Introduction
Schiff (PAS) coloração ácido periódico é uma técnica de imuno-histoquímica, que é amplamente utilizado em pesquisas e diagnósticos muscular. Também é utilizada como uma ferramenta de diagnóstico em amostras de sangue. A técnica funciona através da aplicação de uma solução de ácido periódico à amostra, que oxida unidades dentro dos grupos de aldeído de polissacárido criando que reagem com o reagente de Schiff incolor produzindo assim um produto de magenta profunda. Os passos deste processo são mostrados na Figura 1. A mancha transforma nada com polissacarídeos de glicogénio magenta, incluindo, glicoproteínas, glicolipidos, mucinas, ou outras moléculas com porções de polissacáridos.
Coloração PAS é muitas vezes usado para medir os níveis de glicogênio nas fibras musculares. Cortes de tecidos músculos são ideais para a técnica como eles firmemente anexar ao slide e suportar múltiplas etapas de lavagem e de coloração. O glicogênio é mais presente em contração rápida fibras musculares tipo II, que possuem uma alta demandapara a produção de ATP rápida exigindo glicogênio para 1,2 desempenho máximo. O glicogénio é um polímero ramificado de glucose que pode ser quebrada em glicose livre através da acção de enzimas de fosforilase de glicogénio. Em tempos de descanso e nutricional-suficiência, o glicogênio é reabastecido através do processo de glycogenesis, enquanto que em tempos de insuficiência nutricional ou de alta demanda de energia; glicogênio é quebrada em glicose por glicogenólise. Já a partir de 1950 os cientistas têm explorado clínico PAS coloração em amostras de sangue para analisar o conteúdo de glicogênio em várias doenças 3-7. Por exemplo, na doença de Pompe-um armazenamento de glicogénio genuíno glóbulos brancos doen- ças acumular grandes quantidades de glicogénio que difere significativamente dos controles saudáveis 8.
Este vídeo-artigo demonstra uma versão adaptada de coloração PAS para uso em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir de amostras de sangue venoso de seres humanos saudáveis. PBMCs contêm principalmente linfócitos do linfócito T e B de linfócitos famílias, bem como outras células imunitárias, tais como as células assassinas naturais e monócitos. O primeiro passo de purificação remove os eritrócitos, neutrófilos, granulócitos e outros. Esta técnica fornece dados sobre uma parte do concentrado para a enumeração de linfócitos que permitem mais robusta de células-PAS positivo em relação ao meio de esfregaços de sangue total.
Figura 1:. Passo a metodologia passo de coloração PAS em PBMC (A) Em primeiro lugar, o isolamento de PBMC é conseguido através de um gradiente de Ficoll, no painel da esquerda mostra a preparação antes da centrifugação, o painel direito mostra que após centrifugação, onde o buffy coat contendo as PBMC Observa-se no centro do tubo. (B) isoladas PBMC são fixadas sobre a lâmina utilizando solu fixador formalina-etanolção. A lâmina é cuidadosamente enxaguada com água destilada a partir de um frasco de lavagem de plástico. (C) A lâmina é então colocada em 100 ml de um meio caminho copo cheio com solução de amilase, que irá dissolver glicogénio. A lâmina é lavada delicadamente. (D) A lâmina é tratado com solução de ácido periódico, onde oxidação de sacarídeos ocorre. As lâminas são lavadas suavemente; isto irá remover o excesso de ácido periódico e parar o passo de oxidação. (E) Quando o reagente de Schiff é adicionada às lâminas, que vai reagir com aldeídos criados durante o passo de oxidação. Este reagente incolor irá então resultar em um produto magenta vermelho escuro. As lâminas são lavadas suavemente para remover o excesso de reagente de Schiff.
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Protocol
A pesquisa com amostras de sangue humano foi aprovado pela Concordia University Ética Review Board, número do certificado 10000618. O trabalho no músculo do rato foi aprovado pela Concordia University Ética Review Board, número do certificado 2010BERG.
1. PBMC Isolamento de Sangue Total
NOTA: Realizar este procedimento em uma cabine de segurança biológica utilizando uma técnica estéril e equipamentos esterilizados pelo fabricante.
- Com cuidado, despeje 10-15 ml de sangue total a partir dos tubos de heparina (anticoagulante) de coleta de sangue em um tubo de 50 ml estéril. Para derramamentos de sangue menores, limpe com DDH 2 O e 70% EtOH usando tecido de limpeza.
- Dilui-se o sangue no tubo cónico para uma proporção de 1: 1 com Solução Salina de Tampão Fosfato (PBS 1x), pH 7,4. Certifique-se de que o volume máximo total não exceda 30 ml.
- Misture delicadamente usando uma pistola de pipeta sorológica evitar bolhas.
NOTA: Não misture invertendo o tubo para evitar o sangue de umccumulation na tampa e infiltração subsequente durante a centrifugação. - Adicionar 13 ml de Ficoll-Paque (ver Materiais e Equipamento tabela), para um novo tubo cónico de 50 ml de capacidade. Mantenha o tubo na posição vertical no rack.
- Usando uma pipeta, tomar sangue diluído, tocar com a ponta da pipeta de transferência para a parede interior do tubo perto do topo. Com pressão constante e lenta, a transferência do sangue ao longo da parede interior do tubo, formando uma camada de sangue no topo da camada de sacarose. Faça este passo várias vezes até que todo o sangue foi transferido.
- Tampe o tubo bem e centrifugar o tubo à temperatura ambiente por 30 minutos a 700 xg em um rotor balanço com set aceleração média a 5, e desaceleração de zero.
- Lentamente, retire o tubo e sem perturbar as camadas, levá-la de volta para a cabine de segurança biológica.
- Recolher cuidadosamente o creme leucocitário (camada branca nublado fina), onde estão localizados PBMC, colocado entre a PBS / plasma umand ficoll camadas utilizando uma pipeta de transferência. Evite coleta camada de sacarose e não perturbe a camada de células vermelhas do sangue.
- Transferir o creme leucocitário para um novo tubo de 50 ml estéril. Pode demorar várias vezes de repetir o passo 1.8 para coletar todo o PBMC.
- Adicionar PBS pH 7,4 para o tubo com a PBMC e encha até à marca de 45 ml. Agitar minuciosamente tubo. Não vortex.
- Lavar 1: Centrifugar durante 15 minutos a 480 xg tanto com aceleração e desaceleração máxima definida para 9. Observar formação de um sedimento de PBMC na parte inferior do tubo cónico.
- Descartar o PBS (sobrenadante) para um copo de plástico com 10 ml de lixívia.
- Solte pellet celular com cuidado "quebrando" contra uma superfície ondulada (ie, rack de vazio). Não vortex.
- Adicionar 25 ml de PBS fresco de pH 7,4 ao tubo. Se mais de um tubo está a ser processado, reunir os peletes juntamente neste passo.
- Lave 2: Centrífuga o tubo por 12 min a 480 xg with tanto aceleração máxima e desaceleração definir a 9.
- Descarte o PBS (sobrenadante) no copo de plástico com um esguicho de água sanitária.
- Gently "cremalheira" contra uma superfície ondulada (ie, rack de vazio). Não vortex.
- Adicionar 25 ml de PBS fresco ao tubo.
- Retire 50 ul de células e transferir para um tubo de microcentrífuga para contagem de viabilidade.
- Adicionar um montante igual (50 ul) de azul de tripan (a mancha de viabilidade) e pipeta cima e para baixo para misture delicadamente.
- Retire 10 ul e transferi-lo para um hemocitômetro para verificar a viabilidade de células por ml. Grave o número de células / ml.
- Retirar a quantidade desejada de células e centrifugar o tubo durante 12 minutos a 480 xg tanto com aceleração e desaceleração máxima definida para 9.
- Descarte o PBS (sobrenadante) no copo com água sanitária.
- Gently "cremalheira" contra uma superfície ondulada (ie, rack de vazio). Adicionar 80 mL de PBS para o tubo.
2. Fazer o slide PBMC
- Colocar 80 ul de células numa lâmina de microscópio. Manchar a gota, com a ajuda de uma outra corrediça ou colocar duas gotas de 40 ul cada uma em ambas as extremidades da corrediça.
- Deixe slide na cabine de segurança biológica para secar. Rotular o slide com um lápis no lado fosco.
3. Fixação das amostras nos slides
- Preparar a solução fixadora por mistura de 0,5 ml de formaldeído a 37% de etanol 4,5 ml de 99%.
- Depois as lâminas são secas, tirar 2 ml da solução fixadora frescos e derramar sobre a corrediça de modo que toda a superfície da lâmina é coberta.
- Deixe a solução no slide por 1 min. Lave o slide para 1 min com água corrente e deixe-o secar ao ar.
4. Fazer a Solução Amylase para Controle Negativo
- Tome 0,25 g de pó de amilase e dissolver em 50 ml de diágua estava calma. Despeje a solução em um ambiente limpo 100 ml.
- Imergir a corrediça no recipiente de forma a que metade da corrediça recebe o tratamento e a outra metade permanece sem tratamento e depois incubar durante 15 min à temperatura ambiente (Figura 1C).
- Tome nota de que lado do slide está recebendo o tratamento amilase. Desenhar uma linha na parte de trás da lâmina que indica a fronteira entre o tratamento e controlo.
- Lavam-se as lâminas com ddH2O para remover a solução de amilase e deixar a lâmina de ar seco.
5. Execute Ácido Periódico de Schiff (PAS) Coloração e Imagem
NOTA: reagentes PAS são tóxicas por inalação e são corrosivos, por isso os passos precisam ser feitos em um exaustor química, e os resíduos devem ser eliminadas de acordo com as diretrizes institucionais.
- Coloque o slide em uma superfície plana e despeje 1,50-2,00 ml de solução de ácido periódico sobre a amostra. Incubate durante 5 min à temperatura ambiente.
- Lavar as lâminas em várias acusações de água destilada.
- Pour 1,50-2,00 ml de reagente de Schiff sobre a lâmina e incubar-la à temperatura ambiente durante 15 min.
- Lava-se a lâmina com água destilada durante 5 minutos e deixa-se secar ao ar.
- Aplicar 10 jul meios de montagem no slide e cubra com duas pequenas lamelas ou aplicar 50 ul e utilizar uma lamela grande.
- Aplique unha polonês claro nas bordas da lamínula, deixe secar durante a noite.
6. obter imagens com a luz do microscópio binocular Usando o Objetivo 100X
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Representative Results
Para validar os reagentes e técnica básica, coloração PAS foi realizada de acordo com as instruções do fabricante sobre seções musculares rato sóleo. A coloração foi feita mesmo dia que o sacrifício e no último passo da coloração, as secções foram fixadas por xileno. O músculo sóleo é conhecido por conter ~ 35% de glicogénio-positiva células 9. As células musculares coradas exibido duas grânulos puntiformes Features- PAS positivo distintas dentro da célula, e uma linha contínua demarking da membrana celular (Figura 2A). A presença de grânulos puntiformes é consistente com as reservas de glicogénio, e foi utilizado para definir uma célula muscular positiva. Tratamento das amostras com amilase removidos os grânulos puntiformes que é consistente com eles, sendo glicogénio (Figura 2B).
Figura 2: PAS seções musculares manchadas de rato foram analisados com microscopia de luz. seções musculares Rato sóleo foram coradas com PAS. Algumas amostras foram pré-tratadas com amilase. (A) partículas de PAS positivo eram visíveis dentro das células musculares. (B) células positivas Menos PAS foram observados quando as secções do músculo foram pré-tratadas com amilase. A coloração em torno da membrana celular permaneceu após o tratamento amilase (escala bar = 100 mm). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O sinal de coloração de membrana-permaneceu mesmo após tratamento amilase. Como esperado, a percentagem de células PAS positivos na secção do músculo não-amilase foi de 37%, enquanto secções musculares amilase tratados apresentaram significativamente menos, aproximadamente 5% de PAS-positivos células (Figura 3).
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Figura 3: Quantificação de células musculares PAS-positivas A proporção de células musculares que foram positivas PAS foi contado de um slide mandatário, sem ou com o pré-tratamento de amilase.. Tal como esperado, 37% das células do músculo foram positivos para o glicogénio. Amilase tratamento reduziu significativamente o sinal de PAS a 4% (* p <0,001).
Em seguida, PAS-coloração foi realizada em PBMC a partir de sangue venoso de indivíduos humanos saudáveis, utilizando uma técnica modificada, como descrito na secção de protocolo, e ilustrado na Figura 1. As PBMC aderiu bem se os passos de lavagem foram realizadas com cuidado. O PBMC PAS-coradas apresentada uma variedade de padrões de coloração. Pequenas células (5 mm) com grânulos foram facilmente observado. A proporção de células maiores, com um padrão de coloração difusa também foram observadas (Figura 4A, e inserir A.1-6 (Figura 4B).
Figura 4:.-Ácido de Schiff (PAS) periódico coloração em PBMCs humanos (A) coloração PAS em PBMC foi realizada. Foram observados dois tipos de células. (A.1-6) células menores (a 5 mm) em não-amilase lâminas tratadas mostrou partículas magenta consistentes com glicogênio. Estas células podem ser células em repouso. As células grandes (mais do que 5 um) em células tratadas não-amilase tinha coloração PAS positivo difusa. Estas células podem ser activados linfócitos. (B) As PBMC foram tratadas com amilase durante 15 min antes da coloração, o que diminuiu o sinal de PAS. Representante de sete indivíduos humanos saudáveis diferentes. (C) O PAS e hematoxycoloração lin feito no slide de sangue total. A seta indica a PBMC rodeado por muitos eritrócitos (barra de escala = 10 m). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A proporção que era PAS positivo foi de 98% para as células mais pequenas e 40% para as células maiores. Amilase tratamento eliminou o sinal PAS nas células pequenas (p <0,001) e diminuiu significativamente o sinal de PAS nas células maiores a 7% (Figura 5).
Figura 5: Quantificação de PBMCs PAS-positivas A proporção de PBMCs que foram positivas PAS foi contado de um slide mandatário, sem ou com o pré-tratamento de amilase.. 98% das células pequenas dimensões foram positivas para PAS. 40% das células eram maiores positive para PAS. Amilase tratamento eliminou o sinal PAS nas células pequenas (p <0,001) e diminuiu significativamente o sinal de PAS nas células maiores a 7% (p <0,001).
Para confirmar que as PBMCs glicogénio possuem um segundo método, independente que também fornece a quantificação da quantidade de glicogénio foi usado 10,11, e foi anteriormente publicado em JoVE em outros tipos de células 12. PBMC foram lisadas em tampão hipotônico e glicogênio foi separada como brevemente descrito na legenda da Figura 6.
Figura 6: Medição de glicogénio utilizando digestão enzimática com enzimas de hidrólise. O glicogénio foi medida de acordo com as instruções do fabricante. Em resumo, o protocolo envolve a lise hipotónica de 1 x 10 6 PBMC, seguido por granulação de material insolúvelque contém glicogénio. O sedimento foi lavado e digerido com enzimas de hidrólise produzindo glicose, a qual medidos por espectrofotometria e em comparação com uma curva padrão. O lisado celular foi diluído nas proporções indicadas, com tampão de hidrólise. Os dados são representativos de três experiências. Níveis significativos de glicogénio foram detectados na diluição 1: 1 (p = 0,02), e este sinal titulado como o lisado foi ainda mais diluída.
O glicogénio insolúvel foi lavado diversas vezes, e, em seguida, digerido com as enzimas de hidrólise. A quantidade de glucose resultou da digestão foi medida por espectrofotometria e comparada com uma curva padrão. Um milhão de PBMC tinha 1,19 mg de glicogênio. O sinal de glicogénio titulada para baixo como o lisado de células foi diluída ainda mais (Figura 6).
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Discussion
Os passos críticos deste artigo de vídeo foram amilase durante a lavagem e tratamento das células. Enquanto lavava os slides, o passo fundamental estava usando uma garrafa de lavagem squeezable plástico e deixando a água correr suavemente através da amostra no slide e não visando diretamente sobre as amostras. Mesmo a menor pressão da água direto faria com que as células para sair do slide. Outro passo importante foi usar a mesma lâmina para ± condições de amilase. Após as PBMC foram aderidos à corrediça, a corrediça foi cuidadosamente colocada em um recipiente de forma a apenas metade do esfregaço foi exposta à solução de amilase. Esta etapa fornece um controle robusto porque as células do sangue são do mesmo slide, minimizando, assim, as variáveis de confusão que podem ocorrer devido a variações temporais ligeiras. As células preso também sem o tratamento, de modo que o custo e tempo adicionais envolvidas com poli-L-lisina ou polietileno glicol, por exemplo, de revestimento não ser garantido.
Através de troubleshooting a actividade óptima da amilase foi determinada. Para secções musculares, observou-se que a actividade óptima da amilase foi observado dentro de 1 hora de incubação. Às vezes mais as seções musculares iria lentamente retire o slide, enquanto no mais curto vezes amilase não remover adequadamente o sinal de PAS. O tempo para a incubação da amilase de lâminas PBMC teve de ser reduzida em relação à temporização do músculo-amostra (que foi de 1 h) e apenas 15 min. Tempos maiores causados PBMC para sair do slide, enquanto tempos mais curtos não efetivamente impactar o sinal de PAS. Uma modificação ao protocolo padrão de coloração PAS foi alterando o método de lavar as lâminas. As instruções do fabricante indicado para lavar as lâminas com água corrente da torneira, o que fez com que as células a sair os slides. A modificação foi para lavar as lâminas com o frasco de lavagem maleável para preservar as células. Tal como descrito na secção passos críticos, foi muito importante a não aplicar directamente águapressão sobre as células.
Existem algumas limitações desta técnica. A membrana foi corada das células do músculo juntamente com grânulos puntiformes no citoplasma da célula do músculo. Os grânulos foram eliminados por tratamento amilase e, portanto, susceptível de ser glicogénio, enquanto que a coloração da membrana era insensível à amilase. A identidade das partículas PAS positivo sobre a membrana celular não é conhecido. Pode ser a membrana basal do músculo (perímisio). Esta membrana rodeia os fascículos musculares e devido ao seu elevado conteúdo de glicoproteína que é conhecido por ser PAS positivo. Outra limitação de coloração PAS é que os grânulos de glicogénio deve ser de pelo menos 50 nm de diâmetro para ser visível por microscopia de luz convencional. Assim, os grânulos de glicogénio menores podem estar presentes em uma célula, mas ainda registar-se um teste negativo no PAS. O segundo método utilizado supera esta limitação fornecendo detecção de glicogênio em um ligado. Em combinação com uma curva padrão que pode ser usado para determine a quantidade exata de glicogênio. Embora esta técnica é altamente quantificável e não é limitada pelo tamanho dos grânulos, que ela própria tem certas limitações. Grânulos de glicogênio são estruturas ramificadas complexas com muitas proteínas acessórias e ligações cruzadas químicas, o que torna improvável que as enzimas de hidrólise dissolver completamente uma molécula de glicogênio todo 13. Assim, a detecção de-enzimática (como a técnica PAS) pode sub-representação da quantidade real de glicogênio em uma amostra. Uma maneira de lidar com essa limitação é com microscopia eletrônica que resolve mesmo os mais pequenos grânulos de glicogênio 14. Um teria que empregam uma combinação dessas técnicas, PAS-coloração, digestão enzimática, e microscopia eletrônica para a caracterização mais abrangente de glicogênio.
Este artigo e vídeo demonstra o ácido Schiff (PAS) técnica de coloração periódica adaptado para o uso em PBMC. O significado deste estudo é visto na escolha de utilizarPBMCs mais de esfregaço de sangue, o que tornou mais viável para enumerar linfócitos. Inicialmente, uma técnica clássica esfregaço de sangue foi testado, no entanto, a maioria das células na lâmina estavam as células vermelhas do sangue e possivelmente neutrófilos (Figura 4C). Para concentrar os linfócitos, as PBMCs foram purificados a partir de sangue, utilizando a técnica de gradiente de densidade padrão. Utilizando uma técnica similar a um esfregaço de sangue, a PBMC facilmente aderido durante a duração do procedimento de PAS, que tem muitos passos de lavagem vigorosa. A técnica PAS tem sido usada há décadas para determinar os níveis de glicogênio em biópsias de tecidos musculares, que são cortados em lâminas finas e aderiram ao slides. Coloração PAS foi escolhido em detrimento de outros produtos químicos de coloração de hidratos de carbono, devido à sua elevada fiabilidade e a presença de resultados previstos na literatura. Um rato (Mus spretus) secções musculares foi utilizado como um controlo positivo e encontrado, como esperado, que 37% das células eram positivas PAS-9. Em termos de custo e tempo, preparando PBMC é mais oneroso do que uma mancha de sangue, mas existem várias vantagens. Em primeiro lugar, a preparação é mais enriquecido em linfócitos, que são células de interesse para os projectos que se centram na auto-imunidade. Se foram utilizados esfregaços de sangue, os linfócitos seriam a minoria, tornando-se um desafio para encontrar a célula de interesse. Um teria para preparar e analisar muito mais slides para obter os mesmos números que você iria ficar com alguns slides PBMC. Pesquisadores estaria muito interessado em usar a nossa nova técnica optimizada em projectos de auto-imunidade relacionados com diabetes tipo 1, esclerose múltipla, lúpus, artrite reumatóide, etc. onde linfócitos T e B e células NK desempenham um papel. Claro que, para outras aplicações onde eritrócitos ou neutrófilos são de interesse seria recomendado o esfregaço de sangue. A outra vantagem é que as PBMC podem ser usados para estudar a biologia de linfócitos humanos in vitro.
Uma investigação em curso está a investigar a fonte de glicogênio em PBMC. EUn o futuro, está prevista para medir o teor de glicogênio no contexto da esclerose múltipla, uma doença auto-imune mediada por linfócitos T, que afeta um número estimado de 2,3 milhões de pessoas em todo o mundo a partir de 2013 15,16. Quais são as pequenas e grandes células das amostras de PBMC? As células em 5 um são consistentes com a linhagem linfóide no seu estado de repouso. Linfócitos T, linfócitos B, células assassinas naturais, e outros subconjuntos são menores dentro desta gama de tamanhos. As PBMCs são provavelmente maiores composto de linfócitos activados, que crescem como maior que recebem sinais inflamatórias do sistema imunitário, monócitos e de linhagem mielóide. De separação de células técnicas avançadas como fluorescente ativado separação de células ou separação de células magnético ativado são necessários para refinar ainda mais o subconjunto que expressa glicogênio.
Contador de coloração com Hematoxilina foi usado quando a coloração foi feita em todo o sangue. Isso nos permitiu distinguir monócitos de eritrócitos (Figura 4C). Quando a coloração foi feita em PBMC, uma vez que todas as células eram mononucleares, não houve necessidade de combater mancha com hematoxilina para identificar as células. Também hematoxilina estava a interferir com o sinal de PAS nas células. Em resumo, demonstrámos um procedimento de coloração com PAS-adaptado para PBMC. Esta técnica é útil para cientistas e médicos que pesquisam a auto-imunidade, infecção e alergia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Periodic Acid Shiff Kit |  Sigma-Aldrich |
395B | Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution. |
| α-Amylase from porcine pancreas | Sigma-Aldrich |
A3176 | |
| Binocular Microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogen Assay Kit | Sigma-Aldrich |
MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare |
17-1440-02 | Nonionic synthetic polymer of sucrose. |
| Centrifuge | For PBMC isolation, swing buckets were used. |
References
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