Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Introduction

Perjodsyre Schiff (PAS) farging er en immunhistokjemisk teknikk som er mye brukt i muskel forskning og diagnostikk. Det er også anvendes som et diagnostisk verktøy i blodprøver. Teknikken virker ved å påføre perjodsyre løsning til prøven, som oksiderer enheter i polysakkarid-skaper aldehydgrupper som reagerer med det fargeløse Schiffs reagens for derved å gi en dyp magenta produkt. Trinnene i denne fremgangsmåten er vist i figur 1. Flekken svinger noe med polysakkarider magenta, inkludert glykogen, glykoproteiner, glykolipider, slimstoffer eller andre molekyler med molekyldeler polysakkarid.

PAS-farging blir ofte anvendt for å måle glykogeninnhold i muskel fiber. Muskler vevssnitt er ideelle for den teknikken som de fast feste til raset og tåle flere vask og farging trinn. Glykogen er de til stede i raske rykk Type II muskelfibre, som har en høy etterspørselfor rask ATP produksjon krever glykogen for maksimal ytelse ^1,2. Glykogen er en forgrenet polymer av glukose som kan deles opp i fri glukose ved virkningen av glykogen-fosforylase-enzymer. I tider med hvile og næringsforsyning, er glykogen etterfylles gjennom prosessen med glykogenesen, mens i tider med ernæringssvikt eller høy energi etterspørsel; glykogen brytes ned til glukose ved glykogenolyse. Fra så tidlig som i 1950 kliniker forskere har utforsket PAS flekker på blodprøver for å analysere glykogeninnhold i ulike sykdommer ^3-7. For eksempel, i Pompes sykdom-en bonafide glykogen lagring sykdoms hvite blodceller akkumulere store mengder glykogen som skiller seg vesentlig fra friske kontroller ^8.

Denne video-artikkelen viser en tilpasset versjon av PAS farging for bruk på perifere mononukleære blodceller (PBMC) prøver fra venøs blod av friske mennesker. PBMCs inneholder hovedsakelig lymfocytter av T-lymfocytter og B-lymfocytt-familier, så vel som andre immunceller så som naturlige dreperceller og monocytter. Det første rensetrinn fjernes erytrocytter, nøytrofile granulocytter og andre. Denne teknikken gir data på en konsentrert andel av lymfocytter som åpner for mer robust oppregning av PAS-positive celler sammenlignet med bruk av fullblodflekker.

Figur 1:. Steg for steg metodikk av PAS flekker på PBMC (A) Først er isolering av PBMC oppnådd gjennom ficoll gradient, viser venstre panel forberedelse før sentrifugering, viser høyre panel det etter sentrifugering hvor fibrinlagområdet inneholder PBMC er observert i sentrum av røret. (B) Isolerte PBMC-er festet til sleiden ved hjelp av formalin-etanol festing Løsnsjon. Sleiden er forsiktig skylt med destillert vann fra en plast vaskeflaske. (C) Sleiden blir deretter plassert i et 100 ml begerglass halvveis fylt med amylase-oppløsning, noe som vil oppløse glykogen. Raset er forsiktig skylt. (D) Raset behandles med perjodsyre løsning, hvor oksidasjon av sakkarider foregår. Lysbildene er forsiktig skylt; Dette vil fjerne overskudd av perjodsyre og stoppe oksydasjonstrinnet. (E) Ved at Schiff-reagens tilsettes til skinnene, vil det reagere med aldehyder som dannes under oksidasjonstrinnet. Denne fargeløs reagens vil da resultere i en dyp rød magenta produkt. Objektglassene forsiktig skyllet for å fjerne overskudd av Schiffs reagens.

Protocol

Forskning med humane blodprøver ble godkjent av Concordia University Etikk Review Board, sertifikat nummer 10000618. Arbeidet med musen muskel ble godkjent av Concordia University Etikk Review Board, sertifikat nummer 2010BERG.

1. PBMC Isolasjon fra Whole Blood

MERK: Utfør denne prosedyren i en biosikkerhet skapet med steril teknikk og produsent-sterilisert utstyr.

1. Hell forsiktig 10-15 ml fullblod fra hepariniserte (anti-koagulant) blodprøverør inn i en 50 ml steril konisk rør. For mindre blod søl, tørk med DDH ₂ O og 70% EtOH hjelp klut.
2. Fortynnet blod i det koniske rør til et 1: 1 forhold med fosfatbuffer saltvann (PBS 1x) pH 7,4. Sørg for at den maksimale totale volumet ikke overstiger 30 ml.
3. Bland forsiktig ved hjelp av en serologisk pipette pistol unngå bobler.
   MERK: IKKE bland ved å snu røret for å unngå blod enccumulation i hetten og påfølgende sigevann under sentrifugering.
4. Legg 13 ml Ficoll-Paque (se Materialer og utstyr tabellen), til et nytt 50 ml kapasitet konisk rør. Hold røret oppreist i racket.
5. Ved hjelp av en overføring pipette, ta utvannet blod, ta på overførings pipettespissen til innsiden av røret nær toppen. Med langsom og jevn trykk, overføre blodet langs innerveggen av røret som danner en blod lag på toppen av sukrose lag. Gjør dette trinnet flere ganger før alt blodet har blitt overført.
6. Cap røret tett og sentrifuger røret ved romtemperatur i 30 minutter ved 700 xg i en sving rotor med mellom akselerasjon satt til 5, og bremsingen satt til null.
7. Sakte ta ut røret og uten å forstyrre lagene, ta det tilbake til biosikkerhet kabinett.
8. Samle forsiktig fibrinlagområdet (tynn skyet hvitt lag), hvor PBMC er plassert, plassert mellom PBS / plasma ennd Ficoll lag ved hjelp av en overføring pipette. Unngå å samle sukrose lag og ikke forstyrre de røde blodcellene lag.
9. Overfør buffy coat i en ny 50 ml sterilt konisk rør. Det kan ta flere ganger for å gjenta trinn 1.8 for å samle alle de PBMC.
10. Legg PBS pH 7,4 til røret med PBMC og fyll opp til 45 ml merket. Riste rør grundig. Ikke vortex.
11. Vask 1: Sentrifuger i 15 minutter ved 480 xg med både maksimal akselerasjon og retardasjon satt til 9. Legg merke til dannelse av en pellet av PBMC ved bunnen av det koniske rør.
12. Kast PBS (supernatant) inn i et plastbegerglass med 10 ml av blekemiddel.
13. Løsne cellepellet ved forsiktig "reoler" mot en bølget overflate (dvs. tom stativ). Ikke vortex.
14. Legg til 25 ml av frisk PBS pH 7,4 til røret. Hvis mer enn ett rør blir behandlet, basseng pelletene sammen i dette trinnet.
15. Vask 2: Sentrifuger røret i 12 minutter ved 480 xg with både maksimal akselerasjon og retardasjon satt til 9.
16. Kast PBS (supernatant) i plastbeger med en sprut av blekemiddel.
17. Forsiktig "rack" mot en bølget overflate (dvs. tom stativ). Ikke vortex.
18. Legg til 25 ml av frisk PBS til røret.
    1. Ta ut 50 mL av cellene og overfør til en mikro tube for levedyktighet teller.
    2. Legg en lik mengde (50 mL) av trypanblått (en levedyktighet flekk) og pipette opp og ned for å blande forsiktig.
19. Ta ut 10 pl og overføre den til en hemocytometer å sjekke levedyktighet av celler per ml. Registrere antall celler / ml.
20. Ta ut den ønskede mengde av celler og sentrifuger røret i 12 minutter ved 480 xg med både maksimal akselerasjon og retardasjon satt til 9.
21. Kast PBS (supernatant) i begerglasset med blekemiddel.
22. Forsiktig "rack" mot en bølget overflate (dvs. tom stativ). Tilsett 80 mL PBS inn i røret.

2. Gjøre PBMC Slide

1. Plassere 80 ul av cellene på et objektglass. Smøre slipp ved hjelp av et annet lysbilde eller plassere to dråper 40 ul hver på begge ender av raset.
2. Forlate lysbildet i biologisk sikkerhetskabinett å tørke. Merke lysbilde med en blyant på frostet side.

3. Fikse Eksemplene på lysbildene

1. Klargjør fikserløsning ved å blande 0,5 ml av 37% formaldehyd i 4,5 ml 99% etanol.
2. Etter lysbildene er tørket, ta ut 2 ml av den rykende fiksativ løsning og hell den på lysbildet slik at hele overflaten av raset er dekket.
3. La oppløsningen på sleiden i 1 min. Skyll lysbildet i 1 min med vann fra springen og la det lufttørke.

4. Gjør Amylase Løsning for negativ kontroll

1. Ta 0,25 g amylase pulver og oppløses i 50 ml distilnet vann. Hell oppløsningen i et rent 100 ml begerglass.
2. Dyppe objektglasset i begerglasset slik at halvparten av sleiden mottar behandlingen, og den andre halvparten forblir ubehandlet, og deretter inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur (figur 1C).
3. Lage et notat på hvilken side av raset mottar amylase behandling. Tegn en linje på baksiden av raset som indikerer grensen mellom behandling og kontroll.
4. Vask lysbildene med DDH ₂ O for å fjerne amylase løsningen og la lysbildet lufttørke.

5. Utfør Periodisk Acid Schiff (PAS) Farging og bildebehandling

MERK: PAS reagenser er giftig ved innånding og er etsende, så trinnene må gjøres i et avtrekksskap, og avfall må kastes på forsvarlig måte i henhold til institusjonelle retningslinjer.

1. Plasser lysbildet på et flatt underlag og hell 1.50-2.00 ml Periodic Acid Solution på prøven. Incubate i 5 min ved romtemperatur.
2. Skyll lysbildene i flere ladninger av destillert vann.
3. Hell 1.50-2.00 ml Schiffs reagens på lysbildet og inkuber i romtemperatur i 15 min.
4. Vask raset med destillert vann i 5 min og la det lufttørke.
5. Påfør 10 mL montering media på lysbildet og dekk med to små dekkglass, eller bruke 50 fil og bruke en stor dekkglass.
6. Påfør klar neglelakk på kantene av dekkglass, la tørke over natten.

6. Skaffe bilder med Binocular lysmikroskop Bruke 100X Mål

Representative Results

Å validere reagenser og grunnleggende teknikk, ble PAS farging utført i henhold til produsentens instruksjoner om mus soleusmuskel seksjoner. Fargingen ble utført samme dag som offer, og i det siste trinnet av fargingen ble de seksjoner festet ved xylen. Soleus muskelen er kjent for å inneholde ~ 35% glykogen-positive celler ^9. De fargede muskelceller vist to distinkte PAS-positive funksjoner-punctate granuler inne i cellen, og en kontinuerlig linje demarking cellemembranen (figur 2A). Tilstedeværelsen av punctate granuler er i samsvar med glykogen, og ble brukt til å definere en positiv muskelcelle. Behandling av prøver med amylase fjernet punctate granuler som er i overensstemmelse med dem som glykogen (figur 2B).

Figur 2: passa- farget musemuskel seksjoner ble analysert med lysmikroskopi. Mouse soleusmuskel seksjonene ble farget med PAS. Noen prøver ble forbehandlet med amylase. (A) PAS-positive partikler var synlig inne i muskelceller. (B) Mindre PAS-positive celler ble observert når muskelen seksjoner var forbehandlet med amylase. Farging rundt cellemembranen forble etter amylase behandling (skala bar = 100 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Den membranfarging signal forble også etter amylase behandling. Som forventet, var prosentandelen av PAS-positive celler i den ikke-amylase muskel-delen var 37%, mens amylase behandlet muskel seksjoner hadde betydelig mindre, omtrent 5% PAS-positive celler (figur 3).

">
Figur 3: Kvantifisering av PAS-positive muskelceller Andelen av muskelceller som var PAS positive ble regnet fra en representant lysbilde uten eller med amylase før behandling.. Som forventet, 37% av muskelceller var positive for glykogen. Amylase behandling signifikant redusert PAS-signal til 4% (* p <0,001).

Deretter ble PAS-farging utført på PBMC fra venøst ​​blod fra friske humane individer ved bruk av en modifisert teknikk som beskrevet i protokollen delen, og illustrert i figur 1. PBMC klebet godt hvis vasketrinnene ble nøye utført. PAS-farget PBMC vises et utvalg av fargemønstre. Små celler (5 mikrometer) med korn ble lett observeres. En andel av større celler med en diffus fargemønster ble også observert (Figur 4A, og innfelt A.1-6 (Figur 4B).

Figur 4:. Perjodsyre-Schiff (PAS) flekker på menneskelige PBMC (A) PAS-farging på PBMC ble utført. To typer av celler observert. (A.1-6) Mindre celler (ved 5 mikrometer) i ikke-amylase behandlet lysbilder viste magenta partikler konsistente med glykogen. Disse cellene kan være hvile celler. Større celler (mer enn 5 mikrometer) i ikke-amylase behandlede celler hadde diffuse PAS-positiv farging. Disse cellene kan bli aktivert lymfocytter. (B) PBMC ble behandlet med amylase i 15 minutter før farging, noe svekket PAS signal. Representant for syv forskjellige friske forsøkspersoner. (C) Den PAS og hematoxylin farging gjort på fullblods lysbilde. Pilen viser en PBMC omgitt av mange erytrocytter (skala bar = 10 mikrometer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Andelen som var PAS positive var 98% for de mindre celler og 40% for de større celler. Amylase behandling eliminerte PAS-signalet i de små celler (p <0,001) og betydelig redusert PAS-signal i de større celler til 7% (figur 5).

Figur 5: Kvantifisering av PAS-positive PBMC Andelen PBMC som var PAS positive ble regnet fra en representant lysbilde uten eller med amylase før behandling.. 98% av de små-sized celler var positive for PAS. 40% av de større celler var positive for PAS. Amylase behandling eliminerte PAS-signalet i de små celler (p <0,001) og betydelig redusert PAS-signal i de større celler til 7% (p <0,001).

For å bekrefte at PBMC har glykogen en andre, uavhengig metode som også gir kvantifisering av mengden av glykogen ble benyttet ^10,11, og har tidligere blitt publisert i Jove på andre celletyper ^12. PBMC ble lysert i hypoton buffer og glykogen ble skilt som beskrevet kort i bildeteksten i figur 6.

Figur 6: Måling av glykogen ved hjelp av enzymatisk spalting med hydrolyseenzymer. Glykogen ble målt i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk innebærer protokollen hypoton lysering av 1 x 10 ⁶ PBMC etterfulgt av pelletering av uoppløselig materialsom inneholder glykogen. Pelleten ble vasket og spaltet med hydrolyseenzymer som ga glukose som ble målt ved spektrofotometri, og sammenlignet med en standardkurve. Cellelysatet ble fortynnet ved de indikerte prosenter med hydrolysebuffer. Dataene er representative for tre eksperimenter. Betydelige nivåer av glykogen ble detektert i 1: 1 fortynning (p = 0,02), og dette signal titrert ut som lysatet ble videre fortynnet.

Det uoppløselige glykogen ble vasket flere ganger, og deretter spaltet ved hjelp av hydrolyse-enzymer. Mengden av glukose gitt fra fordøyelse ble målt ved hjelp av spektrofotometri, og sammenlignet med en standardkurve. En million PBMC hadde 1,19 ug glykogen. Glykogen signal titrert ned som cellelysatet ble videre fortynnet (figur 6).

Discussion

De kritiske trinnene i denne videoen artikkelen var under vask og amylase behandling av cellene. Mens vasking av glassplatene ble styringstrinnet ved hjelp av en plast sammenklembar vaskeflaske og la vannet forsiktig drevet gjennom prøven på sleiden og ikke sikter direkte på prøvene. Selv den minste direkte vanntrykk ville føre til at cellene til å komme ut av lysbildet. Et annet viktig skritt var å bruke den samme lysbilde for ± amylase forhold. Etter PBMC ble klebet til sleiden, ble objektglasset forsiktig plassert i et begerglass slik at bare halvparten av smøre ble utsatt for amylase løsning. Dette trinnet gir en robust kontroll fordi blodcellene er fra samme lysbilde, og dermed minimere konfunderende variabler som kan oppstå på grunn av små tidsvariasjoner. Cellene fast godt med ingen behandling, slik at den ekstra kostnaden og tiden som er involvert med poly-L-lysin eller polyetylenglykol belegg for eksempel ville ikke være berettiget.

Gjennom troubleshooting den optimale aktivitet av amylase ble bestemt. For muskel seksjoner, ble det bemerket at den optimale aktivitet av amylase ble observert i løpet av 1 time med inkubering. På lengre tider muskel seksjoner ville sakte skrelle av raset, mens på kortere tid amylase ikke tilstrekkelig fjerne PAS-signal. Tidspunktet for amylase inkubasjon i PBMC lysbilder måtte reduseres i forhold til muskel-sample timing (som var 1 time) ned til bare 15 min. Lengre tider forårsaket PBMC å gå av raset, mens kortere tider ikke effektivt påvirke PAS-signal. En modifikasjon av standard protokoll for PAS-farging var å endre fremgangsmåten for vasking av glassplatene. Produsentens instruksjoner angitt å vaske lysbildene med rennende vann fra springen, som forårsaket cellene å gå av lysbildene. Modifikasjonen var å vaske objektglassene med sammenklembar vaskeflaske for å bevare cellene. Som beskrevet i den kritiske delen trinn, var det svært viktig ikke å direkte bruke vanntrykk på cellene.

Det er noen begrensninger i denne teknikken. Muskelcellen membranen ble farget med punctate granuler i cytoplasmaet av muskelcellen. Granulene ble eliminert ved amylase behandling og derfor sannsynligvis være glykogen, mens membranfarging var ufølsomme overfor amylase. Identiteten av PAS-positive partikler på cellemembranen er ikke kjent. Det kan være muskel kjelleren (perimysium) membran. Denne membranen omgir muskel fascicles og på grunn av sitt høye innhold glykoprotein det er kjent for å være positive PAS. En annen begrensning av PAS-farging er at glykogengranuler må være minst 50 nm i diameter for å være synlig ved konvensjonell lysmikroskopi. Således kan mindre glykogen granulater være tilstede i en celle, men likevel registrere negativ på en PAS-test. Den andre metoden som brukes overvinner denne begrensning ved å tilveiebringe deteksjon av glykogen i et lysat. I kombinasjon med en standardkurve av dette kan brukes til å Determine den eksakte mengden av glykogen. Selv om denne teknikken er høyst målbar og er ikke begrenset av størrelsen av granulene, har den i seg selv visse begrensninger. Glykogen granulat er komplekse forgrenede strukturer med mange tilbehørs proteiner og kjemiske kryssbindinger, noe som gjør det usannsynlig at hydrolyse enzymer fullt oppløse en hel glykogen molekyl ^13. Således, den enzymatiske-deteksjon (som PAS teknikk) kan under-representere den faktiske mengde glykogen i en prøve. En måte å håndtere denne begrensningen er med elektronmikroskopi som løser selv de minste glykogen granulat ^14. Man må anvende en kombinasjon av disse teknikker, PAS-farging, enzymatisk oppslutning, og elektronmikroskopi for den mest omfattende karakterisering av glykogen.

Denne artikkelen og video demonstrerer perjodsyre Schiff (PAS) fargingsteknikk tilpasset for bruk på PBMC. Betydningen av denne studien er sett i valget mellom å brukePBMC enn blodutstryk, som gjorde det mer gjennomførbart å nummerere lymfocytter. Innledningsvis ble en klassisk blod-utstryk teknikk testet, men de fleste celler på objektglasset ble røde blodceller og muligens neutrofiler (Figur 4C). Å konsentrere lymfocyttene, ble PBMC renset fra blod ved hjelp av standard tettshetsgradient teknikk. Ved hjelp av en teknikk som ligner på en blod-utstryk, PBMC lett klebet til varigheten av PAS-prosedyren, som har mange kraftige vasketrinn. PAS teknikken har blitt brukt i flere tiår for å bestemme glykogen i muskel vevsbiopsier, som er skåret i tynne snitt og følges lysbilder. PAS-farging ble valgt fremfor andre karbohydratfargingskjemikalier på grunn av sin høye pålitelighet og nærværet av de forventede resultater i litteraturen. Mus (Mus) spretus muskel seksjoner ble anvendt som en positiv kontroll og funnet, som forventet, at 37% av cellene var i PAS-positive ^9. I form av kostnader og tid, forbereder PBMC er mer tyngende enn et blodutstryk, men det finnes flere fordeler. For det første er det forberedelse mer beriket i lymfocytter, som er de cellene av interesse for prosjekter som senter på autoimmunitet. Hvis blodflekker ble brukt, ville lymfocytter være minoritet, noe som gjør det utfordrende å finne cellen av interesse. Man må forberede og analysere langt flere lysbilder for å få de samme tallene du ville fått med noen PBMC lysbilder. Forskere vil være svært interessert i å bruke vår nye optimalisert teknikk i autoimmunitet prosjekter knyttet til type 1 diabetes, multippel sklerose, lupus, revmatoid artritt, etc. der T- og B-lymfocytter og NK-celler spiller en rolle. Selvfølgelig, for andre applikasjoner hvor erytrocytter eller nøytrofile er av interesse blodutstryk ville bli anbefalt. Den andre fordelen er at PBMC kan brukes til å studere humane lymfocytter in vitro-biologi.

En pågående forskning undersøker kilden til glykogen i PBMC. Jegn fremtiden, er det planlagt å måle glykogeninnhold i forbindelse med multippel sklerose, en T lymfocyttmediert autoimmun sykdom som påvirker anslagsvis 2,3 millioner mennesker over hele verden som av 2013 ^15,16. Hva er de små og store celler i PBMC prøvene? Celler ved 5 um er i overensstemmelse med lymfoidlinjen i sin hviletilstand. T-lymfocytter, B-lymfocytter, naturlige dreperceller, og andre mindre undergrupper er innenfor dette størrelsesområdet. De større PBMC er trolig sammensatt av aktiverte lymfocytter, som vokser større som de mottar inflammatoriske signaler fra immunsystemet, og monocytter fra myeloid avstamning. Avanserte celle sortering teknikker som fluorescerende aktivert celle sortering eller magnetisk-aktivert celle sortering er nødvendig for å ytterligere forbedre undergruppe som uttrykker glykogen.

Hematoxylin telleren farging ble brukt da farging ble utført på fullblod. Dette gjorde oss i stand til å skille monocytter fra erytrocytter (Figur 4C). Når fargingen ble gjort på PBMC, da alle celler var mononukleær, var det ikke nødvendig å motvirke flekken med hematoksylin for å identifisere celler. Også hematoxylin ble interfererer med PAS-signalet i cellene. I sammendrag er det vist en PAS-farging prosedyre tilpasset for PBMC. Denne teknikken er nyttig for forskere og klinikere forsker autoimmunitet, infeksjon og allergi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Periodic Acid Shiff Kit	Sigma-Aldrich	395B	Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas	Sigma-Aldrich	A3176
Binocular Microscope	Carl Zeiss Microscopy	Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit	Sigma-Aldrich	MAK016
Ficoll-Paque PLUS	VWR, GE Healthcare	17-1440-02	Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge			For PBMC isolation, swing buckets were used.