Abstract
赖氨酸的甲基化是一个新兴的翻译后修饰，这已被确定在几个组蛋白和非组蛋白，它在细胞发育和许多疾病的关键角色。大约5000赖氨酸甲基化位点被确定在不同的蛋白质，这是由数十个蛋白赖氨酸甲基转移设置。这表明，每PKMT甲基化多种蛋白，但至今只有一个或两个基片已被确定为若干这些酶。 PKMTs来解决这个问题，我们引入肽基于阵列的底物特异性分析。肽阵列功能强大的工具来PKMTs的特异性表征，因为几个底材具有不同序列的甲基化可以在一个阵列进行测试。我们使用Intavis SPOT合成仪合成肽阵列纤维素膜和分析各种PKMTs的特异性。基于该结果，对于几个这些酶的，新的substrates可以被识别。例如，对于NSD1通过采用肽阵列，我们表明，甲基化H4的K44代替报告H4K20并且另外H1.5K168高于先前已知的H3K36高度优选的基材。因此，肽阵列功能强大的工具，生化表征PKMTs。
Introduction
在过去的二十年里，若干报告证实在细胞发育和一些疾病，如癌症，但最近的蛋白赖氨酸的甲基化已成为一个重要的另一个PTM翻译后修饰（PTM）的重要性。而最初组蛋白赖氨酸的甲基化被认为是一个重要的染色质标记，以后的工作中也表现出若干非组蛋白1-4的赖氨酸的甲基化。甲基的从S-腺苷-L-甲硫氨酸的顺序转印到赖氨酸残基的ε氨基用一个家族的酶称为蛋白赖氨酸甲基转移（PKMTs）的包含超过60蛋白在人类基因组催化。 PKMTs最初发现的组蛋白修饰酶的具体甲基化赖氨酸残基，但后来的报告显示，他们也可以非甲基化，组蛋白5。到现在为止，大约5000赖氨酸甲基化位点被确定在不同的蛋白质6
肽阵列是广泛使用的工具为抗体，肽修饰酶和蛋白质-蛋白质相互作用位点（抗体-抗原，受体-配体）7-9映射的生化分析。都需要SUC几百肽ħ应用。不同的方法可用于肽合成，其中肽在树脂上合成是很常用的，但它有局限性的吞吐量，这是相对昂贵的。这些问题得到解决，推出了弗兰克和他的同事10的SPOT合成方法。现货合成方法合成允许几百肽并行，平均也比树脂合成低廉。合成在纤维素膜上的肽可以使用，也可以直接用于各种应用或肽可以从膜被切割并在溶液测定中使用作为游离肽或以制备肽微阵列10-13。
SPOT合成的固相肽合成，其使用纤维素膜作为固体支持物，并采用标准的Fmoc-化学10-13的变体。因此，肽链的合成开始于C-末端，并进入朝所述N-末端在对比的生物合成的核糖体。纤维素膜官能化的第一个被激活的氨基酸（ 图1）的附件。当场方法是基于使用自动吸移系统的连续输送的活化氨基酸中的溶剂，以在所述膜限定的斑点的液滴。液体的液滴分配在那里形成一个圆形的湿斑，后来作为一个开放的反应器用于在肽合成的化学反应的多孔膜。光斑尺寸由分配的体积，膜的吸收能力确定的，这样的点的倍数被布置为阵列。合成的规模相关的光斑尺寸和隔膜的负载能力。斑点和阵列的密度之间的距离是通过改变该斑点尺寸管理。纤维素膜具有几个优点如在肽合成的固相，它是便宜的，耐受性的CHEMIC在肽合成中使用ALS，稳定在水溶液中，并容易处理。另外，它的亲水性使其适用于多种生物测定系统。 SPOT合成可以手动进行或自动（对于肽1000），这取决于肽的所需数量。从Intavis（科隆，德国）一个完全自动化的SPOT合成器可用于我们的应用程序。它允许合成肽不同长度的不同数量和。线性肽经常与15至20个氨基酸长度的合成，在高达42个氨基酸加成肽也可以通过逐步合成14,15制备。然而，增加的氨基酸的数目导致降低整体耦合的产量，从而影响所述肽的质量。因为每点的肽的低量的，该产品往往难以纯化和个别的肽的质量不能容易地进行评估。因此，结果从SPOT PEPT获得IDE阵列必须确认或者用肽通过标准方法在较大的规模，这可以被纯化，并根据在肽合成或通过合成含有所需的肽序列的蛋白质的标准分析合成。尽管如此，我们发现SPOT合成是高度可靠和一般结果是重复的。 SPOT合成不限于蛋白氨基酸，几种市售修饰的氨基酸也可用于合成，使肽之前和侧链保护基团的最终切割，此外后进行修改，它也允许掺入磷酸化，甲基化或乙酰化氨基酸11。
由斑点方法合成固定化肽文库可直接用于许多生物和生化分析。我们采用包含300-400肽进行调查PKMTs的底物特异性的肽阵列。对于酶modifi阳离子，肽阵列一起温育的各PKMT和标记的[甲基- 3 H] - -AdoMet在适当的缓冲液中。各个基板的甲基化是由以下的放射性标记的甲基的距离的AdoMet通过放射自显影（ 图3）的酶促转移到肽底物进行分析。通过此过程中，肽阵列允许不同的肽底物的甲基化的同时研究。这种方法的一个重要优点是，所有的肽都甲基化的竞争，使得在所述甲基化动力学的线性相位，每种肽的相对甲基化正比于催化速率常数通过解离常数（k 猫 / K除以D中的酶用于各个肽底物）。因此，放射性掺入每个斑点的量直接与朝向特定的肽酶活性。使用的肽阵列甲基实验的结果来看，PKMT的特异性轮廓可以定义和基于这一新基材可为前提。肽阵列允许的新颖底物在肽水平的甲基化的快速和成本有效的验证。对于这一点，阵列是制备包含该预测的新颖底物与含有丙氨酸代替赖氨酸在靶位点修饰的肽以及阳性和阴性对照的肽一起。最后，新的衬底可以被制备为蛋白质连同突变体，其中靶的Lys被改变为丙氨酸和甲基化可以在蛋白质水平证实。根据结果，这随后是生物学研究解决新描述蛋白质底物的甲基化的潜在作用。
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Protocol
1.准备肽阵列
- 该肽序列编程
- 设计用于使用MultiPep去污剂软件的合成肽序列。输入单字母代码的肽序列。
肽1：TARKSTGGKA - 生成丙氨酸或精氨酸步行库与特定命令（.replace，A）中筛选所需的识别一个定义衬底的重要氨基酸。例如在下面的例子中，第一行是野生型序列和来自第二行的每个氨基酸的肽被改变为丙氨酸顺序。
代替，A
TARKSTG
一个 -ARKSTG
T- 一个 -RKSTG
TA-à-KSTG
焦油一个 -STG
TARK-à-TG
TARKS- 一个 -G
TARKST- 一个 - 使用类似的命令（.replace R，。代替n 等 ）在1.1.2与所有的天然可得的氨基酸残基（最终省略半胱氨酸，蛋氨酸和色氨酸所描述的，因为这些残基是容易氧化，有时降低合成产率）以合成肽阵列，用于确定共识底物序列基序的酶。
注意： 如图4A中，水平轴表示在给定的肽序列，纵轴表示被选择为命令的氨基酸。类似于在1.1.2中所示的序列中，A为纵轴意味着一个丙氨酸依次替换图1中的第一行中的给定的序列中的每个位置。 4A。同样精氨酸依次替换等与其它氨基酸的每个氨基酸在第二行中。完整的肽阵列库通过与各次的系统替换每个残基提供的肽底物序列的合成E的其他自然可用氨基酸残基，这有助于了解每个残基的在给定序列中的每个位置上的影响力。 - 可替换地，已知的或预测的肽底物的甲基化可以容易地验证与PKMT的靶肽一起与阳性和阴性对照的甲基化合成肽文库（ 即公知的甲基化或已知不被甲基化的肽）。通过交换推定靶赖氨酸为丙氨酸，以确认目标赖氨酸的甲基化，如下所示通过手工编程合成肽。
野生型肽STGGķPRQFL
突变肽：STGG 一个 PRQFL
注：该软件还具有固有的脚本来创建不同的库，例如表位映射的序列所需的帧转移到地图需要交互的重要氨基酸。
- 设计用于使用MultiPep去污剂软件的合成肽序列。输入单字母代码的肽序列。
- 膜的制备，氨基酸的ð试剂
- 预膨胀的DMF（N，N-二甲基甲酰胺）10分钟的SPOT膜，然后将合成的SPOT框架上的湿膜没有气泡或皱纹。
- 洗膜三次，100％的乙醇。在开始合成程序之前完全干燥该膜为至少10分钟。
- 并联，新鲜制备的0.5M工作市售的Fmoc保护的氨基酸的浓度通过在NMP中溶解它们，也如表1中所述制备的活化剂和碱。
- 确保SPOT合成器的所有废溶液的容器排空和再填充的溶剂容器与DMF，乙醇和哌啶。
注：现在的机器准备的合成。
- 第一个氨基酸的斑点
- 以生成酰胺键与在膜上的游离氨基，激活呼入氨基酸的羧基基团由广告丁的活化剂（N，N'-Diisopropylcarbodiimide）和碱溶液（乙基肟氰基）的氨基酸衍生物。
- 当场对使用可编程机器人的氨基的PEG官能化膜活化的氨基酸的所需的卷。
注：由此，氨基酸的C末端被连接到所述隔膜的氨基。 - 重复此步骤3次，以确保更好的第一活化的氨基酸偶联。孵育该膜20分钟，然后用DMF洗涤以除去未偶联的氨基酸。
- 非现场封锁区免费空间的
注：所有的肽的第一C端氨基酸，以该膜的氨基的偶联后，斑点和一些光点的区域内的氨基之间的氨基不形成与氨基酸债券。- 通过与加帽溶液孵育阻断这些游离氨基（在DMF中的20％乙酸酐）5分钟。
注意：这避免了在进一步的周期与膜代替的生长的肽链的氨基酸的耦合。
- 通过与加帽溶液孵育阻断这些游离氨基（在DMF中的20％乙酸酐）5分钟。
- 除去Fmoc基团的
- 封闭后，用DMF中的4倍洗膜，然后用20％哌啶孵育在DMF中20分钟以除去Fmoc保护基。
注意：此步骤导致除去氨基保护的Fmoc基团，它被称为去保护。 - 之后，用乙醇两次用DMF和两次洗膜并使其干燥。
注：现在该膜是准备的下一个氨基酸的偶联。
- 封闭后，用DMF中的4倍洗膜，然后用20％哌啶孵育在DMF中20分钟以除去Fmoc保护基。
- 链延伸
注：加入每个氨基酸被称为一个周期。除了第一个氨基酸偶联，所述周期开始用Fmoc基的偶联氨基酸的脱保护和它后面是传入氨基酸的活化的羧基的不断增长的PEP的氨基偶联潮链。- 重复步骤1.3和1.5，直至所需肽的长度来实现的。
- 染色
注：在最后一次循环后，将肽阵列沾有溴酚蓝，以确认成功地合成肽。溴酚蓝结合与肽的游离氨基。肽斑点显示浅蓝色染色后，但根据不同的肽序列的点的强度而变化。这种染色可以确认完全除去哌啶的，因为在哌啶溴酚蓝的存在不染色的肽。此外，这也有助于标记为进一步使用肽阵列。- 在最后的合成循环的Fmoc基团脱保护后，用DMF和100％的乙醇洗膜。然后，治疗与溴酚蓝（在DMF中的0.02％溴酚蓝），该膜为至少5分钟，直到它完全变为蓝色。
- 之后，用DMF和ETH洗膜anol随后干燥10分钟。现在拿出从合成膜，进行侧链去保护（1.8节）手动。如果需要的话，拍摄该膜以记录肽合成（ 图2）的结果。
- 侧链脱保护
- 处理该膜具有20至25ml侧链脱保护混合物由95％三氟乙酸（TFA）以裂解侧链保护基团和清除剂的试剂（2.5％水和2.5％三异丙基硅烷）保护的氨基酸侧链从在该步骤中修改。取脱保护混合物的足够体积，以确保它覆盖膜完全在密闭的化学抗性盒和孵化它为1至2小时，轻轻振动。
- 用20-25毫升DCM（二氯甲烷）中的每个2分钟洗膜6次，最后两次用100％乙醇和干燥它在干燥器过夜。
注：现在该膜可用于实验。肽阵列合成的方案在图1中被提供。
2.蛋白质表达与纯化
- PKMTs为GST的融合蛋白表达
- 使用标准技术，克隆编码全长PKMT或其催化域到细菌表达载体（如质粒pGEX-6P2），以将它表示为GST-融合蛋白的基因。
- 传输与所需的PKMT载体插入BL21或BL21密码加E.大肠杆菌细胞通过热休克方法或任何其它方法。
- 制备预培养用30ml的Luria-BERTANI（LB）培养基上表达的天孵育，在37℃下进行7至8小时，以连续摇动。
- 接着，转移的10ml预培养到含有1升LB培养基的2L大挡板烧瓶中并孵育37 °C的孵化器连续摇晃，直到达到文化ES在600nm确定的光密度。
注意：虽然这可以为每个蛋白进行优化，我们经常诱导在约0.8的OD 600nm处 。诱导温度对每个单独的蛋白质进行优化，一些蛋白质显示出良好的表达在22 ℃，一些在较高的温度。 - 转移细胞到感应温度15分钟，然后用诱导异丙基-β-D-硫代半乳糖苷为1mM，并允许培养中生长10-12小时，在诱导温度。
- 之后通过离心收获细胞，在5000×g离心15分钟，最后用30ml的STE缓冲液（10mM的Tris pH值8.0，100mM的氯化钠和0.1mM EDTA）并储存在-20℃用于进一步使用洗涤沉淀。
- 蛋白质纯化
- 解冻的细胞沉淀，并重新悬浮在30ml超声缓冲液（50mM的Tris pH值7.5，150mM的氯化钠，1mM的DTT和5％甘油）中，并通过超声处理破坏。
注：此缓冲区n电火工品必须为每个蛋白最终优化。 - 离心细胞裂解物在22000×g离心1小时，并且，以后收集上清液并通过含有600微升的谷胱甘肽琼脂糖4B树脂的柱中。
- 用50ml的超声缓冲液和下一个用100毫升高盐缓冲液（50mM的Tris pH值7.5，500mM的氯化钠，1mM的DTT和5％甘油）以除去非特异性结合的蛋白质的洗柱。洗脱结合的蛋白质用5毫升含40毫摩尔的谷胱甘肽高盐缓冲液中。
- 透析洗脱的蛋白在2L具有低甘油（20毫摩尔Tris pH值7.4，100mM的氯化钾，0.5mM的DTT和10％甘油）中2小时，之后在20mM Tris pH值7.4，100mM的氯化钾，0.5mM的透析缓冲液DTT和70％甘油8小时或过夜。确保所有的纯化缓冲液是在4℃下，并在冷室中进行蛋白质纯化，以避免蛋白质变性。
- 解冻的细胞沉淀，并重新悬浮在30ml超声缓冲液（50mM的Tris pH值7.5，150mM的氯化钠，1mM的DTT和5％甘油）中，并通过超声处理破坏。
3.肽阵列甲基化
- 预INCU肽阵列插管
- 执行肽阵列甲基无论是在一个盒子适当大小或在一个塑料袋，以避免酶和昂贵的放射性标记的AdoMet的浪费。预孵育的肽阵列膜在密封的塑料袋中含有不含酶的相应的甲基化缓冲液和标记的[甲基 - 3 H] -AdoMet 10分钟。缓冲器的体积取决于该阵列的大小，例如使用8个毫升甲基缓冲区满特异性轮廓的肽阵列。优化的量与所述的AdoMet的浓度每种酶。
- 肽阵列甲基化
- 丢弃预孵育缓冲液孵育包含各自PKMT膜在8ml甲基缓冲液和标记的[甲基 - 3 H] -AdoMet为1至2小时。
注：需要的甲基化反应的酶量取决于具体PKMT的活动中，我们通常开始我们的筛选实验用50纳米酶片人集中。
- 丢弃预孵育缓冲液孵育包含各自PKMT膜在8ml甲基缓冲液和标记的[甲基 - 3 H] -AdoMet为1至2小时。
- 肽阵列洗
- 随后丢弃在放射性废物容器中的甲基化缓冲液，用20ml含有100mM碳酸氢铵和1％SDS缓冲液洗肽阵列为5次，每次5分钟，以除去结合的蛋白质。丢弃在放射性废物容器的洗涤液。
- 检测的放射性信号
- 在洗涤后孵育该膜5分钟在10毫升扩增溶液（NAMP100V）。
- 然后，丢弃扩增溶液进入放射性废物容器有机溶剂，密封在一个塑料袋肽阵列并把它放在一个纸盒放射自显影。
- 将放射自显影胶片在黑暗的房间肽阵列上。仔细关闭磁带和暴露-80 °下所需的时间。然后，开发对结果进行分析的膜。捕捉图像几次不同博览会的n次，以避免强甲基化的肽底物饱和。
4.数据处理和分析
- 现货强度的光密度分析
- 扫描该膜在传统的扫描仪和通过光密度分析的斑点强度。做到这一点使用ImageJ（这是免费）或商业计划。
注：我们使用Phoretix软件这一任务。
- 扫描该膜在传统的扫描仪和通过光密度分析的斑点强度。做到这一点使用ImageJ（这是免费）或商业计划。
- 规范化和结果从不同的膜的平均
- 进行肽阵列甲基实验至少重复三次。正常化扫描强度为每个实验通过背景减除和设置的活性在参考衬底作为1.0。平均化的数据为各个斑点并报告它们作为平均值和标准偏差。
- 数据分析和显示
- 绘制使用灰度或彩色方案来表示的相对活性在二维的数据。做到这一点的Wi日Excel或SIGMAPLOT如下图所示。此外，准备反复实验的标准偏差的分布曲线来分析数据的质量。
- 比较和定量显示了认可，在底物肽的每个残基的精度，计算PKMT的每个氨基酸我在位置x由判别因子D 16,17的相对优先级：
二维X; I = <VĴ≠I> / V I - 1
其中v i是所述肽的变体携带I氨基酸在位置x和甲基化的速率<VĴ≠I>是所有19肽携带不同氨基酸Ĵ≠我在位置x的甲基的平均速率（包括野生型序列）。
注：本定义的歧视因素取决于本底水平。如果只有一个残基被接受在某一位置与背景的3％，则判定得到32.3因素。没有偏好的位置处造成的0的识别因素。
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Representative Results
肽阵列被成功地用于生化表征PKMTs的特异性，和几个新的组蛋白和非组蛋白PKMT的衬底被确定通过该方法5,16-19。定义PKMT（或任何酶）的正确基材频谱是迈向它的分子机制和细胞功能的理解的重要一步。
作为肽的SPOT阵列甲基方法的应用的一个例子，我们描述了NSD1 PKMT 19的特异性分析的结果。以前的我们的工作，这种酶被描述为甲醇几个基材，包括组蛋白H3的K36和组蛋白H4的K20也是NF-kB的转录因子家族成员P65在K218和K221。 图。图4A示出了具有NSD1肽阵列的甲基化反应的一个例子。对于此实验的基础上，H3大肽阵列合成（31-49）序列，它包含所有可能的单个氨基酸的原序列的改变，以测试各氨基酸为NSD1相互作用和甲基化的意义。在总共380肽合成（20种可能的氨基酸×18残渣加每行一原H3序列）。横轴表示的肽的序列，并在垂直方向上的氨基酸被改变在相应的肽表示。例如，该点在第17行第4列包含一个苏氨酸在第三位置，而不是甘氨酸中存在的野生型序列（ 图4A）。以这样的方式，生成点突变，以测试NSD1的偏爱每个天然氨基酸在所述肽底物的每个位置。甲基化与NSD1表明其特异性作用于H3K36和其对靶赖氨酸的从34至38任一侧的偏好。
图4B代表三肽序列甲基化的整合实验NSD1。的量化信息是从单个的肽阵列获取和结果进行标准化和平均的，如上所述。个体平均值的标准偏差表明，数据是高度可重复的。整体85％左右的肽显示了SDS小于20％和肽底物的97％以上的显示出SDS小于30％（ 图4C）。此外，我们还计算的判别因子，以精确地确定每个氨基酸的在测试位置的贡献。如所描述的所提供的肽的定量描述读出和氨基酸在特定位置（ 图5A）的偏好。我们的数据显示，NSD1喜欢芳香族氨基酸残基在-2位置（考虑K36的位置0）（F> Y> G）;疏水残基-1（I> L> V）; +1（R> QKNM），如不能耐受疏水性或芳香残留基本残留;和路政署在2 rophobic残渣（V> IA> P）。在其它部位（如-3，3，或6），NSD1喜欢一些氨基酸，但没有检测到强烈的残留物的特定的读出。
基于此信息，潜在的新的肽底物可以通过数据库检索中找到喜欢使用Scansite 20（ 图5B）。这些肽制备的斑点阵列，包括阳性和阴性对照，并孵育NSD1和放射性标记的AdoMet识别它们的被甲基化的肽的水平（ 图5C）的子集。作为跟随起坐，肽阵列可以制备包括肽的变体，其中靶赖氨酸被丙氨酸取代，以确认的甲基化发生在预测的位点。然后，在目标蛋白或它们的含有靶赖氨酸的子域可被重组产生和甲基化还测试了在蛋白质水平。最后，根据不同的结果，后续的实验我可以如果该甲基化还发生在细胞和其生物学作用有nvestigate。
图1：肽合成的纤维素膜的SPOT方法的计划， 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：沾上溴酚蓝确认肽的合成肽阵列的例子，请点击这里查看此图的放大版本。
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图3：肽阵列甲基实验的方案;肽阵列被甲基温育与PKMT和标记的[甲基- 3 H] - -AdoMet在适当的缓冲液中。后来转移到每个点的放射性是由放射自显影检测。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：用NSD1 PKMT A）一种底物特异性的肽阵列NSD1使用H3（31-49）序列作为模板的实施例得到的实施例的结果。横轴表示的H3序列，而垂直轴表示氨基酸由相应的行被突变。第一行包含肽原始序列。B）从3个独立肽阵列甲基化实验NSD1结果整合，数据正常化。C）分布的标准差在面板B.从Kudithipudi 等转载显示的平均甲基化后的数据进行平均，从三个实验的结果人（2014年）与一些修改19。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：新型PKMT基板发现A）的 NSD1歧视因子识别的氨基酸残基在位置旁边的目标赖氨酸（K36在实验此处示出）。这些数据显示，NSD1喜欢芳香族残基在-2 Position（考虑K36的位置0）。疏水残基是在-1和2的位置识别，尽管在细节显着差异。在1位点碱性残基和酰胺是优选的。在其他网站一些薄弱的喜好，但没有强烈的残留具体的读数进行检测。B为例，在搜索的Scansite）截图，用确定的NSD1。C）包含几个预言小说NSD1阳性在一起基板肽点阵列（H3K36的特异性简介）和阴性对照（H3K36A）。一些前提的新靶标进行了强烈的甲基化（他们中的一些注释），在其他情况下的预测无法核实。 A组和C从Kudithipudi 等转载。（2014）与一些修改19。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 基地 | 的1M Oxyma纯的NMP - > 2,13克Oxyma纯在15毫升NMP中 |
| 催化剂 | 2.4毫升-N，N'-Diisopropylcarbodiimide在15毫升NMP中 |
| 旋盖混合 | 在DMF中的20％乙酸酐 - >6毫升乙酸酐在30毫升DMF中 |
| FMOC去保护 | 在DMF中的20％哌啶 - > 200毫升千毫升DMF中 |
| 侧链脱保护 | 900微升三异丙基硅烷+ 600微升DDH 2 O的 30毫升TFA |
| 染色 | 在DMF中的0.02％溴酚蓝 |
表1：化学混合物以及它们在协议中使用的组合物。
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Discussion
如这里所描述的SPOT合成是一个功能强大的方法来映射蛋白质 - 蛋白质相互作用位点，并调查肽修饰酶的底物识别。然而，SPOT合成仍有某些缺点，因为虽然由点法合成的肽被报道具有90％以上的纯度21这难以确认在每个实例。因此，结果必须通过其他方法，例如使用蛋白质结构域或与通过标准方法合成的纯化的肽被再现。另外，点阵列的另一主要缺点是，大多数时候它们不能被重新使用来进行几个试验以一个阵列。
以增加合成具有低稳定性的氨基酸的效率，如被保护的精氨酸，是很重要的，以使它们的新鲜为每5个周期。在酶促反应或蛋白质结合研究它经常观察到的肽斑点的周边具有莫再比中心（“环斑效应”）的信号强度。这种效果可能是由于肽在光点的中心部分的高密度，然后它可通过按比例缩小的肽合成22来解决。对于肽进一步故障排除合成机器手册和公司服务应咨询。如果甲基化没有观察到，阳性对照肽（ 即公知的由所研究的酶被甲基化的肽）应添加到该膜。
替代品SPOT阵列，高密度肽微阵列23顷可用，但他们更昂贵，并且需要特殊设备的使用。此外每点的肽的量是较小的，这需要更灵敏的读出的程序。蛋白质阵列也可用来研究这些函数24,25，但是它们更难以制备，因为每个单独的蛋白需要被表达和纯化，并阵列上的蛋白折叠需要维护。多肽阵列的另一个优点是在合成过程中可能引入的翻译后修饰和易于单个氨基酸残基的作用的突变的测试。
它是一个重要的出发点这个协议中，至少有一种肽鉴定，这是由所研究的酶甲基化。甲基化的条件和缓冲液必须进行优化，以及甲基的浓度。甲基化的示范性时间进程必须确定以避免最好衬底，这将导致动态范围的损失的完全甲基化。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
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