Abstract
Lysine méthylation est une modification post-traduction émergent et il a été identifié sur plusieurs protéines histones et non-histones, où il joue un rôle crucial dans le développement des cellules et de nombreuses maladies. Environ 5 000 sites de méthylation de la lysine ont été identifiés sur différentes protéines, qui sont fixés par quelques douzaines de protéines méthyltransférases de lysine. Ceci suggère que chaque PKMT méthylation de multiples protéines, mais jusqu'à présent, seulement un ou deux substrats ont été identifiés pour plusieurs de ces enzymes. Analyse réseau de peptides Pour aborder ce problème, nous avons introduit la spécificité de substrat à base de PKMTs. Tableaux peptidiques sont des outils puissants pour caractériser la spécificité de PKMTs parce méthylation de plusieurs substrats avec différentes séquences peut être testée sur un réseau. Nous avons synthétisé tableaux peptidiques sur membrane de cellulose en utilisant un synthétiseur Intavis SPOT et analysé la spécificité des différents PKMTs. Basé sur les résultats, pour plusieurs de ces enzymes, romanubstrates pu être identifiés. Par exemple, en employant pour NSD1 matrices de peptides, nous avons montré qu'il méthylation H4 K44 de la place de la H4K20 rapporté et en outre le substrat H1.5K168 est hautement préféré sur la H3K36 précédemment connu. Par conséquent, les tableaux peptidiques sont des outils puissants pour caractériser biochimiquement les PKMTs.
Introduction
Dans les deux dernières décennies, plusieurs rapports ont démontré l'importance des modifications post-traductionnelles (PTM) dans le développement cellulaire et plusieurs maladies comme le cancer, mais récemment protéines lysine méthylation a émergé comme une autre PTM vitale. Alors qu'initialement la méthylation des histones de la lysine a été jugée une marque essentielle de la chromatine, travail plus tard a également montré lysine méthylation de plusieurs protéines non-histones 1-4. Le transfert séquentiel des groupes méthyle de la S-adénosyl-L-méthionine dans le groupe des résidus de lysine ε-amino est catalysée par une famille d'enzymes appelée protéine Lysine méthyltransférases (PKMTs) qui contient plus de 60 protéines dans le génome humain. PKMTs ont d'abord découvert que la modification des histones enzymes qui méthylate résidus de lysine spécifique, mais des rapports ultérieurs ont démontré qu'elles pouvaient aussi méthylation des protéines non-histones 5. Jusqu'à présent, environ 5000 sites de méthylation de la lysine ont été identifiés sur différentes protéines 6
matrices de peptides sont des outils largement utilisés pour l'analyse biochimique des anticorps, des peptides et des enzymes de modification de la cartographie des sites d'interaction protéine-protéine (anticorps-antigène, récepteur-ligand) 9.7. Plusieurs centaines de peptides sont nécessaires pour Such applications. Différentes méthodes sont disponibles pour la synthèse des peptides, parmi lesquels Peptide Synthesis de résine est très couramment utilisée, mais elle présente des limites du débit et il est relativement coûteux. Ces problèmes ont été résolus avec l'introduction de la méthode de synthèse SPOT par Frank et ses collègues 10. Procédé de synthèse SPOT permet la synthèse de plusieurs centaines de peptides en parallèle et, en moyenne, il est peu coûteux par rapport à la synthèse de la résine. Les peptides synthétisés sur membrane de cellulose peuvent être utilisées soit directement pour diverses applications ou des peptides peut être clivé à partir de la membrane et utilisés comme peptides libres dans les analyses en solution ou pour préparer des puces à peptides 10-13.
Synthèse SPOT est une variante de la synthèse peptidique en phase solide, qui utilise une membrane de cellulose comme support solide et emploie la chimie classique Fmoc-10-13. Par conséquent, la synthèse des chaînes de peptides à partir de l'extrémité C-terminale et se dirige versl'extrémité N-terminale à la différence de la synthèse biologique des ribosomes. Les membranes de cellulose sont fonctionnalisées pour la fixation du premier amino-acides activés (Fig. 1). Procédé SPOT est basé sur la livraison séquentielle des acides aminés activés dans une gouttelette de solvant à des endroits définis sur la membrane en utilisant un système de pipetage automatisé. La gouttelette de liquide est distribué sur la membrane poreuse, où il forme une tache humide circulaire, qui agit ensuite comme un réacteur ouvert pour les réactions chimiques dans la synthèse des peptides. La taille du spot est déterminée par le volume distribué et la capacité d'absorption de la membrane, des multiples de ces taches sont disposées en rangées. L'échelle de la synthèse en corrélation avec la taille de la place et la capacité de chargement de la membrane. La distance entre les points et la densité de réseaux sont gérés en faisant varier les tailles de spot. membrane de cellulose a plusieurs avantages en tant que phase solide dans la synthèse peptidique, il est peu coûteux, tolérant à la chemicals utilisés en synthèse peptidique, dans des solutions aqueuses stables et faciles à manipuler. De plus, sa nature hydrophile rend approprié pour plusieurs systèmes d'analyse biologique. synthèse de SPOT peut être effectuée manuellement ou automatisé (pour 1000s des peptides) selon le nombre requis de peptides. Un synthétiseur de SPOT entièrement automatisé de Intavis (Köln, Allemagne) est utilisé pour nos applications. Il permet la synthèse de peptides en différentes quantités et de longueur différente. Peptides linéaires sont régulièrement synthétisés avec 15 à 20 amino acides de longueur, dans les peptides d'addition de jusqu'à 42 acides aminés peuvent également être préparés par synthèse par étapes 14,15. Cependant, l'augmentation du nombre d'acides aminés conduit à des réductions des rendements de couplage ensemble, ce qui affecte la qualité des peptides. En raison de la faible quantité de peptides par point, les produits sont souvent difficiles à purifier et la qualité de peptides individuels ne peuvent pas être facilement évalués. Par conséquent, les résultats obtenus à partir de SPOT Peptide matrices doivent être confirmées, soit avec des peptides synthétisés par des procédés standard à plus grande échelle, qui peuvent être purifiés et analysés selon les normes en synthèse peptidique ou par la synthèse des protéines contenant les séquences peptidiques souhaitées. Pourtant, nous avons trouvé la synthèse de SPOT pour être très fiable et des résultats généralement être reproductible. synthèse SPOT est pas limitée aux acides aminés protéinogènes, plusieurs acides aminés modifiés disponibles dans le commerce peuvent également être utilisés pour la synthèse, ce qui permet peptides à être modifiés avant et après le clivage final du groupe de protection de chaîne latérale et, en outre, elle permet également l'incorporation de acides aminés phosphorylés, méthylés ou acétylés 11.
Des banques de peptides immobilisés synthétisés par la méthode Spot peuvent être directement utilisés pour de nombreuses analyses biologiques et biochimiques. Nous avons utilisé des réseaux peptidiques comprenant les peptides 300-400 pour étudier la spécificité de substrat de PKMTs. Pour modifi enzymatiquecation, les matrices de peptides sont incubés avec la PKMT respectif et étiqueté [méthyl-3H] -AdoMet dans un tampon approprié. La méthylation du substrat respectif est analysé par la suite du transfert enzymatique des groupes méthyle à marqueur radioactif de l'AdoMet pour le substrat peptidique par autoradiographie (fig. 3). Par ce procédé, les tableaux peptidiques permettent l'étude de la méthylation de différents substrats peptidiques en même temps. Un avantage important de ce procédé est que tous les peptides sont méthylés en compétition, de telle sorte que pendant la phase linéaire de la cinétique de méthylation, la méthylation relative de chaque peptide est proportionnelle à la constante de vitesse catalytique divisée par la constante de dissociation (k cat / K D) de l'enzyme pour le substrat peptidique respective. Par conséquent, la quantité de radioactivité incorporée dans chaque spot est directement corrélée à l'activité enzymatique vers le peptide particulier. Utilisation de larésultats d'une expérience de méthylation de réseau peptidique, le profil de spécificité de la PKMT peuvent être définis et sur cette base de nouveaux substrats peut être fondée. Matrices peptidiques permettent la validation rapide et efficace et de coût de la méthylation de nouveaux substrats au niveau des peptides. Pour cela, on prépare des tableaux qui contiennent les nouveaux substrats prédites avec des peptides modifiés contenant une Ala à la place de Lys à des sites cibles ainsi que les peptides témoins positifs et négatifs. Enfin, les nouveaux substrats peuvent être préparés comme des protéines ainsi que des mutants, dans lequel la cible Lys est modifiée à Ala et la méthylation peut être confirmée au niveau de la protéine. Selon les résultats, ce est alors suivi par des études biologiques portant sur les rôles potentiels de la méthylation des substrats protéiques nouvellement décrites.
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Protocol
1. Préparation d'un peptide Arrays
- Programmation de la séquences peptidiques
- Concevoir des séquences peptidiques pour la synthèse en utilisant le logiciel MultiPep spotter. Entrez les séquences peptidiques dans les codes à une lettre.
Peptide 1: TARKSTGGKA - Générer alanine ou l'arginine marche bibliothèques avec une commande spécifique (.replace, A) pour dépister les acides aminés importants nécessaires à la reconnaissance d'un substrat défini. Par exemple, dans l'exemple suivant la première ligne représente la séquence de type sauvage et de la seconde ligne de chaque acide aminé dans un peptide est modifié séquentiellement en alanine.
remplacer, A
TARKSTG
Un -ARKSTG
T A -RKSTG
TA-A -KSTG
TARGET Un -STG
TARK- Un -TG
TARKS- A -G
Un TARKST- - Utilisez des commandes similaires (.replace R,.remplacer N etc.), comme décrit au point 1.1.2 avec tous les résidus d'acides aminés naturellement disponibles (éventuellement en omettant la cystéine, la méthionine et le tryptophane, parce que ces résidus sont sensibles à l'oxydation et le rendement de synthèse parfois inférieur) pour synthétiser une matrice de peptide pour la détermination du consensus substrat motif de séquence pour une enzyme.
Remarque: Comme le montre la figure 4A, l'axe horizontal représente la séquence peptidique donnée et l'axe vertical représente les acides aminés qui sont sélectionnées pour la commande. Semblable à la séquence représentée dans 1.1.2, A sur l'axe vertical signifie qu'une séquence Ala remplace chaque position de la séquence donnée dans la première rangée de la Fig. 4A. De la même façon séquentielle arginine remplace chaque acide aminé dans la seconde rangée et ainsi de suite avec les autres acides aminés. Complete bibliothèques de réseau peptidique sont synthétisés par substitution systématiquement chaque résidu dans la séquence de substrat peptidique munie de chaque ee autres résidus d'acides aminés naturellement disponibles, cette aide à comprendre l'influence de chaque résidu au niveau de chaque position de la séquence donnée. - Alternativement, la méthylation des substrats connus ou prédits peptidiques peut être facilement vérifié synthétiser des banques de peptides avec les peptides cibles du PKMT ainsi que les contrôles de méthylation positif et négatif (c.-à-peptides connus pour méthylé ou connus pour ne pas être méthylé). Synthétiser des peptides en échangeant la lysine cible putative en alanine pour confirmer la méthylation de la lysine cible comme indiqué ci-dessous par la programmation manuelle.
Peptide de type sauvage: StGG K PRQFL
Peptide mutant: StGG Un PRQFL
REMARQUE: Le logiciel a aussi son inhérents à créer différentes bibliothèques, comme la cartographie d'épitopes avec un décalage de la séquence d'image souhaitée pour cartographier acides aminés importants nécessaires à une interaction.
- Concevoir des séquences peptidiques pour la synthèse en utilisant le logiciel MultiPep spotter. Entrez les séquences peptidiques dans les codes à une lettre.
- Préparation de membrane, acides aminés d'uneRéactifs d
- Pré-gonfler la membrane SPOT dans le DMF (N, N-diméthylformamide) pendant 10 min, puis placez la membrane humide sur le cadre de SPOT synthétiseur sans bulles d'air ou de plis.
- Laver la membrane trois fois avec de l'éthanol à 100%. Sécher les membranes complètement pendant au moins 10 min avant de commencer le programme de synthèse.
- En parallèle, 0,5 M fraîchement préparer des concentrations de travail disponibles dans le commerce les acides aminés protégés par Fmoc en les dissolvant dans de la NMP et préparer également l'activateur et une base comme décrit dans le Tableau 1.
- Assurez-vous que tous les récipients de solution des déchets du synthétiseur de SPOT ont été vidés et remplir les réservoirs de solvant avec le DMF, l'éthanol et pipéridine.
NOTE: Maintenant la machine est prête pour la synthèse.
- Spotting du premier acide aminé
- Pour générer la liaison amide avec le groupe amino libre sur la membrane, activer le groupe carboxy de l'acide aminé entrant par annonceding l'activateur (N, N '-Diisopropylcarbodiimide) et une solution de base (cyanoacétate d'éthyle hydroxyimino) en le dérivé d'acide aminé.
- Découvrir les volumes désirés des acides aminés activés à la membrane fonctionnalisée amino-PEG en utilisant le robot programmable.
REMARQUE: Ainsi, l'extrémité C-terminale de l'acide aminé est couplé au groupe amino de la membrane. - Répéter cette étape trois fois pour assurer un meilleur couplage du premier acide aminé activé. Incuber la membrane pendant 20 minutes, puis laver avec du DMF pour éliminer les acides aminés non couplés.
- Blocage des espaces libres sur les zones non-comptant
REMARQUE: Après le couplage du premier acide aminé C-terminal de tous les peptides du groupe amino de la membrane, les groupes amino entre les taches ainsi que certains des groupes amino dans les zones ponctuelles ne forment pas de liaisons avec des acides aminés.- Bloquer ces groupes amino libres par mise en incubation avec la solution de coiffage (20% de l'anhydride acétique dans du DMF)pendant 5 min.
REMARQUE: On évite ainsi le couplage des acides aminés dans les autres cycles avec la membrane au lieu de la chaîne peptidique en croissance.
- Bloquer ces groupes amino libres par mise en incubation avec la solution de coiffage (20% de l'anhydride acétique dans du DMF)pendant 5 min.
- L'élimination du groupe Fmoc
- Après le blocage, laver la membrane avec du DMF, puis 4 fois incuber avec 20% de pipéridine dans du DMF pendant 20 min pour éliminer le groupe de protection Fmoc.
Remarque: Cette étape conduit à l'élimination des groupes amino-protecteurs Fmoc et on l'appelle déprotection. - Ensuite, laver la membrane deux fois avec DMF et deux fois à l'éthanol et laisser sécher.
REMARQUE: Maintenant, la membrane est prête pour le couplage des acides aminés suivants.
- Après le blocage, laver la membrane avec du DMF, puis 4 fois incuber avec 20% de pipéridine dans du DMF pendant 20 min pour éliminer le groupe de protection Fmoc.
- Allongement de la chaîne
NOTE: L'addition de chaque acide aminé est appelé un cycle. Outre l'accouplement des premier acide aminé, le cycle commence par la déprotection du groupe Fmoc de l'acide aminé couplé et il est suivi par le couplage du groupe carboxyle activé d'un acide aminé entrant au groupe amino du pep croissantla chaîne de la marée.- Répéter les étapes 1.3 et 1.5 jusqu'à ce que la longueur du peptide désiré.
- Tachant
NOTE: Après le cycle final, les tableaux peptidiques sont colorées avec du bleu de bromophénol pour confirmer la synthèse réussie de peptides. Bleu de bromophénol se lie avec les groupes amino libres des peptides. Taches peptidiques montrent la couleur bleu clair après la coloration, mais l'intensité des taches varie en fonction de la séquence peptidique. Cette coloration permet de confirmer la suppression complète de la pipéridine, car en présence de bleu de bromophénol pipéridine ne tache pas les peptides. En outre, cette aide aussi à marquer les tableaux peptidiques pour un usage ultérieur.- Après la déprotection du groupe Fmoc dans le dernier cycle de synthèse, laver la membrane avec du DMF et 100% d'éthanol. Ensuite, traiter la membrane avec du bleu de bromophénol (0,02% de bleu de bromophénol dans du DMF) pour un minimum de 5 min jusqu'à ce qu'il devienne complètement bleu.
- Ensuite, laver la membrane avec du DMF et ethanol suivie d'un séchage pendant 10 minutes. Maintenant, prenez la membrane du synthétiseur et effectuer la déprotection de la chaîne latérale (section 1.8) manuellement. Si nécessaire, la membrane photographier pour documenter les résultats de la synthèse de peptide (Fig. 2).
- La déprotection de la chaîne latérale
- Traiter les membranes avec 20 à 25 ml de mélange de déprotection de la chaîne latérale constituée de 95% d'acide trifluoroacétique (TFA) à cliver les groupes de protection de chaîne latérale et des réactifs fixateurs (2,5% d'eau et 2,5% de triisopropylsilane) pour protéger les chaînes latérales d'acides aminés à partir de modification lors de cette étape. Prélever un volume suffisant de mélange de déprotection pour se assurer qu'il couvre complètement la membrane dans un boîtier hermétiquement fermé résistant aux produits chimiques et incuber pendant 1 à 2 h tout en agitant doucement.
- Laver la membrane six fois avec 20 à 25 ml de DCM (dichlorométhane) pendant 2 minutes chaque fois et enfin avec 100% d'éthanol et sécher dans un dessiccateur pendant une nuit.
NOTE: Maintenantla membrane peut être utilisée pour les expériences. Un schéma de la synthèse de la matrice de peptide est présenté à la figure 1.
2. Protein Expression et purification
- Expression de la protéine de PKMTs que TPS Fusions
- En utilisant des techniques standards, de cloner le gène codant pour la pleine longueur PKMT ou son domaine catalytique dans un vecteur d'expression bactérien (tel que pGEX-6P2) de l'exprimer sous forme de protéine de fusion GST.
- Transférer le vecteur avec la PKMT souhaité insérer dans BL21 ou BL21 codon ainsi E. cellules coli par la méthode de choc thermique ou toute autre méthode.
- Préparer une pré-culture avec 30 ml de milieu Luria-Bertani (LB) à la date d'expression et incuber à 37 ° C pendant 7-8 heures avec agitation continue.
- Ensuite, transférer 10 ml de la pré-culture dans un 2 L grands flacons à déflecteurs contenant 1 litre de milieu LB et incuber à 37 ° C dans un incubateur avec agitation continue jusqu'à ce que la portée de la culturees une densité optique défini à 600 nm.
REMARQUE: Même si cela peut être optimisé pour chaque protéine, nous incitons régulièrement à une DO 600nm d'environ 0,8. La température d'induction doit être optimisé pour chaque protéine individuellement, certaines protéines montrer bonne expression à 22 ° C, et certains à des températures plus élevées. - Décaler les cellules à la température d'induction pendant 15 min, puis à induire 1 mM d'isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside et laisser la culture croître pendant 10-12 heures à la température d'induction.
- Après la récolte des cellules par centrifugation à 5000 xg pendant 15 min, et enfin laver le culot avec 30 ml de tampon STE (10 mM Tris pH 8,0, NaCl 100 mM et EDTA 0,1 mM) et conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
- Protein Purification
- Décongeler le culot cellulaire et remettre en suspension dans 30 ml de tampon de sonication (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM et 5% de glycerol) et perturber par sonication.
NOTE: Ce tampon needs à être optimisés pour chaque protéine par la suite. - Centrifuger le lysat cellulaire à 22 000 x g pendant 1 heure et, ensuite recueillir le surnageant et passer à travers une colonne contenant 600 ul de résine glutathion-Sepharose 4B.
- Laver la colonne avec 50 ml de tampon de sonication et ensuite avec 100 ml de tampon à haute teneur en sel (Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, DTT 1 mM et 5% de glycerol) pour éliminer les protéines non spécifiquement liées. Eluer la protéine liée avec 5 ml de tampon salin élevé contenant 40 mM de glutathion.
- Dialyser la protéine éluée dans 2 L de tampon de dialyse à bas glycérol (20 mM Tris pH 7,4, 100 mM de KCl, 0,5 mM de DTT et 10% de glycerol) pendant 2 heures et ensuite dans du Tris 20 mM pH 7,4, 100 mM de KCl, 0,5 mM TNT et 70% de glycérol pendant 8 heures ou toute la nuit. Se assurer que toutes les mémoires tampon de purification sont à 4 ° C et d'effectuer la purification de la protéine dans la chambre froide pour éviter la dénaturation des protéines.
- Décongeler le culot cellulaire et remettre en suspension dans 30 ml de tampon de sonication (50 mM Tris pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM et 5% de glycerol) et perturber par sonication.
3. Peptide tableau méthylation
- Pré-incuprobation du peptide Arrays
- Effectuer peptide tableau méthylation soit dans une boîte de taille appropriée ou dans un sac en plastique pour éviter le gaspillage d'enzyme et coûteux AdoMet marqué radioactivement. Pré-incuber la membrane de peptide de réseau dans un sac en plastique scellé contenant le tampon de méthylation respectif sans enzyme et marqué [méthyl-3H] -AdoMet pendant 10 min. Le volume de tampon dépend de la taille de la matrice, par exemple utiliser 8 ml de tampon de méthylation pour une spécificité toute la gamme profil peptidique. Optimiser la quantité et la concentration de l'AdoMet pour chaque enzyme.
- La méthylation d'un peptide Arrays
- Jeter le tampon de pré-incubation et incuber la membrane dans 8 ml de tampon de méthylation contenant le PKMT respectif et marqué [méthyl-3H] -AdoMet pour 1-2 heures.
REMARQUE: La quantité d'enzyme nécessaire à une réaction de méthylation dépend de l'activité spécifique de PKMT, nous initions nos expériences de criblage typiquement avec 50 nM d'enzyme ailetteconcentration al.
- Jeter le tampon de pré-incubation et incuber la membrane dans 8 ml de tampon de méthylation contenant le PKMT respectif et marqué [méthyl-3H] -AdoMet pour 1-2 heures.
- Lavage de Peptide Arrays
- Ensuite, jeter le tampon de méthylation dans un conteneur de déchets radioactifs et laver les matrices de peptides pour 5 fois avec 20 ml de tampon contenant 100 mM de bicarbonate d'ammonium et 1% de SDS pendant 5 min pour éliminer la protéine liée. Jeter le tampon de lavage dans un conteneur de déchets radioactifs.
- La détection du signal radioactif
- Après les lavages incuber la membrane pendant 5 minutes dans 10 ml de solution Amplify (NAMP100V).
- Ensuite, jeter la solution Amplify dans le conteneur de déchets radioactifs aux solvants organiques, sceller la matrice de peptide dans un sac en plastique et le mettre dans une cassette d'autoradiographie.
- Placer le film d'autoradiographie sur le réseau peptidique dans la chambre noire. Fermez la cassette attentivement et de l'exposer à -80 ° C pendant le temps nécessaire. Ensuite, développer le film pour analyser les résultats. Capturez le couple d'image de fois avec expositio différenten fois pour éviter la saturation des substrats peptidiques fortement méthylés.
4. Traitement et analyse des données
- Densitométrique Analyse des intensités spot
- Scannez le film dans un scanner conventionnel et analyser les intensités au comptant par densitométrie. Pour ce faire, en utilisant ImageJ (qui est un freeware) ou un programme commercial.
NOTE: Nous utilisons un logiciel Phoretix pour cette tâche.
- Scannez le film dans un scanner conventionnel et analyser les intensités au comptant par densitométrie. Pour ce faire, en utilisant ImageJ (qui est un freeware) ou un programme commercial.
- Normalisation et Moyenne des résultats de différentes membranes
- Effectuer les expériences méthylation de tableau de peptide au moins en trois exemplaires. Normaliser les intensités numérisées pour chaque expérience par soustraction de fond et la mise l'activité à un substrat de référence 1.0. La moyenne des données pour les taches individuelles et de les signaler comme des valeurs moyennes et les écarts types.
- Analyse des données et Affichage
- Tracer les données en 2D utilisant un système de niveaux de gris ou de couleur pour indiquer l'activité relative. Pour ce faire, wie Excel ou Sigmaplot comme indiqué ici. De même, préparer un graphique de la distribution des écarts-types des expériences répétées pour analyser la qualité des données.
- Pour comparer afficher et la précision de la reconnaissance de chaque résidu dans le peptide de substrat quantitativement, calculer la préférence relative de la PKMT pour chaque acide aminé à la position x i par un facteur D 16,17 discrimination:
D X; i = <V j ≠ i> / V i - 1
Où V i est le taux de méthylation de la variante de peptide portant l'acide aminé i à la position x et <v j ≠ i> est le taux moyen de méthylation de tous les 19 peptides portant un j d'acides aminés différente ≠ i à la position x (y compris la séquence de type sauvage).
NOTE: Le facteur de discrimination en ce sens dépend du niveau de fond. Si un seul résidu est accepté à une certaine position avec un fond de 3%, une discriminationfacteur de 32,3 soit obtenu. Aucune préférence à une position se traduit par un facteur de discrimination de 0.
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Representative Results
tableaux de peptides ont été utilisés avec succès pour caractériser biochimiquement la spécificité de PKMTs, et plusieurs roman histones et non-histones substrats de PKMT ont été identifiées par cette approche 5,16-19. Définir le spectre de substrat correcte d'un PKMT (ou ne importe quelle enzyme) est une étape essentielle vers la compréhension de son mécanisme moléculaire et les fonctions cellulaires.
A titre d'exemple de l'application de la méthode de méthylation tableau peptide SPOT, nous décrivons les résultats de l'analyse de la spécificité de la NSD1 PKMT 19. Avant notre travail, cette enzyme a été décrit méthylate plusieurs substrats, y compris l'histone H3 au K36 et K20 à l'histone H4, mais aussi le NF-kB transcription de la famille facteur p65 au K218 et K221. Fig. La figure 4A montre un exemple de réaction de méthylation d'un réseau de peptides avec NSD1. Pour ces expériences, un large éventail de peptide basé sur le H3 (31-49) séquence a été synthétisé qui contient possiblemodifications d'acides aminés individuels de la séquence d'origine pour tester l'importance de chaque acide aminé pour NSD1 interaction et la méthylation. Au total, 380 peptides ont été synthétisés (20 acides aminés possibles x 18 résidus plus une séquence de H3 origine dans chaque ligne). L'axe horizontal représente la séquence du peptide et dans la direction verticale de l'acide aminé qui est modifié dans le peptide correspondant est indiqué. Par exemple, le point à la ligne 17 colonne 4 contient une thréonine en troisième position à la place de la glycine qui est présent dans la séquence de type sauvage (Fig. 4A). De cette manière, des mutations ponctuelles sont générées pour tester la préférence de NSD1 pour chaque acide aminé natif à chaque position dans le substrat peptidique. La méthylation avec NSD1 a montré qu'il agit spécifiquement sur H3K36 et il a des préférences de chaque côté de la lysine cible 34-38.
La figure 4B représente la consolidation des trois peptide tableau méthylationexpériences avec NSD1. L'information quantitative a été acquis des tableaux peptidiques individuels et les résultats ont été normalisés et moyenne comme décrit ci-dessus. Les écarts-types des moyennes individuelles montrent que les données sont hautement reproductibles. Dans l'ensemble environ 85% des peptides plus petits écarts montre que 20% et plus de 97% des substrats peptidiques ont démontré DS inférieure à 30% (Fig. 4C). En outre, nous avons également calculé le facteur de discrimination pour déterminer avec précision la contribution de chacun des acides aminés au niveau des positions testées. Comme décrit fournit la description quantitative du peptide lue et de préférence les acides aminés à la position spécifique (Fig. 5A). Nos données montrent que NSD1 préfère résidus aromatiques dans la position -2 (K36 considérant comme position 0) (F> Y> G); résidus hydrophobes à -1 (I> L> V); résidus de base à une (R> QKNM), où il ne peut pas tolérer résidus hydrophobes ou aromatiques; et hydrésidus rophobic à 2 (V> IA> P). Sur d'autres sites (par exemple -3, 3, ou 6), NSD1 préfère certains acides aminés, mais pas spécifique de lecture résidu solide a été détectée.
Sur la base de ce profil, potentiels nouveaux substrats peptidiques peuvent être trouvés par les recherches de base de données comme l'utilisation Scansite 20 (Fig. 5B). Ces peptides ont été préparés sur un réseau de SPOT y compris les contrôles positifs et négatifs et incubées avec NSD1 et radioactivement marqués AdoMet pour identifier le sous-ensemble de ceux qui sont méthylés au niveau de peptide (Fig. 5C). Comme les suivis, les tableaux de peptides peuvent être préparés qui comprennent variantes peptidiques, dans laquelle la lysine cible est remplacé par l'alanine, pour confirmer que la méthylation a lieu sur le site prévu. Ensuite, les protéines ou les sous-domaines de la lysine contenant cible cibles peuvent être produits par recombinaison et la méthylation ont également testé au niveau de la protéine. Enfin, en fonction des résultats, le suivi des expériences que je peux nvestigate si la méthylation se produit également dans les cellules et qui rôle biologique dont il dispose.
Figure 1:. Schéma de synthèse peptidique par la méthode de SPOT sur la membrane de cellulose Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Exemple d'un réseau de peptides colorées avec du bleu de bromophénol pour confirmer la synthèse de peptides Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3: Schéma de l'expérience peptide tableau de méthylation; matrices de peptides ont été méthylés par incubation avec PKMT et étiquetés [méthyl-3H] -AdoMet dans un tampon approprié. Ensuite la radioactivité transférée à chaque spot est détectée par autoradiographie. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Exemples de résultats obtenus avec la NSD1 PKMT A) de l'exemple d'un réseau de peptide de spécificité de substrat pour NSD1 utilisant le H3 (31-49) séquence comme matrice.. L'axe horizontal représente la séquence de H3 et l'axe vertical représente les acides aminés qui par la ligne correspondante est muté. La première ligne contient des peptides avecséquence originale. B) de consolidation des résultats de trois expériences réseau de peptides de méthylation indépendants avec NSD1, les données ont été en moyenne des résultats des trois expériences après normalisation. C) Répartition des erreurs standard pour les données de méthylation moyens figurant dans la partie B. Reproduit de Kudithipudi et al., (2014), avec quelques modifications 19. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5:. La découverte de nouveaux substrats de PKMT A) les facteurs de discrimination des NSD1 pour la reconnaissance des résidus d'acides aminés au niveau des positions à côté de la lysine cible (K36 dans l'expérience présentée ici). Les données montrent que NSD1 préfère résidus aromatiques à l'-2 position (considérant K36 que la position 0). Résidus hydrophobes sont comptabilisés à la -1 et 2 positions, avec toutefois des différences dans les détails distinctifs. Sur le site 1 et les amides des résidus basiques sont préférés. Sur d'autres sites des préférences faibles, mais pas de lecture spécifique des résidus forte a été détectée. B) Screenshot d'un exemple de recherche au Scansite, en utilisant le profil de spécificité déterminée pour NSD1. C) tableau Peptide SPOT contenant plusieurs roman prédit NSD1 substrats avec positif (H3K36 ) et les contrôles négatifs (H3K36A). Certaines des nouvelles cibles prédites ont été fortement méthylé (certains d'entre eux annotées), dans d'autres cas, ces prévisions ne ont pas pu être vérifiées. Groupe A et C est reproduite à partir Kudithipudi et al. (2014) avec quelques modifications 19. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Base | 1 M Oxyma pur dans la NMP -> 2,13 g Oxyma pure dans 15 ml de NMP |
| Activator | 2,4 ml de N, N '-Diisopropylcarbodiimide dans 15 ml de NMP |
| Mélange Plafonnement | Anhydride acétique à 20% dans du DMF -> 6 ml d'anhydride acétique dans 30 ml de DMF |
| Fmoc déprotection | 20% de pipéridine dans du DMF -> 200 ml à 1000 ml de DMF |
| Sidechain déprotection | 900 ul triisopropylsilane + 600 ul ddH 2 O dans 30 ml de TFA |
| Tachant | 0,02% de bleu de bromophénol dans du DMF |
Tableau 1: mélanges chimiques et leur composition utilisée dans le protocole.
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Discussion
SPOT synthesis tel que décrit ici est une méthode puissante pour cartographier les sites d'interaction protéine-protéine et d'enquêter sur la reconnaissance de substrat de peptide enzymes de modification. Cependant, la synthèse SPOT a encore certains inconvénients, car bien que les peptides synthétisés par la méthode de SPOT sont signalés à avoir plus de 90% de pureté 21 ce est difficile de confirmer dans chaque cas. Par conséquent, les résultats doivent être reproduits par d'autres méthodes, par exemple en utilisant des domaines protéiques ou avec des peptides purifiés par des procédés classiques de synthèse. En outre, l'autre inconvénient majeur des réseaux SPOT est que la plupart du temps, ils ne peuvent pas être réutilisés pour réaliser plusieurs essais avec une matrice.
Pour augmenter l'efficacité de la synthèse des acides aminés de faible stabilité, comme l'arginine protégée, il est important de les rendre douce pour chaque 5 cycles. Dans les réactions enzymatiques ou des études de liaison de protéine, il est souvent observé que la périphérie de la tache peptidique a more intensité du signal que le centre ("effet de tache annulaire"). Cet effet peut être dû à la forte densité de peptides dans la partie centrale de la place, puis il peut être résolue par downscaling la synthèse peptidique 22. Pour de plus amples tir peine de synthèse peptidique manuel de la machine et le service de l'entreprise doit être consulté. Si la méthylation ne est pas respecté, les peptides de contrôle positif (par exemple des peptides connus pour être méthylé par l'enzyme à l'étude) doivent être ajoutés à la membrane.
Suppléant de tableaux de SPOT, peptidiques haute densité des microréseaux 23 sont disponibles, mais ils sont plus coûteux et nécessite un équipement spécial pour l'utilisation. En outre, la quantité de peptide par spot est plus petit, ce qui nécessite des procédures de lecture plus sensibles. puces à protéines sont également disponibles pour étudier ces fonctions 24,25, mais ils sont plus difficiles à préparer, car chaque individu protéine doit être exprimée et purifiée etle repliement des protéines de la matrice doit être maintenue. Un avantage supplémentaire des matrices de peptides est la possibilité d'introduire des modifications post-traductionnelles au cours de la synthèse et de la facilité de l'essai de mutation des rôles des résidus d'acides aminés individuels.
Ce est un point de départ essentiel pour ce protocole, d'avoir au moins un peptide identifié, qui est méthylé par l'enzyme sous enquête. conditions de méthylation et les tampons doivent être optimisés, ainsi que la concentration de la méthyltransférase. Cours à temps exemplaires de méthylation doivent être déterminés pour éviter méthylation complète du meilleur substrat, ce qui entraînera la perte de la plage dynamique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
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