאוטואימוניות, סוכרת מסוג 1, טרשת נפוצה, זאבת, דלקת מפרקים שגרונית, וכו 'שבו לימפוציטים מסוג T ו- B ותאי NK לשחק תפקיד. כמובן, ליישומים אחרים שאריתרוציטים או נויטרופילים הם עניין כתם הדם יהיה מומלץ. היתרון השני הוא שPBMCs יכולה לשמש ללימוד ביולוגיה הלימפוציטים אנושי במבחנה.
מחקר מתמשך הוא חוקר את המקור של גליקוגן בPBMCs. אניn העתיד, מתוכנן למדוד תוכן הגליקוגן בהקשר של טרשת נפוצה, מחלה בתיווך הלימפוציטים T אוטואימונית המשפיעה על 2.3 מיליון אנשים ברחבי העולם מוערך כשל 2013 15,16. מה הם התאים הקטנים וגדולים בדגימות PBMC? תאים בשעה 5 מיקרומטר עולים בקנה אחד עם השושלת הלימפה במצב המנוחה שלהם. הלימפוציטים T, לימפוציטים מסוג B, תאי רוצח טבעיים, ותת קטין אחר נמצאים בטווח הגודל הזה. PBMCs הגדולה יותר סביר מורכבת של לימפוציטים הופעל, אשר לגדול כפי שהם מקבלים אותות דלקתיים מהמערכת החיסונית, ומונוציטים משושלת מיאלואידית. טכניקות תא מיון מתקדמות כגון מיון תא ניאון מופעל או מיון תא-מגנטי הופעל נדרשות לחדד את המשנה שמבטא גליקוגן נוסף.
צביעה נגד Hematoxylin שימשה בעת הצביעה נעשתה על כל דם. זה אפשר לנו להבחין מונוציטים מאריתרוציטים (4C איור). כאשר הצביעה נעשתה על PBMCs, שכן כל התאים היו mononuclear, לא היה צורך לפעול נגד כתם עם hematoxylin לזהות תאים. גם hematoxylin הייתה מתנגשת עם אות PAS בתאים. לסיכום, יש לנו הפגנו הליך PAS מכתים המותאם לPBMCs. טכניקה זו שימושית למדענים ורופאים חוקרים אוטואימוניות, זיהום ואלרגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Periodic Acid Shiff Kit |  Sigma-Aldrich |
395B | Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution. |
| α-Amylase from porcine pancreas | Sigma-Aldrich |
A3176 | |
| Binocular Microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogen Assay Kit | Sigma-Aldrich |
MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare |
17-1440-02 | Nonionic synthetic polymer of sucrose. |
| Centrifuge | For PBMC isolation, swing buckets were used. |
References
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Biochemistry. 11 (14), 2627-2633 (1972).
- Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
- Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
- Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
- Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
- Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
- Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
- Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
- Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
- Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
- Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M.
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
- Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
- Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
- Multiple Sclerosis International Federation Atlas of MS. , Available from: http://www.atlasofms.org (2013).
