Abstract
Lysine methylering is een nieuwe post-translatie modificatie en is geïdentificeerd verschillende histon en niet histon eiwitten, waar het speelt cruciale rol in celontwikkeling en vele ziekten. Circa 5000 lysine methylatie sites werden geïdentificeerd op verschillende eiwitten, die door enkele tientallen eiwit lysine methyltransferases zijn ingesteld. Dit suggereert dat elke PKMT methyleert meerdere eiwitten echter tot nu toe slechts één of twee substraten geïdentificeerd voor verscheidene van deze enzymen. Om dit probleem aan te pakken, hebben we geïntroduceerd peptide array gebaseerde substraat specificiteit analyses van PKMTs. Peptide arrays zijn krachtige instrumenten om de specificiteit van PKMTs karakteriseren omdat methylatie van diverse ondergronden met verschillende sequenties kunnen worden getest op een array. We gesynthetiseerd peptide arrays op cellulosemembraan met behulp van een Intavis SPOT synthesizer en de specificiteit van de verschillende PKMTs geanalyseerd. Op basis van de resultaten voor een aantal van deze enzymen, nieuwe substrates konden worden geïdentificeerd. Bijvoorbeeld voor NSD1 door gebruik peptide arrays hebben we aangetoond dat het methyleert K44 van H4 plaats van de gerapporteerde H4K20 en bovendien H1.5K168 is het substraat sterk de voorkeur boven de eerder bekende H3K36. Vandaar peptide arrays zijn krachtige tools om biochemisch karakteriseren de PKMTs.
Introduction
In de laatste twee decennia, verschillende rapporten het belang aangetoond van post-translationele modificaties (PTM) in cellulaire ontwikkeling en verschillende ziekten zoals kanker, maar onlangs eiwit lysine methylatie heeft ontpopt als een ander vitaal PTM. Terwijl aanvankelijk histon lysine methylering bleek een essentiële chromatine merk zijn latere werk toonde ook lysine methylatie van verschillende non-histon-eiwitten 1-4. De sequentiële overdracht van methylgroepen van S-adenosyl-L-methionine de ε-aminogroep van lysineresten wordt gekatalyseerd door een familie van enzymen genaamd Protein Lysine methyltransferase (PKMTs) dat meer dan 60 eiwitten in het menselijk genoom. PKMTs werden oorspronkelijk ontdekt als histon-modificerende enzymen die specifiek lysine residuen methyleren maar later rapporten aangetoond dat zij ook kunnen methyleren niet-histon-eiwitten 5. Tot nu werden ongeveer 5000 lysine methylatie locaties die op verschillende proteïnen 6
Peptide arrays worden veel gebruikt hulpmiddelen voor biochemische analyse van antilichamen, peptide modificerende enzymen en in kaart brengen van eiwit-eiwit interactie plaatsen (antilichaam-antigeen, receptor-ligand) 7-9. Enkele honderden peptiden zijn nodig voor such toepassingen. Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor peptidesynthese, waaronder peptidesynthese op hars wordt zeer algemeen gebruikt, maar heeft beperkingen op doorvoer en is relatief duur. Deze problemen werden opgelost met de introductie van de SPOT-synthesewerkwijze van Frank en collega 10. Werkwijze SPOT synthese laat synthese van honderden peptiden in parallel en gemiddeld is goedkoop in vergelijking met hars synthese. De peptiden gesynthetiseerd op cellulose membraan kan direct worden gebruikt voor diverse toepassingen of peptiden kunnen worden afgesplitst van het membraan en gebruikt als vrije peptiden in oplossing assays of peptide microarrays 10-13 bereiden.
SPOT-synthese is een variant van de vaste fase peptidesynthese, die een cellulose membraan als een vaste drager gebruikt en gebruikt de standaard Fmoc-chemie 10-13. Vandaar de synthese van peptideketens begint bij het C-terminale uiteinde en verloopt naarhet N-terminale uiteinde in tegenstelling tot de biologische synthese van ribosomen. Cellulose membranen worden gefunctionaliseerd voor bevestiging van de eerste geactiveerde aminozuren (Fig. 1). De SPOT methode is gebaseerd op de sequentiële afgifte van geactiveerde aminozuren in een druppel oplosmiddel gedefinieerde vlekken op het membraan met behulp van een geautomatiseerd pipetteersysteem. De druppel vloeistof wordt afgegeven aan het poreuze membraan vormt daar een cirkelvormige natte plek, die later fungeert als een open reactor voor chemische reacties in peptidesynthese. De vlekgrootte wordt bepaald door het gedoseerde volume en de absorptiecapaciteit van het membraan, wordt een veelvoud van dergelijke plaatsen gerangschikt als arrays. De schaal van de synthese correleert met de spotgrootte en de belastbaarheid van het membraan. De afstand tussen de spots en de dichtheid arrays worden beheerd door het variëren van de vlekgroottes. Cellulose membraan heeft verscheidene voordelen zoals vaste fase peptidesynthese, is goedkoop, tolerant voor de chemieALS in peptidesynthese stabiel in waterige oplossingen en gemakkelijk te hanteren. Daarnaast zijn hydrofiele aard maakt het voor verscheidene biologische testsystemen. SPOT synthese kan handmatig worden uitgevoerd of geautomatiseerd (voor 1000 van peptiden) afhankelijk van het vereiste aantal peptiden. Een volledig geautomatiseerde SPOT synthesizer van Intavis (Köln, Duitsland) wordt gebruikt voor onze toepassingen. Het maakt de synthese van peptiden in verschillende hoeveelheden en verschillende lengte. Lineaire peptiden regelmatig gesynthetiseerd met 15 tot 20 aminozuren lang, bovendien peptiden van maximaal 42 aminozuren kunnen ook worden bereid door stapsgewijze synthese 14,15. Echter, het verhogen van het aantal aminozuren leidt tot een vermindering van de totale koppelingsopbrengsten, die de kwaliteit van de peptiden beïnvloedt. Vanwege de kleine hoeveelheid peptiden per vlek, de producten zijn vaak moeilijk te zuiveren en de kwaliteit van de afzonderlijke peptiden niet gemakkelijk worden beoordeeld. Daarom zijn de resultaten verkregen uit SPOT Peptide arrays worden bevestigd hetzij peptiden gesynthetiseerd door standaard werkwijzen in grotere schaal, die kan worden gezuiverd en volgens de normen peptidesynthese of door het synthetiseren van de eiwitten die het gewenste peptide sequenties geanalyseerd. Toch vonden we de SPOT synthese zeer betrouwbaar te zijn en leidt doorgaans reproduceerbaar te zijn. SPOT synthese niet beperkt tot aminozuren, diverse commercieel verkrijgbare gemodificeerde aminozuren kan ook worden gebruikt voor synthese proteïnogene, waardoor peptiden te modificeren vóór en na de uiteindelijke splitsing van de zij keten beschermingsgroep en bovendien het laat ook incorporatie van gefosforyleerd, gemethyleerd of geacetyleerd aminozuren 11.
Geïmmobiliseerde peptidebibliotheken gesynthetiseerd door de SPOT werkwijze kan direct worden gebruikt voor vele biologische en biochemische assays. We gebruikten peptide arrays omvattende 300-400 peptiden aan de substraatspecificiteit van PKMTs onderzoeken. Voor enzymatische wijzikation, worden de peptide arrays geïncubeerd met de respectievelijke PKMT en gelabeld [methyl- 3H] -AdoMet in een geschikte buffer. De methylering van de desbetreffende substraat wordt geanalyseerd door de enzymatische overdracht van het radioactief gemerkte methylgroepen van AdoMet het peptidesubstraat door autoradiografie (Fig. 3). Door deze procedure het peptide arrays mogelijk de studie van methylering van verschillende peptide- substraten tegelijk. Een belangrijk voordeel van deze methode is dat alle peptiden gemethyleerd in competitie, zodanig dat gedurende de lineaire fase van de methylering kinetiek, de relatieve methylering van elk peptide is evenredig met de katalytische snelheidsconstante gedeeld door de dissociatie constante (k cat / K D) van het enzym voor de betreffende peptidesubstraat. Daarom wordt de hoeveelheid radioactiviteit opgenomen in elke plek direct gecorreleerd met de enzymatische activiteit voor de specifieke peptide. DeResultaten van een peptide-array methylering experiment, kan het specifieke profiel van de PKMT worden bepaald en op basis van deze nieuwe substraten kan worden gegrond. Peptide arrays kan de snelle en kostenefficiënte validatie van de methylering van nieuwe substraten op de peptide-niveau. Hiervoor worden arrays voorbereid dat de voorspelde roman substraten samen met gewijzigde peptiden met een Ala in plaats van Lys op het doel bezienswaardigheden, evenals de positieve en negatieve controle peptiden bevatten. Tenslotte kunnen de nieuwe substraten worden bereid eiwitten met mutanten, waarbij het doel Lys veranderd naar Ala en de methylering kan worden bevestigd op het eiwitniveau. Afhankelijk van de resultaten, dit wordt gevolgd door biologische onderzoeken naar mogelijke rol van de methylering van de nieuw beschreven eiwitsubstraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van Peptide Arrays
- Programmering van de peptidesequenties
- Ontwerp peptidesequenties voor de synthese met de MultiPep Spotter software. Voer het peptide sequenties in enkele letter codes.
Peptide 1: TARKSTGGKA - Genereer alanine of arginine lopen bibliotheken met een specifieke opdracht (.Plaats, A) om de belangrijke aminozuren die nodig zijn voor de erkenning van een bepaald substraat screenen. Bijvoorbeeld in het volgende voorbeeld de eerste lijn is de wildtype sequentie en van de tweede regel elk aminozuur in een peptide gewijzigd in alanine sequentieel.
vervangen, A
TARKSTG
Een -ARKSTG
T- Een -RKSTG
TA-A -KSTG
TARGET Een -STG
TARK- Een -TG
TARKS- A -G
TARKST- A - Gebruik van soortgelijke opdrachten (.Plaats R,.Vervang N etc.) zoals beschreven in 1.1.2 met alle beschikbare natuurlijke aminozuurresiduen (eventueel weglaten cysteïne, methionine en tryptofaan, omdat deze resten zijn gevoelig voor oxidatie en soms lager synthese opbrengst) van een peptide-array synthetiseren voor het vaststellen consensus substraat sequentie motief voor een enzym.
Opmerking: Zoals getoond in figuur 4A, de horizontale as de gegeven peptidesequentie en de verticale as de aminozuren die zijn geselecteerd commando. Vergelijkbaar met de in 1.1.2 sequentie A op de verticale as betekent dat een Ala opeenvolgend vervangt elke positie van de gegeven sequentie in de eerste rij in Fig. 4A. Evenzo arginine achtereenvolgens vervangt elk aminozuur in de tweede rij en zo verder met de andere aminozuren. Compleet peptide-array bibliotheken worden gesynthetiseerd door systematisch elk residu te vervangen in de verstrekte peptidensubstraat opeenvolging met elk van the andere natuurlijk beschikbaar aminozuurresiduen, dit helpt om de invloed van elke rest op elke positie van de bepaalde sequentie begrijpen. - Alternatief kan methylering van bekende of voorspelde peptide substraten gemakkelijk worden geverifieerd synthetiseren peptide bibliotheken de targetpeptiden van de PKMT samen met positieve en negatieve controles methylering (bijvoorbeeld peptiden waarvan bekend gemethyleerd of bekende niet gemethyleerd zijn). Synthetiseren peptiden door het uitwisselen van de vermeende doelwit lysine alanine aan methylatie van het doel lysine bevestigen, zoals hieronder getoond door handmatig programmeren.
Wild-type peptide: STGG K PRQFL
Mutant peptide: STGG Een PRQFL
OPMERKING: De software heeft ook inherent scripts om verschillende bibliotheken te maken, net als epitoopmapping met een gewenste kader verschuiving van de reeks aan belangrijke aminozuren die nodig zijn voor een interactie in kaart.
- Ontwerp peptidesequenties voor de synthese met de MultiPep Spotter software. Voer het peptide sequenties in enkele letter codes.
- Voorbereiding van Membrane, Aminozuren eend Reagentia
- Pre-zwellen de SPOT-membraan in DMF (N, N-dimethylformamide) gedurende 10 minuten en plaats dan de natte membraan op de SPOT-synthesizer kader zonder luchtbellen of rimpels.
- Was het membraan driemaal met 100% ethanol. Droog de membranen geheel ten minste 10 minuten voordat het synthese-programma.
- Tegelijkertijd vers bereid 0,5 M werkende concentraties van commercieel verkrijgbare Fmoc-beschermde aminozuren op te lossen in NMP en ook de activator en de basis bereiden zoals beschreven in tabel 1.
- Zorg ervoor dat al het afval oplossing containers van de SPOT-synthesizer werden geleegd en vul het oplosmiddel reservoirs met de DMF, ethanol en piperidine.
LET OP: De machine is nu klaar voor de synthese.
- Spotten van het eerste aminozuur
- Om de amide band met de vrije aminogroep op het membraan te genereren, het activeren van de carboxylgroep van de inkomende aminozuur door adding de activator (N, N '-Diisopropylcarbodiimide) en basische oplossing (Ethyl hydroxyimino cyaanacetaat) het aminozuurderivaat.
- Spot de gewenste hoeveelheden van geactiveerde aminozuren aan de amino-PEG gefunctionaliseerd membraan met de programmeerbare robot.
OPMERKING: Daardoor wordt de C-terminus van het aminozuur gekoppeld aan de aminogroep van het membraan. - Herhaal deze stap drie keer betere koppeling van de eerste geactiveerde aminozuur waarborgen. Incubeer het membraan gedurende 20 minuten en daarna wassen met DMF tot ontkoppelde aminozuren te verwijderen.
- Het blokkeren van de Vrije Ruimten on Non-spot Gebieden
OPMERKING: Na de koppeling van de eerste C-eindstandige aminozuur van peptiden aan de aminogroep van het membraan, kan de aminogroepen tussen de vlekken en ook enkele van de aminogroepen in de spot gebieden niet banden met de amino- zuren.- Blokkeer deze vrije aminogroepen door incubatie met de aftopping (20% azijnzuuranhydride in DMF)gedurende 5 min.
Opmerking: Dit vermijdt de koppeling van aminozuren in de verdere cycli met het membraan in plaats van de groeiende peptideketen.
- Blokkeer deze vrije aminogroepen door incubatie met de aftopping (20% azijnzuuranhydride in DMF)gedurende 5 min.
- Verwijdering van Fmoc Group
- Na de blokkering, was het membraan met DMF 4 keer en dan incubeer met 20% piperidine in DMF gedurende 20 min aan de Fmoc bescherming groep te verwijderen.
OPMERKING: Deze stap leidt tot verwijdering van de amino beschermende Fmoc groepen en wordt deprotectie genoemd. - Daarna was de membraan tweemaal met DMF en tweemaal met ethanol en laat ze drogen.
OPMERKING: Nu de membraan is klaar voor de koppeling van de volgende aminozuren.
- Na de blokkering, was het membraan met DMF 4 keer en dan incubeer met 20% piperidine in DMF gedurende 20 min aan de Fmoc bescherming groep te verwijderen.
- Kettingverlenging
OPMERKING: toevoegen van elk aminozuur wordt een cyclus genoemd. Naast het koppelen van eerste aminozuur, de cyclus begint met de ontscherming van de Fmoc groep van de gekoppelde aminozuur en wordt gevolgd door het koppelen van de geactiveerde carboxylgroep van een inkomende aminozuur aan de aminogroep van de groeiende peptij keten.- Herhaal de stappen 1.3 en 1.5 totdat het gewenste peptide lengte is bereikt.
- Vlekken
OPMERKING: Na de laatste cyclus, worden de peptide arrays gekleurd met broomfenolblauw aan de geslaagde synthese van peptiden te bevestigen. Broomfenolblauw bindt met de vrije aminogroepen van de peptiden. Peptide vlekjes lichtblauwe kleur na kleuring maar de intensiteit van de vlekken varieert afhankelijk van de peptidesequentie. Deze kleuring maakt bevestiging van de volledige verwijdering van piperidine, want in aanwezigheid van piperidine broomfenolblauw niet de peptiden vlekken. Bovendien helpt dit ook om de peptide arrays voor verder gebruik markeren.- Na de Fmoc-groep ontscherming in de laatste synthesecyclus, was het membraan met DMF en 100% ethanol. Vervolgens behandel het membraan met broomfenolblauw (0,02% broomfenolblauw in DMF) gedurende ten minste 5 minuten tot het volledig blauw.
- Daarna was het membraan met DMF en ethanol gevolgd door drogen gedurende 10 min. Haal nu het membraan van de synthesizer en het uitvoeren van zijketen verwijdering van de bescherming (paragraaf 1.8) met de hand. Indien nodig, fotograferen het membraan naar de resultaten van de peptidesynthese (fig. 2) documenteren.
- Side Chain Deprotectie
- Behandel de membranen 20 tot 25 ml zijketen ontscherming mengsel bestaande uit 95% trifluorazijnzuur (TFA) aan de zijketen bescherming groepen scavenger-reagentia (2,5% water en 2,5% triisopropylsilaan) aan de zijketens van aminozuren tegen splitsen modificatie tijdens deze stap. Neem een voldoende hoeveelheid deprotectie mengsel te verzekeren dat daaronder het membraan volledig in een goed gesloten chemisch bestendige doos en incubeer het gedurende 1-2 uur onder zacht schudden.
- Was het membraan zesmaal 20-25 ml DCM (dichloormethaan) gedurende 2 minuten elk en tenslotte tweemaal met 100% ethanol en drogen in een exsiccator een nacht.
OPMERKING: Nuhet membraan kan worden gebruikt voor experimenten. Een schema van het peptide-array synthese wordt gegeven in figuur 1.
2. eiwitexpressie en zuivering
- Eiwit Expressie van PKMTs als GST Fusions
- Met behulp van standaard technieken, kloneren van het gen dat codeert voor de volledige lengte PKMT of het katalytische domein in een bacteriële expressievector (zoals pGEX-6p2) uit te drukken als GST-fusie-eiwit.
- Breng de vector met de gewenste PKMT invoegen in BL21 of BL21 codon plus E. coli cellen door hitteschok methode of enige andere methode.
- Bereid een voorkweek met 30 ml Luria-Bertani (LB) media op de dag van expressie en incubeer bij 37 ° C gedurende 7-8 uur onder voortdurend schudden.
- Vervolgens overdracht 10 ml van de voorkweek in een 2 L grote baffled kolven met 1 L LB media en incuberen bij 37 ° C in de incubator onder voortdurend schudden totdat de kweek bereikes een bepaalde optische dichtheid bij 600 nm.
Opmerking: deze kan worden geoptimaliseerd voor elk eiwit, we routinematig induceren bij een OD 600 nm van ongeveer 0,8. De inductie temperatuur moet worden geoptimaliseerd voor elk eiwit individueel, sommige eiwitten vertonen een goede expressie 22 ° C en sommige bij hogere temperaturen. - Schakel de cellen om de inductie temperatuur gedurende 15 minuten, vervolgens induceren met 1 mM isopropyl-bèta-D-thiogalactopyranoside en laat de kweek groeien gedurende 10-12 uur bij inductietemperatuur.
- Daarna oogsten van de cellen door centrifugatie bij 5000 xg gedurende 15 min en tenslotte de pellet te wassen met 30 ml STE buffer (10 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl en 0,1 mM EDTA) en bewaar bij -20 ° C voor verder gebruik.
- Protein Purification
- Ontdooi de celpellet en resuspendeer in 30 ml sonicatiebuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT en 5% glycerol) en verstoren door sonicatie.
LET OP: Deze buffer nEEDS worden geoptimaliseerd voor elk eiwit uiteindelijk. - Centrifugeer het cellysaat bij 22.000 xg gedurende 1 uur en later verzamel de bovenstaande vloeistof en het door een kolom bevattende 600 pi van glutathion Sepharose 4B-hars.
- Was de kolom met 50 ml sonicatiebuffer en vervolgens met 100 ml buffer met hoog zoutgehalte (50 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT en 5% glycerol) om aspecifiek gebonden eiwitten te verwijderen. Elueer de gebonden eiwit met 5 ml buffer met hoog zoutgehalte die 40 mM glutathion.
- Dialyseer het geëlueerde eiwit in 2 L dialysebuffer met lage glycerol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCI, 0,5 mM DTT en 10% glycerol) gedurende 2 uur en later in 20 mM Tris pH 7,4, 100 mM KCI, 0,5 mM DTT en 70% glycerol voor 8 uur of 's nachts. Controleer de zuivering buffers bij 4 ° C en voer de eiwitzuivering in de koude kamer eiwitdenaturatie te voorkomen.
- Ontdooi de celpellet en resuspendeer in 30 ml sonicatiebuffer (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT en 5% glycerol) en verstoren door sonicatie.
3. Peptide Array methylatie
- Pre-INCUbation van Peptide Arrays
- Voer peptide matrix methylering hetzij in een doos van geschikte grootte of in een plastic zak om de verspilling van enzym en dure radioactief gelabeld AdoMet voorkomen. Pre-incubeer het peptide-array membraan in afgesloten plastic zak met de respectieve methylatie buffer zonder enzym en gelabeld [methyl-3H] -AdoMet gedurende 10 min. Het volume buffer afhankelijk van de grootte van de matrix gebruiken, bijvoorbeeld 8 ml methylering buffer voor een volledige specificiteitsprofiel peptide array. Optimaliseren van de hoeveelheid en concentratie van de AdoMet voor elk enzym.
- Methylatie van Peptide Arrays
- Gooi de pre-incubatie buffer en incubeer het membraan 8 ml methylering buffer met de respectievelijke PKMT en gelabeld [methyl-3H] -AdoMet 1 tot 2 uur.
OPMERKING: De hoeveelheid enzym nodig is voor een methylatie reactie hangt af van de activiteit van specifieke PKMT initiëren we onze screening experimenten typisch met 50 nM enzym final concentratie.
- Gooi de pre-incubatie buffer en incubeer het membraan 8 ml methylering buffer met de respectievelijke PKMT en gelabeld [methyl-3H] -AdoMet 1 tot 2 uur.
- Wassen van Peptide Arrays
- Daarna de methylering buffer in een radioactief afval container weggooien en was de peptide arrays bij 5 maal met 20 ml buffer die 100 mM ammonium bicarbonaat en 1% SDS gedurende 5 min naar het gebonden eiwit te verwijderen. Gooi het wassen buffer in een radioactief afval container.
- Detectie van de Radioactieve Signal
- Na de wassingen incubeer het membraan gedurende 5 min in 10 ml oplossing Amplify (NAMP100V).
- Dan gooi de Amplify oplossing in het radioactief afval container voor organische oplosmiddelen, verzegeling van de peptide array in een plastic zak en zet het in een autoradiografie cassette.
- Plaats de autoradiografie film op de peptide array in de donkere kamer. Sluit de cassette zorgvuldig en bloot bij -80 ° C voor de nodige tijd. Vervolgens ontwikkelen de film om de resultaten te analyseren. Leg het beeld paar keer met verschillende exposition keer tot verzadiging van sterk gemethyleerd peptide substraten voorkomen.
4. Data Processing and Analysis
- Densitometrische Analyse van Spot intensiteiten
- Scan de film in een conventionele scanner en geanalyseerd plaatse intensiteiten met densitometrie. Doe dit met behulp van ImageJ (dat is freeware) of een commercieel programma.
NOTA BENE: Wij gebruiken Phoretix software voor deze taak.
- Scan de film in een conventionele scanner en geanalyseerd plaatse intensiteiten met densitometrie. Doe dit met behulp van ImageJ (dat is freeware) of een commercieel programma.
- Normalisatie en middeling van resultaten van verschillende Membranen
- Het gedrag van de peptide-array methylatie experimenten ten minste in drievoud. Normaliseren van de gescande intensiteiten voor elk experiment door achtergrond aftrekken en het instellen van de activiteit op een referentie-substraat als 1.0. Het gemiddelde van de gegevens voor de individuele plekken en meldt deze als gemiddelde waarden en standaarddeviaties.
- Data Analyse en Display
- Plot van de gegevens in 2D met behulp van een grijswaarden of kleur regeling om de relatieve activiteit aan te geven. Doe dit with Excel of Sigmaplot zoals hier getoond. Ook stelt een grafiek van de verdeling van de standaarddeviaties van de herhaalde experimenten om de kwaliteit van de gegevens te analyseren.
- Vergelijken en de nauwkeurigheid van de herkenning van elke rest in het substraat peptide weer kwantitatief bereken de relatieve voorkeur van de PKMT voor elk aminozuur op positie i x door discriminerende factor D 16,17:
D X; i = <V j ≠ i> / V i - 1
Waar v i is de snelheid van methylatie van de peptidevariant uitvoeren aminozuur ik op positie x en <v j ≠ i> is de gemiddelde snelheid van de methylatie van alle 19 peptiden met een ander aminozuur j ≠ i op positie x (met inbegrip van de wildtypesequentie).
OPMERKING: De discriminatie factor omschreven dit afhangt van de achtergrondniveau. Als slechts één rest wordt aanvaard in een bepaalde positie met een achtergrond van 3%, een discriminatiefactor 32.3 wordt verkregen. Geen voorkeur op een positie leidt tot een discriminatie factor van 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Peptide arrays werden met succes gebruikt om biochemisch karakteriseren de specificiteit van PKMTs, en verschillende nieuwe histon en niet-histon substraten van PKMT werden geïdentificeerd door deze aanpak 5,16-19. Het definiëren van de juiste substraat spectrum van een PKMT (of een enzym) is een essentiële stap op weg naar begrip van de moleculaire mechanisme en cellulaire functies.
Als voorbeeld van de toepassing van het peptide SPOT matrix methylering methode worden de resultaten van de specifieke analyse van de NSD1 PKMT 19. Vorige ons werk, werd dit enzym beschreven methylaat verschillende ondergronden, zoals histon H3 bij K36 en histon H4 bij K20, maar ook de NF-kB familie transcriptiefactor p65 bij K218 en K221. Fig. 4A toont een voorbeeld van een methylatie reactie van een peptide-array met NSD1. Voor deze experimenten werd een grote peptide-array op basis van de H3 (31-49) sequentie werd gesynthetiseerd dat alle mogelijke bevatenkele aminozuurveranderingen van de oorspronkelijke sequentie om de betekenis van elk aminozuur voor NSD1 interactie en methylatie testen. In totaal 380 peptiden werden gesynthetiseerd (20 mogelijke aminozuren x 18 residuen plus één origineel H3 volgorde in elke rij). De horizontale as geeft de sequentie van de peptide en in de verticale richting het aminozuur dat wordt gewijzigd in de overeenkomstige peptide aangegeven. Bijvoorbeeld, de vlek op regel 17 kolom 4 is een threonine op derde positie in plaats van glycine die in het wild type sequentie (fig. 4A) is. Op een dergelijke wijze worden puntmutaties gegenereerd om de voorkeur van NSD1 testen elke natieve aminozuur op elke positie in het peptidesubstraat. Methylering met NSD1 gebleken dat specifiek werkt op H3K36 en heeft voorkeur aan weerszijden van het doel lysine 34-38.
Figuur 4B geeft de consolidatie van de drie peptide-array methylatieexperimenten met NSD1. De kwantitatieve informatie werd verkregen uit de afzonderlijke peptide arrays en de resultaten werden genormaliseerd en gemiddeld zoals hierboven beschreven. De standaarddeviatie van de individuele gemiddelden blijkt dat de gegevens zeer reproduceerbaar. Algehele ongeveer 85% van de peptiden toont SDS kleiner dan 20% en meer dan 97% van de peptide substraten aangetoond VB kleiner dan 30% (Fig. 4C). Daarnaast hebben we ook berekend discriminatie factor om de bijdrage van elk aminozuur bij de onderzochte positie nauwkeurig bepalen. Zoals beschreven verschaft de kwantitatieve beschrijving van de peptide uitgelezen en voorkeur van aminozuren op een specifieke positie (Fig. 5A). Onze gegevens tonen aan dat NSD1 verkiest aromatische resten aan het -2 positie (gezien K36 als stand 0) (F> Y> G); hydrofobe residuen op -1 (I> L> V); basische residuen op 1 (R> QKNM), waar het hydrofobe of aromatische resten kunnen verdragen; en hydrophobic residuen op 2 (V> IA> P). Op andere sites (zoals -3, 3 of 6), NSD1 geeft de voorkeur aan sommige aminozuren, maar geen sterke residu specifieke uitlezing werd ontdekt.
Op basis van dit profiel, kunnen potentiële nieuwe peptide substraten worden gevonden door de database zoekopdrachten zoals het gebruik van Scansite 20 (Fig. 5B). Deze peptiden werden bereid op een SPOT matrix waaronder positieve en negatieve controles en geïncubeerd met NSD1 en radioactief gelabeld AdoMet om een subset daarvan die gemethyleerd op peptideniveau (fig. 5C) identificeren. Als follow-ups kunnen peptide arrays worden bereid die peptide varianten, waarbij het doel lysine wordt vervangen door alanine omvatten, bevestigen dat methylatie vindt plaats op de voorspelde plaats. Vervolgens kunnen de eiwitten of subdomeinen daarvan die de doelwit lysine recombinant worden geproduceerd en de methylering ook getest op eiwitniveau. Tot slot, afhankelijk van de resultaten, follow-up experimenten kan ik nvestigate indien de methylering komt ook voor in cellen en biologische rol heeft.
Figuur 1:. Regeling van peptide synthese door de SPOT-methode op cellulosemembraan Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2:. Voorbeeld van een peptide-array gekleurd met broomfenolblauw tot de synthese van peptiden te bevestigen Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
Figuur 3: Schema van het peptide-array methylatie experiment; peptide arrays werden gemethyleerd door incubatie met PKMT en gelabeld [methyl- 3H] -AdoMet in een geschikte buffer. Daarna wordt het overgebracht naar elke plek radioactiviteit wordt gedetecteerd door autoradiografie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld resultaten verkregen met de NSD1 PKMT A) Voorbeeld van een substraatspecificiteit peptide array voor NSD1 met de H3 (31-49) sequentie als matrijs.. De horizontale as geeft de H3 sequentie en de verticale as de aminozuren waarmee de bijbehorende rij gemuteerd. De eerste rij bevat peptiden metoorspronkelijke volgorde. B) Consolidatie van de resultaten van 3 onafhankelijke peptide-array methylatie experimenten met NSD1, werden de gegevens gemiddelde resultaten van alle drie de experimenten na normalisering. C) Verdeling van standaardfouten voor de gemiddelde methylatie gegevens getoond in paneel B. Overgenomen uit Kudithipudi et al. (2014) met enkele wijzigingen 19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5:. Ontdekking van nieuwe PKMT substraten A) Discriminatie factoren NSD1 erkenning van aminozuurresten op de plaatsen naast de doelwit lysine (K36 in het experiment hier getoond). De gegevens tonen dat NSD1 voorkeur aromatische resten op de -2 positie (gezien K36 als stand 0). Hydrofobe residuen worden opgenomen tegen de -1 en +2 posities, zij het met opvallende verschillen in details. Op de 1 plaats basische residuen en amiden de voorkeur. Op andere sites enkele zwakke voorkeuren, maar geen sterke residu specifieke uitlezing werd gedetecteerd. B) Screenshot van een voorbeeld zoeken op Scansite, met behulp van de specificiteit profiel bepaald voor NSD1. C) Peptide SPOT array met meerdere voorspeld roman NSD1 substraten samen met de positieve (H3K36 ) en negatieve controles (H3K36A). Sommige van de voorspelde nieuwe targets waren sterk gemethyleerd (een aantal van hen geannoteerde), in andere gevallen de voorspellingen kon niet worden geverifieerd. Paneel A en C is overgenomen uit Kudithipudi et al. (2014) met enkele wijzigingen 19. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Base | 1 M Oxyma Pure in NMP -> 2,13 g Oxyma Pure in 15 ml NMP |
| Activator | 2,4 ml N, N '-Diisopropylcarbodiimide in 15 ml NMP |
| Aftopping Mengsel | 20% azijnzuuranhydride in DMF -> 6 ml azijnzuuranhydride in 30 ml DMF |
| Fmoc- Deprotectie | 20% piperidine in DMF -> 200 ml in 1,000 ml DMF |
| Sidechain Deprotectie | 900 ul triisopropylsilaan + 600 ul DDH O in 30 ml TFA 2 |
| Vlekken | 0,02% broomfenolblauw in DMF |
Tabel 1: chemische mengsels en hun samenstelling die wordt gebruikt in het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPOT synthese zoals hier beschreven is een krachtige methode om eiwit-eiwit interactie plaatsen in kaart en onderzoekt de substraatherkenning van peptide modificerende enzymen. Echter, SPOT-synthese nog steeds bepaalde nadelen, want hoewel de peptiden gesynthetiseerd door de SPOT werkwijze worden gerapporteerd aan meer dan 90% zuiverheid 21 hebben dit moeilijk te bevestigen telkens. Derhalve resultaten te worden overgenomen door andere werkwijzen bijvoorbeeld gebruik eiwitdomeinen of gezuiverde peptiden gesynthetiseerd door standaard werkwijzen. Bovendien, de andere grote nadeel van SPOT arrays is dat de meeste tijd kunnen niet worden hergebruikt voor verschillende assays uit te voeren met één array.
Om de efficiëntie van de synthese van aminozuren van lage stabiliteit te verhogen, zoals de beschermde arginine, is het belangrijk om ze vers voor elke 5 cycli maken. In enzymatische reacties of eiwitbinding studies wordt vaak waargenomen dat de omtrek van de peptide spot heeft more signaal intensiteit dan het centrum ("ring spot-effect"). Dit effect kan te wijten zijn aan de hoge dichtheid van peptiden in het centrale deel van de spot en dan kan worden opgelost door het terugbrengen van de peptidesynthese 22. Voor verdere trouble shooting van peptidensynthese de machine handboek en bedrijfsdiensten moeten worden geraadpleegd. Als methylering niet wordt waargenomen dat positieve controle peptiden (bijvoorbeeld peptiden bekende gemethyleerd door het enzym onderzochte) worden toegevoegd aan het membraan.
Plaatsvervanger van SPOT arrays, hoge dichtheid peptide micro-arrays 23 zijn beschikbaar, maar ze zijn duurder en vereisen speciale apparatuur voor gebruik. Verder is de hoeveelheid peptide per spot kleiner, die gevoeliger uitlezing procedures vereist. Eiwit arrays zijn ook beschikbaar voor deze functies 24,25 bestuderen, maar ze zijn moeilijk te bereiden omdat elk individu eiwit moet worden uitgedrukt en gezuiverd eneiwitvouwing op de array moet worden gehandhaafd. Een bijkomend voordeel van peptide arrays is de mogelijke invoering van post- translationele modificaties tijdens de synthese en het gemak van mutatie testen van de rol van individuele aminozuurresiduen.
Het is een essentieel uitgangspunt voor dit protocol, ten minste één peptide geïdentificeerd die gemethyleerd door het enzym onderzochte hebben. Methyleringsomstandigheden en buffers moeten worden geoptimaliseerd, alsmede de concentratie van de methyltransferase. Voorbeelden tijdsverloop van methylering moeten worden bepaald om volledige methylering van de beste substraat, waarbij verlies van dynamisch bereik zal veroorzaken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
