過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Introduction

過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色は広く、筋肉の研究および診断に使用されている免疫組織化学的手法である。また、血液サンプルの診断ツールとして利用されている。技術は無色シッフ試薬、それにより深いマゼンタ生成物を生成物と反応アルデヒド基を生成する多糖類内のユニットを酸化したサンプルに過ヨウ素酸ナトリウム溶液を適用することによって機能する。この手順のステップは、図1に示されている。汚れが多糖部分を有するグリコーゲン、糖タンパク質、糖脂質、ムチン、または他の分子を含む多糖類マゼンタで何をオン。

PAS染色は、多くの場合、筋線維におけるグリコーゲンレベルを測定するために使用される。筋肉組織切片彼らはしっかりとスライドに付着し、複数の洗浄と染色工程に耐えるような技術に最適です。グリコーゲンは、高い需要があり、タイプII筋線維、速筋の中で最も存在する最大パフォーマンス^1,2のためのグリコーゲンを必要とする迅速なATP産生のために。グリコーゲンは、グリコーゲンホスホリラーゼ酵素の作用を介して遊離グルコースに分解することができるグルコースの分岐ポリマーである。栄養不足や高エネルギー需要の時代にしながら、休息と栄養自給の時代には、グリコーゲンは、グリコーゲン合成のプロセスを経て補充される。グリコーゲンは、グリコーゲン分解によるグルコースに分解される。血液サンプル上で、早ければ1950年の臨床医科学者が調査してきたように、PAS染色からは、様々な疾患^3-7のグリコーゲン含有量を分析する。例えば、ポンペ病、真正グリコーゲン貯蔵において、疾患白血球は健常対照⁸と大きく異なるグリコーゲンを大量に蓄積する。

このビデオ資料は、末梢血単核細胞（PBMC）健常なヒト被験者の静脈血からのサンプル上で使用するためのPAS染色の適合したバージョンを示す。 PBMCsは主にTリンパ球のリンパ球およびBリンパ球のファミリー、ならびにナチュラルキラー細胞および単球のような他の免疫細胞を含む。最初の精製工程は、赤血球、好中球、および他の顆粒球を除去する。この技術は、全血塗抹標本を使用する場合と比較して、PAS陽性細胞のより堅牢な列挙を可能にするリンパ球の濃縮された割合のデータを提供する。

図1：PBMC上のPAS染色の段階の方法論によって、工程（A）まず、PBMCの単離はFicoll勾配を介して達成されるが、左側のパネルには、遠心分離前の準備を示し、右側のパネルには、遠心分離後にそれを示してPBMCを含む軟膜チューブの中心に観察される。（B）単離されたPBMCは、ホルマリン、エタノール固定剤ソリューを用いてスライド上に固定されているる。スライドを穏やかにプラスチック洗浄瓶からの蒸留水で洗浄する。（C）スライドは、次に、グリコーゲンを溶解するアミラーゼ溶液で満たされた100mlビーカー途中に配置される。スライドを穏やかにリンスした。（D）スライドは糖の酸化が起こる周期的な酸溶液で処理される。スライドを軽くすすぐ。これは、過剰の過ヨウ素酸を除去し、酸化工程を停止します。（E）シッフ試薬をスライドに添加される場合には、酸化工程中に作成されたアルデヒドと反応する。この無色の試薬は、その後、深い赤マゼンタ製品になります。スライドを静かに過剰シッフ試薬を除去するために洗浄する。

Protocol

ヒト血液サンプルを用いた研究がコンコルディア大学倫理審査委員会、証明書番号10000618.によってコンコーディア大学倫理審査委員会、証明書番号2010BERGによって承認されたマウス筋肉の作業を承認されました。

全血から1 PBMC単離

注：無菌技術と製造業者滅菌装置を使用してバイオセーフティキャビネットには、この手順を行ってください。

1. 慎重に50ミリリットルの滅菌コニカルチューブにヘパリン化（抗凝固剤）採血管からの全血を10〜15ミリリットル注ぐ。マイナー血液の流出の場合は、クリーニングティッシュを使用してのddH ₂ O、70％EtOHで拭いてください。
2. リン酸緩衝生理食塩水（PBS 1X）pHが7.4と1：1の比率にコニカルチューブ内の血液を希釈します。最大総容量は30ミリリットルを超えないようにしてください。
3. 気泡を避け血清学的ピペットガンを使用して穏やかに混合。
   注：血aを避けるためにチューブを反転させて混合しないでください遠心分離中キャップとその後の浸透でccumulation。
4. 新しい50ミリリットル容量のコニカルチューブに、（ 材料および機器の表を参照）フィコール-パックの13ミ ​​リリットルを追加します。ラックにチューブを直立してください。
5. トランスファーピペットを用いて、希釈した血液を取る、上部付近のチューブの内壁に転送ピペットチップをタッチします。ゆっくりと安定した圧力で、スクロースの層の上に血液層を形成する管の内壁に沿って血液を移す。すべての血液が転送されるまで、この手順を数回行います。
6. 5に培地加速度を設定したスイングローターで700×gで30分間室温でチューブをしっかりと遠心チューブにキャップをし、ZEROに設定された減速。
7. ゆっくりとチューブを取り出し、層を乱すことなく、バイオセーフティキャビネットにそれを取り戻す。
8. 慎重にPBS /プラズマAの間に置かれたPBMCが配置されているバフィーコート（薄曇った白層）を、収集、ndはフィコール層をトランスファーピペットを使用して。スクロース層を収集回避し、赤血球細胞層を乱さない。
9. 新しい50ミリリットルの滅菌コニカルチューブに軟膜を転送します。これは、すべてのPBMCを収集するステップ1.8を繰り返し数回を取ることができる。
10. PBMCとのチューブにpH7.4のPBSを追加し、45ミリリットルのマークに埋める。徹底的にチューブを振る。ボルテックスしないでください。
11. 1を洗う：9に設定された最大加速と減速の両方で480×gで15分間遠心操作は、円錐管の底にPBMCのペレットの形成を観察します。
12. 漂白剤の10ミリリットルプラスチックビーカーにPBS（上清）を捨てる。
13. 優しく凹凸面（ すなわち、空のラック）に対して「ラッキング」によって細胞ペレットを緩めます。ボルテックスしないでください。
14. チューブに新鮮なPBS pHが7.4の25ミリリットルを追加します。複数の管が処理されている場合は、このステップで一緒にペレットをプールする。
15. ウォッシュ2：遠心分離機480のXGのWiで12分間チューブ9に設定された最大加速と減速の両方目。
16. 漂白剤のスプラッシュプラスチックビーカーにPBS（上清）を捨てる。
17. 凹凸面にゆっくりと「ラック」（ すなわち、空のラック）。ボルテックスしないでください。
18. チューブに新しいPBSの25ミリリットルを追加します。
    1. 50μlの細胞を取り出し、生存能力カウント用のマイクロ遠心チューブに移す。
    2. 穏やかに混合するには、上下パンブルー（生存能力染色）とピペットの等しい量（50μl）を追加します。
19. 10μLを取り出し、1ml当たり細胞の生存率をチェックするために、血球計数器に転送します。細胞/ mlの数を記録します。
20. 細胞の所望の量を取り出し、9に設定された最大加速と減速の両方で480×gで12分間遠心操作を行なう。
21. 漂白剤を入れたビーカーにPBS（上清）を捨てる。
22. 凹凸面にゆっくりと「ラック」（ すなわち、空のラック）。 8を追加チューブにPBSを0μlの。

2. PBMCスライドを作る

1. 顕微鏡スライド上に細胞を80μlのを置きます。別のスライドの助けを借りて、ドロップを塗抹またはスライドの両端に40μlの各2滴を配置。
2. 乾燥するために生物学的安全キャビネット内でスライドしたままにします。つや消し側の鉛筆でスライドにラベルを付けます。

3.スライド上のサンプルの修正

1. 4.5ミリリットルの99％エタノール、37％ホルムアルデヒドの0.5ミリリットルを混合して固定液を準備します。
2. スライドを乾燥した後、新たに作製した固定液2 mlを取り出し、スライドの表面全体を覆​​うようにスライドの上に注ぐ。
3. 1分間のスライドで解決策をしておきます。水道水で1分間のスライドをすすぎ、空気乾燥に任せる。

4.ネガティブコントロールのためのアミラーゼのソリューションを作る

1. アミラーゼ粉末を0.25gを取り、ジ50mlに溶解静め水。清潔な100mlビーカー内の溶液を注ぐ。
2. スライドの半分は治療を受け、残りの半分は、未処理のままにした後、室温（ 図1C）で15分間インキュベートするようにビーカー中でスライドを浸す。
3. アミラーゼ治療を受けているスライドのどちら側にメモしておいてください。治療群と対照との間の境界を示すスライドの背面に線を引きます。
4. アミラーゼ溶液を除去し、空気乾燥したスライドを残してのddH ₂ Oでスライドを洗浄します。

5.過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色および撮影を行う

NOTE：PAS試薬は吸入により毒性があり、腐食性であるため、ステップは、化学ドラフト内で行われる必要があり、廃棄物が適切に機関のガイドラインに従って廃棄しなければならない。

1. 平らな面にスライドを置き、試料上で定期的な酸溶液の1.50〜2.00ミリリットルを注ぐ。 Incuba室温で5分間テ。
2. 蒸留水のいくつかの料金のスライドを洗浄します。
3. スライドにシッフ試薬の1.50〜2.00ミリリットルを注ぎ、15分間室温で静置する。
4. 5分間蒸留水でスライドを洗浄し、空気乾燥に任せる。
5. スライド上の10μlの取り付けメディアを適用し、二つの小さなカバーガラスでカバーし、または50μlのを適用し、一つの大きなカバーガラスを使用しています。
6. 一晩乾燥させて、カバースリップの端に明確なマニキュアを適用します。

6. 100X対物レンズを用いて双眼光学顕微鏡で画像を得る

Representative Results

試薬及び基本技術を検証するために、PAS染色をマウスヒラメ筋切片に、製造業者の指示に従って行った。染色は犠牲と同じ日に行われた染色の最後のステップで、切片をキシレン中で固定した。ヒラメ筋は^9〜35％のグリコーゲン陽性細胞を含むことが知られている。染色された筋細胞は、2つのセル内の異なるPAS陽性と特長点状顆粒、および細胞膜（ 図2A）の境界を定める連続線を示した。点状の顆粒の存在は、グリコーゲン貯蔵と一致して、正の筋細胞を定義するために使用された。アミラーゼの試料の処理は、彼らがグリコーゲン（ 図2B）であることと一致している点状の顆粒を削除しました。

図2：PAS-染色されたマウスの筋肉切片を光学顕微鏡で分析した。マウスのヒラメ筋切片をPASで染色した。いくつかのサンプルは、アミラーゼで前処理した。（A）PAS陽性粒子は、筋細胞の内部で見えた。筋肉切片はアミラーゼで前処理したとき（B）少ないPAS陽性細胞が観察された。細胞膜の周りの染色はアミラーゼ処理（スケールバー= 100μm）の後に残った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

膜染色シグナルもアミラーゼ処理後に残った。予想されるようにアミラーゼを治療しながら、非アミラーゼ筋節のPAS陽性細胞の割合は、37％であった筋肉切片では有意に少ない、約5％のPAS陽性細胞（ 図3）を有していた。

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図3：PAS陽性筋細胞の定量 PASポジなしまたはアミラーゼの前処理で代表スライドからカウントした筋細胞の割合。予想されるように、筋細胞の37％は、グリコーゲン陽性であった。アミラーゼ処置は4％た（* p <0.001）のPAS信号を減少させた。

次に、PAS染色プロトコルの項で説明するように修正された技術を用いて、健常なヒト被験者の静脈血からPBMCに対して実施し、 図1に示された。洗浄工程を注意深く行った場合PBMCはよく接着した。 PAS染色したPBMCを染色パターンの様々な表示された。顆粒と小さなセル（5μm）を容易に観察された。びまん性染色パターンを有するより大きな細胞の割合も観察された（ 図4A、及び挿入図A.1-6 図4B）が減少した。

図4：PBMCは上のヒトPBMCにおける素酸-シッフ（PAS）染色（A）PAS染色を行った。二種類の細胞が観察された。非アミラーゼ処理したスライドで（A.1-6）小さなセル（5〜AT）はグリコーゲンと一致マゼンタ粒子を示した。これらの細胞は、細胞休止することができた。非アミラーゼ処理細胞における大きなセル（5μm以下）は、びまん性PAS陽性染色を持っていた。これらの細胞は、リンパ球を活性化することができた。（B）PBMCを前PAS信号を減少染色、15分間、アミラーゼで処理した。 7別の健康なヒト被験者の代表。（C）PASとhematoxy林染色は、全血のスライド上で行う。矢印は、多くの赤血球（スケールバー=10μm）を囲まれたPBMCを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

PAS陽性の割合は小さい細胞については98％、より大きなセルのための40％であった。アミラーゼ処理は、小細胞た（p <0.001）でPAS信号を排除し、著しく7％（ 図5）に大きなセルでPAS信号を減少した。

図5：PAS陽性PBMCの定量 PAS陽性であったPBMCの割合は、アミラーゼ前処理なしかで代表スライドからカウントした。小型の細胞の98％がPAS陽性であった。大きなセルの40％は、pだったPASのためositive。アミラーゼ処理は、小細胞た（p <0.001）でPAS信号を排除し、著しく7％た（p <0.001）、より大きな細胞におけるPAS信号を減少した。

PBMCを有していることを確認するためにもグリコーゲンの量の定量化を提供する第2の、独立したメソッドは^10,11を使用したグリコーゲン、および以前に他の細胞型¹²にJoveのに掲載されました。 PBMCを低張緩衝液中に溶解させ、 図6のキャプションに簡単に記載されるようにグリコーゲンを分離した。

図6：加水分解酵素による酵素消化を使用してグリコーゲンの測定 。グリコーゲンは、製造業者の指示に従って測定した。簡単に説明すると、プロトコルは、不溶性物質のペレット化に続いて、1×10 ⁶ PBMCの低張溶解を伴うそれは、グリコーゲンが含まれています。ペレットを洗浄し、分光光度法により測定し、標準曲線と比較したグルコースをもたらす加水分解酵素で消化した。細胞溶解物は、加水分解緩衝液で示される比率で希釈した。データは3回の実験の代表である。グリコーゲンの有意なレベルは1で検出された：1希釈した（p = 0.02）、及び溶解液として滴定この信号は、さらに希釈した。

不溶性グリコーゲンを数回洗浄した後、加水分解酵素を用いて消化した。消化から得られたグルコースの量は、分光光度法を用いて測定し、標準曲線と比較した。百万個のPBMCをグリコーゲンの1.19μgのを持っていた。細胞溶解物として滴定グリコーゲン信号はさらに（ 図6）で希釈した。

Discussion

このビデオ記事の重要なステップは、細胞の洗浄およびアミラーゼ治療中であった。スライドを洗浄しながら、重要なステップは、プラスチック製のスクイーズ洗浄瓶を使用して、水が軽くスライド上のサンプルを介して実行させると、サンプル上に直接狙っていなかった。少しでも直接水圧は、細胞がスライドをオフに来てしまいます。もう一つの重要なステップは、±アミラーゼ条件に同じスライドを使用することであった。 PBMCをスライドに付着させた後、スライドを注意深くのでスミアの半分だけがアミラーゼ溶液に曝露したビーカーに入れた。血液細胞は、このようにわずかなタイミングのばらつきに起因し発生する可能性が交絡変数を最小限に抑え、同じスライドからであるため、この手順はロバスト制御を提供します。細胞は無処理とよく立ち往生ので、例えばポリ-L-リジンまたはポリエチレングリコールコーティングに関わる追加費用と時間が保証されないであろう。

TRを通してアミラーゼの最適な活性をoubleshootingを決定した。筋肉切片のためには、アミラーゼの最適活性は、インキュベーションの1時間以内に観察されたことが注目された。短い時間のアミラーゼで十分にPAS-信号を除去しなかった長い時間では筋肉のセクションでは、ゆっくりと、スライドをはがしでしょう。 PBMCスライド用アミラーゼのインキュベーションのタイミングは、15分まで（1時間であった）筋肉サンプルタイミングに対して減少されなければならなかった。長い時間が短い時間で効果的にPAS-信号に影響を与えなかったがPBMCを、スライドをオフに来ていました。 PAS染色の標準プロトコルの一つの修正は、スライドを洗浄する方法を変えた。製造業者の指示書は、細胞がスライド外れ引き起こされ、水道水でスライドを洗浄することが示された。修飾は、細胞を保存するために絞れる洗浄瓶でスライドを洗浄した。重要な工程の項で説明したように、水を直接適用しないことが非常に重要であった細胞への圧力。

この手法では、いくつかの制限があります。筋細胞膜は、筋細胞の細胞質における点状の顆粒と一緒に染色した。膜染色はアミラーゼに鈍感であった顆粒は、アミラーゼ処理により除去し、したがってグリコーゲンである可能性が高かった。細胞膜上のPAS陽性粒子の同一性は知られていない。それは、筋肉の地下（筋周膜）膜である可能性があります。この膜は、筋線維束を取り囲み、その高い糖タンパク質含有量には正のPASであることが知られている。 PAS染色の他の制限は、グリコーゲン顆粒は、従来の光学顕微鏡によって見えるように、直径が少なくとも50nmでなければならないことである。したがって、より小さなグリコーゲン顆粒が細胞中に存在することができ、それでもPAS試験で陰性の登録。使用される第二の方法は、溶解物中のグリコーゲンの検出を提供することによってこの制限を克服する。標準曲線との組み合わせでは、これは、DETEするために使用することができグリコーゲンの正確な量をrmine。この技術は、高度に定量化可能であり、顆粒のサイズによって制限されないが、それ自体が特定の制限がありません。グリコーゲン顆粒は、それがそう加水分解酵素が完全に全体のグリコーゲン分子^13を溶解することを作り、多くの補助タンパク質や化学架橋を持つ複雑な分岐構造である。したがって、（PAS技法のような）、酵素検出は、サンプル中のグリコーゲンの実際の量を過小表すことができる。この制限に対処する一つの方法は、最も小さなグリコーゲン顆粒^14を解決し、電子顕微鏡である。一つは、これらの技術の組み合わせを使用することがグリコーゲンの最も包括的な特徴付けのためのPAS染色、酵素消化、および電子顕微鏡を有するであろう。

この記事とビデオは、PBMCに対して使用に適合素酸シッフ（PAS）染色技術を実証する。本研究の意義は、使用しての選択に見られるそれがより実現可能なリンパ球を列挙するために作られた血液塗抹標本上のPBMCを、。最初に、古典的な血液塗抹法を試験し、スライド上の細胞の大部分が、赤血球およびおそらく好中球（ 図4C）であった。リンパ球を濃縮するために、PBMCを、標準的な密度勾配法を用いて血液から精製した。血液塗抹標本と同様の手法を用いて、PBMCを、容易に多くの積極的な洗浄工程を有するPAS手順の持続時間付着。 PAS技法は、薄い切片に切断し、スライドに付着されている筋肉組織生検、内グリコーゲンレベルを決定するために何十年も使用されてきた。 PAS染色は、その高い信頼性と文学の期待される結果が存在するために他の炭水化物染色化学物質の上に選ばれました。マウス（ ハツカネズミspretus）筋肉切片は、細胞の37％がPAS陽性⁹であったことを、予想通り、陽性対照として使用し、発見された。コストや時間の面で、PBMを準備Cは、血液塗抹標本よりも厄介であるが、いくつかの利点がある。第一に、準備は自己免疫を中心にプロジェクトのための目的の細胞であるリンパ球、より濃縮されている。血液塗抹標本が使用された場合、リンパ球は、それが困難な目的の細胞を見つけることが、少数派だろう。一つは、あなたが数PBMCスライドになるだろうと同じ番号を取得するためにはるかに多くのスライドを準備し、分析しなければならないでしょう。研究者らは、TおよびBリンパ球およびNK細胞が役割を果たしている場所など 1型糖尿病、多発性硬化症、狼瘡、関節リウマチを、タイプに関連自己免疫プロジェクトにおける私たちの新しい最適化された技術を使用することに非常に興味がある。もちろん、赤血球や好中球が関心のある他のアプリケーションのために、血液塗抹標本が推奨される。他の利点は、PBMCをin vitroでヒトリンパ球の生物学を研究するために使用することができることである。

進行中の研究は、PBMC中のグリコーゲンの源を調査している。私nの未来は、それは多発性硬化症、2013年^15,16のように全世界で推定230万人に影響したTリンパ球媒介性自己免疫疾患の文脈におけるグリコーゲン含有量を測定するために計画されている。 PBMCサンプル中の小規模および大規模の細胞は何ですか？ 5ミクロンの細胞は、それらの静止状態におけるリンパ系と一致している。 Tリンパ球、Bリンパ球、ナチュラルキラー細胞、および他の少量のサブセットは、この大きさの範囲内である。大きなPBMCはおそらく、彼らは骨髄系統から炎症性免疫システムからの信号、および単球を受け取るように大きく成長活性化リンパ球、から構成されている。このような蛍光活性化セルソーティングまたは磁気活性化細胞選別などの高度な細胞選別技術がさらにグリコーゲンを表現するサブセットを洗練するために必要とされている。

染色は、全血で行われたときにヘマトキシリン​​対比染色を用いた。これは（赤血球から単球を区別することができました図4C）。全ての細胞が単核であったので、染色は、PBMCに対して行われたとき、細胞を同定するためにヘマトキシリン​​で染色対抗する必要はなかった。また、ヘマトキシリン​​は細胞内のPAS信号と干渉した。要約すると、我々は、PBMCをするように適合さPAS染色手順を示した。この手法は、自己免疫、感染症やアレルギーを研究科学者や臨床医のために便利です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.