Permanent Ligering av vänster främre Fallande Kranskärls hos möss: En modell av efter hjärtinfarkt Remodelling och hjärtsvikt

Abstract

Hjärtsvikt är ett syndrom i vilket hjärtat misslyckas att pumpa blod vid en hastighet som motsvarar cellulära syrebehov vid vila eller under stress. Den kännetecknas av vätskeretention, andfåddhet och trötthet, särskilt vid ansträngning. Hjärtsvikt är ett växande folkhälsoproblem, den vanligaste orsaken till sjukhusvård, och en viktig orsak till dödlighet. Ischemisk hjärtsjukdom är den främsta orsaken till hjärtsvikt.

Ventrikulär remodellering avser förändringar i struktur, storlek och form på vänster kammare. Denna arkitektoniska remodellering av den vänstra ventrikeln induceras av skada (t.ex. hjärtinfarkt), genom trycköverbelastning (t.ex. systemisk arteriell hypertension eller aortastenos), eller genom volymöverbelastning. Eftersom kammar ombyggnad påverkar vägg stress, den har en stor inverkan på hjärtfunktion och på utveckling av hjärtsvikt. En modell av permanent ligering av vänster främre descending kranskärl i möss används för att undersöka ventrikulär remodellering och hjärtfunktion efter hjärtinfarkt. Denna modell är fundamentalt olika i fråga om mål och patofysiologisk betydelse jämfört med den modell för transient ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären. I detta senare modell av ischemi / reperfusionsskada, kan den initiala utsträckningen av infarkt moduleras av faktorer som påverkar myokardial bärgning efter reperfusion. I motsats härtill är det infarktområdet vid 24 h efter den slutliga ligeringen av den vänstra främre nedåtgående kransartären fixerad. Hjärtfunktionen i den här modellen kommer att påverkas av 1) processen för infarkt expansion, infarkt healing, och ärrbildning; och 2) samtidig utveckling av vänsterkammar dilatation, hjärthypertrofi, och ventrikulär remodellering.

Förutom modellen för permanent ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären, tekniken med invasiv hemodynamisk meaarna i möss presenteras i detalj.

Protocol

OBS: Alla experimentella procedurer som beskrivs i detta avsnitt har godkänts av Institutional Animal Care och Forskningsberedningen av Katholieke Universiteit Leuven (Projekt: 154/2013-B De Geest).

1. Permanent Ligering av vänster främre Fallande Kranskärls

1. Bedöva musen genom intraperitoneal administrering av 40 mg / kg till 70 mg / kg natriumpentobarbital. Se till att musen når sin rätta plan av anestesi när det inte längre reagerar en fast tå nypa. Bekräfta alltid korrekt anesthetization detta sätt före alla kirurgiska ingrepp eller intervention. Använd smörj oftalmisk salva för att förhindra torrhet av hornhinnan under anestesi. Ge preoperativ smärtlindring 2-4 tim innan förfarandet (buprenorfin 0,05 mg / kg SQ).
   1. Applicera konsekventa aseptisk teknik under överlevnadskirurgi. Implementera förfaranden som inhiberar till en maximalt möjlig utsträckning mikrobiell conaminering, så att betydande infektion eller varbildning inte inträffar. Dessa procedurer inkluderar användning av sterila instrument och sterila material, desinfektion av operationsområdet, och avlägsnande av päls / hår ovanför operationssåret och desinfektion av denna webbplats.
2. Intuberas musen med en själv förberedda trubbiga 20-nål.
   1. Placera musen i ryggläge med hyperextension av huvudet.
      1. Fokusera ljuset på halsregionen. Lyft tungan med en trubbig pincet. Ingången i struphuvudet kan tydligt ses.
      2. Passera trubbiga nålen genom struphuvudet i luftstrupen under direkt vision. Bedöm korrekta intubering genom att ansluta musen till ventilatorn (slagvolymen i pl: 3 x kroppsvikt (g) + 155; frekvens: 120 slag per minut).
   2. Alternativt, förbättra visualisering av endotrakeal intubation genom att först försiktigt exponera luftstrupen.
      1. Gör en 5 mm mid-hals snitt och dra tillbakamuskelvävnad precis ovanför luftstrupen.
      2. Utför intubation med användning av en kirurgisk stereomikroskop för direkt visualisering av luftstrupen. Lyft tungan och ange själv förberedda trubbiga 20 gauge nål i luftstrupen. Bekräfta korrekt intubation genom att ansluta musen till ventilatorn (slagvolymen i pl: 3 x kroppsvikt (g) + 155; frekvens: 120 slag per minut).
3. Håll musen i ryggläge och fixera musen med tejp. Operera på en värmedyna för att förhindra hypotermi.
   1. Raka och desinficera huden med Betadine. Var försiktig så att det vänstra bakbenet korsar den högra bakbenet för att erhålla en bättre överblick över den vänstra ventrikeln under operation.
4. Gör en liten tvärgående kutan snitt upp till bröstbenet och separera den underliggande hud och muskler.
5. Dra undan m. pectoralis mindre och m. pectoralis major med en 5-0 silkessutur.
6. Gör en incision i tredje interkostalrummet genom att sätta in en trubbig pincet.
7. Flytta pincet under interkostalmuskulaturen från lateral till medial tills bröstbenet nås. Punktering bröstväggen genom att skjuta pincet från insidan till huden. Fyll i torakotomi genom att försiktigt skära interkostala muskeln strax ovanför pincet med en liten sax. Använd den här tekniken för att förhindra punktering av lungorna.
8. Sätt en svamp nedsänkt i 0,9% NaCl i kaviteten för att skydda lungorna. Införa ett sår spridare (bröst sårhake) i interkostalrummet att erhålla exponering av den vänstra sidan av hjärtat. Från och med nu, vänster förmak, vänster kammare, och den vänstra främre nedåtgående kransartären är synliga under stereomikroskop.
9. Utför en ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären med en enda 6-0 prolen ligatur omkring en mm under spetsen på det vänstra förmaket. Detta är distal från den första diagonala grenen.
   OBS: Alternativt 7-0 (00,05 mm diameter) eller 8-0 trådar (0,04 mm diameter) kan användas. Nålen är en C-1 13 mm 8/3 cirkel konpunkten nål. Framgångsrik ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären inducerar omedelbar missfärgning, vilket resulterar i en svagt uppträder myokardiet i det drabbade området.
10. Ta såret spridare (bröst upprullningsdon).
    1. Placera tre 6-0 Ti-Cron suturer runt interkostalrummet. Innan du drar suturerna, ta bort svampen från brösthålan och åter expandera lungorna genom att blockera utflödet av ventilatorn. Genom att göra så, lungorna återansluta med parietalceller lungsäcken.
    2. Därefter drar suturerna tight och upprepa återexpansion genom att trycka ner på bröstet. Bekräfta den framgångsrika stängningen av bröstkorgen med hjälp av en liten mängd av koksaltlösning (inga luftbubblor måste ses när applicering av tryck på bröstet).
    3. Titta igenom interkostala muskeln att bekräfta normal expansion av lungorna. Flytta båda pectoralis muskler, som fungerar som enextra barriär för att förhindra en pneumothorax.
11. Stäng huden med 5-0 silkes-suturer.
12. Koppla bort musen från ventilatorn och låta återhämtningen på värmedyna. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetandet för att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka ett djur som har genomgått en operation för att bolaget av andra djur tills återhämtat sig helt.
13. Konsekvent ge postoperativ analgesi (buprenorfin 0,05 mg / kg SQ BID i minst 48 timmar efter operation).

2. In vivo Invasive Hemodynamiska Mätningar i möss

1. Före proceduren, dränka den 1,0 franska Millar tryckkateter i sterilt vatten vid 37 ° C under minst 30 min för att minimera signaldrift. Elektroniskt kalibrera tryckgivaren vid 0 mm Hg och 100 mm Hg och registrera data vid 2000 Hz.
2. Utför anestesi genom intraperitoneal administrering av 1,4 g / kg uretan. Kontrollera attmusen når sin rätta plan av anestesi när det inte längre reagerar en fast tå nypa.
3. Placera sövda musen i liggande ställning. Säkra sina lemmar med tejp. Upprätthålla kroppstemperaturen med en värmedyna och övervaka med en rektal sond. Raka halsområdet och göra en mittlinje snitt i nackregionen för att exponera sköldkörteln.
4. Fäst halsen med böjda nålar.
5. Dra undan spottkörteln och exponera den högra gemensamma halspulsådern. Vagusnerven, som liknar en vit tråd, ligger längs artären. Försiktigt separera halspulsådern från vagusnerven med hjälp av en böjd pincett.
6. Passera en böjd pincett under rätt gemensamma halspulsådern för att skilja den från andra vävnader. Ta bort bindväv runt artären.
7. Pass två 6-0 siden trådar under rätt gemensamma halspulsådern. Gör en stram knut på toppen tråd, som placeras mot huvudet, nära, och fixa med en Kocher (distal ocklusiv tion). Passera ställföreträdande kostnadmal tråd två gånger från vänster till höger och fixera med 2 kochers (proximal icke-ocklusiv tråd).
8. Håll karotisartären fuktig genom att släppa steril 0,9% NaCl. Torka bort överflödig vätska med bomullspinnar.
9. Gör ett snitt i den högra gemensamma halsartären med en 26-gauge nål mellan den distala ligering och den proximala icke tillslutande tråd.
10. Introducera sensortrycket i artären. Kontrollera att det inte finns någon blodförlust. Tryck försiktigt 1,0 Franska Millar tryckkateter framåt och justera proximala icke-ocklusiv tråd på ett sådant sätt att katetern kan passera försiktigt genom viran under nyckelbenet.
    1. Minimera blodförlust under justering av den proximala icke tillslutande tråd. Komprimera inte tryckgivaren för mycket samtidigt framåt eftersom det är mycket bräcklig. Eftersom den proximala tråden inte får täppa till artären, bör fartyget förblir fylld med blod.
11. Starta inspelningen trycksignalen. En arteriell trycksignal Fluctuates i en frisk mus mellan ett diastoliskt tryck av 60-70 mm Hg och ett systoliskt tryck av 100-120 mm Hg.
12. Rikta katetern via Innominate artären och via aortan in i den vänstra ventrikeln. Den ventrikulära trycket varierar mellan 0 mm Hg och 100-120 mm Hg. Låt katetern stabiliseras inuti den vänstra ventrikeln. Anteckna den signal för 30 min till 60 min beroende på de experimentella kraven.
13. Efter slutförandet av experimentet, blöt katetern i Alconox 1% i 30 min. Tvätta katetern med Milli-Q-vatten. Förvara katetern i ett skumblock.
14. Hämta data från inspelningsprogrammet för vidare analys.
    1. För dataanalys, överväga ett tidsintervall där trycksignalen är stabil. Välj minst 10 på varandra följande hjärtcykler av registrerade data av intresse.
    2. Använd LabChart programversion 8.0 eller liknande analysera hjärtfrekvens, maximal systolisk vänsterkammartryck, den minimala diastolisk vänster ventricular tryck, den topphastighet av isovolymetrisk vänster ventrikulär sammandragning (dP / dt _max), topphastighet av isovolymetrisk vänster ventrikulär relaxation (dP / dt _min), den slutdiastoliska vänstra ventrikulära trycket, och tidskonstanten av isovolymetrisk vänsterkammar tryckfall (tau) ^7.
       OBS: Den slutdiastoliska tryck motsvarar trycket vid tiden-punkt omedelbart före tryckstöt som induceras av isovolymetrisk kontraktion. Beräkningen av tau är baserad på montering av vänstra ventrikulära trycket till en monoexponentiell avklingningskurvan, uttryckt som P _(t) = P ₀ e ^{-t / tau} + b, I denna formel, P _(t) är det vänstra ventrikulära trycket vid tidpunkten T efter det maximala negativa värdet av dP / dt har uppnåtts. Parametern b motsvarar det teoretiska asymptot, vilket i ett förenklat tillvägagångssätt kan antas vara noll. Förbättrad isovolymetrisk avkoppling resulterar i ett mindre värde av tau.

Representative Results

Kan bedömas Omfattningen av hjärtinfarkt med Evans blå / 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) dubbel färgning. TTC är en redoxindikator, som omvandlas till djupröd 1,3,5-triphenylformazan i levande vävnader på grund av aktiviteten hos olika dehydrogenaser i närvaro av NADH ^8. Figur 1 visar ett representativt avsnitt av hjärtat vid 24 h efter ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartär. Blåfärgade områdena indikerar icke-ischemiska / normala regioner. Den myokardial riskområde definieras som hjärtmuskelvävnaden inom perfusionen bädden distalt från ligeringen av den vänstra främre nedåtgående kransartär. Djupröd-färgade områdena visar ischemiska men livskraftiga regioner (icke-infarktområdet riskerar) regioner, medan negativt färgade områden (blek röd) indikerar infarcerade regioner. I denna modell är försumbar och inte syns i denna bild, vilket speglar den permanenta karaktär th den icke-infarktområdet riskerare ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartär. Den infarktområdet är typiskt mellan 50-60% av den totala vänstra ventrikulära väggen området ^9,10. Två komponenter i utvecklingen av infarktzonen bör urskiljas: 1) den tredimensionella geometrin för infarkt kan förändra som en konsekvens av infarkt expansionen leder till en tunnare men mer utsträckt hjärtinfarkt, och 2) den totala volymen av infarkt kan minska, vilket speglar läkningsprocessen med sårkontraktion och ärrbildning.

Infarkt expansionen kan kvantifieras genom att utvärdera tidsförloppet för infarkt längd och infarkt tjocklek ^10. En representativ Sirius Red färgade tvärsnitt av ett hjärta vid dag 28 efter den slutliga ligeringen av den vänstra främre nedåtgående kransartären visas i figur 2. Bilden visar en infarkt som väsentligen har sträckts. I ett tvärsnitt, motsvarar denna expansion till en ökning av den absolute infarkt längd och en minskning med infarkt tjocklek.

Förutom överväganden på tredimensionella geometrin och volymen av infarkt, bör betraktas annan varning när det gäller tolkningen av infarktparametrar. Eftersom livskraftig myokardvävnaden också kommer att genomgå hypertrofi, är det tydligt att förhållandet mellan infarktområdet kontra total vänsterkammarväggen området kommer att minska som en funktion av tiden. Bedömning av longitudinella förändringar av infarktområdet kräver därför en tydlig insikt i skillnaden mellan absoluta parametrar och relativa parametrar.

En arteriella och ventrikulära trycket registret visas i Figur 3. Efter stabilisering av katetern, hjärtfrekvens, maximal systolisk vänster ventrikulära trycket, minsta diastoliskt vänsterkammartryck, topphastighet av isovolymetrisk vänster ventrikulär sammandragning (dP / dt _max), i slutet -diastolic vänstra ventrikulära trycket, och tHan topphastighet isovolymetrisk vänsterkammar avslappning (dP / dt _min) bestäms. Tidskonstanten för isovolymetrisk vänstra ventrikulära trycket falla (tau) kvantifieras med användning av metoden enligt Weiss et al., ^7.

Figur 1. Bedömning av riskområde och infarktstorlek 1 dag efter hjärtinfarkt. Bilderna från vänster till höger gå från hjärt apex till basen av hjärtat. 24 h efter den slutliga ligeringen av den vänstra främre nedåtgående kransartären, var 2 ml Evans blått färgämne injiceras som en bolus i aorta för att kvantifiera volymen av den perfunderade myokardiet. Hjärtan därefter greps i diastole genom injektion av CdCl (100 l, 0,1 N), spolades med fysiologisk koksaltlösning för att skölja ut överflödigt blått färgämne, och var inbäddade i 5% låg gelningstemperatur agaros. Afterwards, 500 nm tjocka tvärsnitt gjordes med hjälp av en HM 650 V Vibration Mikrotomen och skivor inkuberades sedan i en 1,5% 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid innehåller isotonisk fosfatbuffert (pH 7,4) under 30 minuter vid 37 ° C. Bilder gjordes med hjälp av en stereo Lumar V.12 mikroskop. Den negativt färgade området infarktvävnad, den röda färgade icke-infarktområdet i riskzonen, och den blå-färgade icke-ischemisk friska kammarvägg området kvantifierades med Image J programvara. Skala stapel representerar 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Representativa Sirius Red färgade tvärsnitt av ett hjärta vid dag 28 efter ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären. Den images från vänster till höger gå från hjärt apex till basen av hjärtat. Den standardprotokoll för Junqueira et al. ¹¹ tillämpades för Sirius Red färgning. Denna histokemiska metod fläckar fibrotisk infarktvävnad mörkröd och frisk vävnad orange. Skala stapel representerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Arteriellt (A) och i vänster kammare (B) tryck register erhålls efter kateterisering av normala möss. Den uppenbara skillnaden mellan en arteriell signal och en kammarsignal är att den senare signalen sjunker till cirka 0 mm Hg under diastole. LVP: vänsterkammartryck.

Discussion

Kroniska förändringar i hjärtmuskel struktur och funktion, kan utvecklingen av vänsterkammardysfunktion, och progression till hjärtsvikt utredas i flera musmodeller ^12. Hjärt ombyggnad och dysfunktion kan orsakas av myokardskada eller genom påtryckningar belasta sekundärt till tvärgående aorta förträngning, eller får undersökas i genetiska modeller av dilaterad kardiomyopati ^12. Självklart är det mest uttalade fördelen med musmodeller tillgången till ett stort antal transgena och knock-out stammar inklusive celltypsspecifik och inducerbara transgena modeller. Utvärdering av hjärt ombyggnad i dessa modeller har underlättas avsevärt genom utveckling av teknik som ultrahög upplösning 2D- och 3D-ekokardiografi, mikro magnetisk resonanstomografi, hemodynamisk utvärdering med micromanometry och Micromanometer konduktans teknik för tryckvolymslinga analyser. I denna rapport har vi fokuserat på model av myokardskada inducerad av permanent ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären och utvärdering av vänsterkammarfunktion med vänsterkammar micromanometry.

Den första musmodell av hjärtinfarkt beskrevs 1978 av Zolotareva m.fl. ^13. Denna modell av permanent ocklusion bör tydligt urskiljas från murina modellen för transient ocklusion av den vänstra främre nedåtgående kransartären som först beskrevs av Michael et al ^14. Denna senare modellen används för att undersöka ischemi-reperfusionsskada och myokardiell bärgning medan permanent ligering appliceras för att studera patofysiologin av post-myokardinfarkt hjärt ombyggnad.

Den kranskärls träd möss är annorlunda jämfört med människor ^15-17. Den septal kranskärl i musen är variabel i ursprungs ^15-17. Den uppstår klassiskt som en gren av den högra krans arriet ^18,19, men kan även uppstå från en separat öppningen i rätt sinus av Valsalva ^17, eller undantagsvis från vänster kranskärl ^16. Anatomi kranskärlsträdet kan skilja sig något mellan olika stammar ^20. Men ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären såsom det framgår omedelbart under vänster hjärtörat leder reproducerbara stora infarkter involverar anterolateralt, bakre och apikala regioner i hjärtat, vilket framgår av histologi och ekokardiografi ^15,17. Viktigt är septumet förskonade från infarkt, vilket återspeglar närvaron av den distinkta septal kransartären. I motsats till möss, är blodförsörjningen av septum hos människor främst från grenar av den vänstra främre nedåtgående kransartären ^21. Denna skillnad i anatomi och den resulteskon av septum i möss kommer att påverka remodellering av hjärtat.

Såsom anges i resultatets sektion, ligering av den vänstra främre nedåtgående kransartären hos möss inducerar en stor hjärtinfarkt som innefattar 50% till 60% av den vänstra ventrikeln ^9,10. Förekomsten av ventrikulär bristning under de första två veckorna efter hjärtinfarkt i möss är frekvent ^22,23. Denna komplikation av hjärtinfarkt är stam beroende och sker betydligt oftare i hanmöss än i honmöss ^22. Dessutom händer kammar bristning oftare i hyperkolesterolemisk möss än under förhållanden med normocholesterolemia ^9. Förekomsten av kammar bristning i möss bör sättas i rätt perspektiv. Först av allt, är denna komplikation en manifestation av infarktexpansion. Denna oproportionerliga gallring och utvidgning av infarkt segmentet inte bara inducerar myokardruptur men är också en utlösande faktor för hjärt ombyggnad och hjärtsvikt ^24-27. Således är frekvensen av myokardrupturen indikator för graden av infarkt expansion och därmed för omfattningen av hjärt ombyggnad och utveckling av hjärtsvikt i överlevande möss.

Den andra viktig faktor när det gäller kammar bristning är nödvändigheten att ta överlevnad partiskhet i beaktande när funktionella eller strukturella uppgifter jämförs mellan två grupper i en interventionsstudie ^10. Det är rimligt att anta att möss med den mest uttalade infarkt expansion kommer ge efter för kammar bristning. I fallet med en signifikant skillnad av överlevnaden mellan två grupper, bör man vara medveten om att dog möss utesluts från funktionell eller strukturell analys. Följaktligen partiskhet introduceras i någon jämförelse av möss överlevande vid en specifik tidspunkt.

Som diskuterats ovan, många olika tekniker finns tillgängliga för att utvärdera hjärt ombyggnad efter hjärtinfarkt. Men tillgången på avancerade och komplexa teknikerkan begränsas i flera utredare. Hemodynamiska utvärdering med Micromanometer trycksensor in via den gemensamma halspulsådern är relativt enkelt och betydligt billigare än andra tekniker. Det bör dock understrykas att det finns inneboende begränsningar för tolkningen av vänsterkammar micromanometry. Däremot analys av ventrikulära tryckvolymförhållanden (t.ex. med hjälp av konduktans micromanometry) utgör den mest rigorösa och omfattande strategi för att utvärdera intakt hjärtfunktion ^28. Den unika fördelen med tryckvolym metod för att mäta hjärtfunktion är att det möjliggör mer specifika mätningar av vänster kammare prestanda oberoende av belastningsförhållanden och hjärtfrekvens ^29.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Buprenorphine (Buprenex)	Bedford Laboratories
Sodium Pentobarbital (Nembutal)	Ceva
Betadine	VWR internationals	200065-400
5 - 0 silk suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	K890H
6 - 0 prolene suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1832
6 - 0 Ti- Cron suture	Ethicon, Johnson & Johnson Medical	F1823
Urethane	Sigma	94300
Alconox	Alconox Inc.
Ventilator, MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
Chest retractor or Thorax retractor	Kent Scientific corporation	INS600240	ALM Self-retaining, serrated, 7 cm long, 4 x 4 "L" shaped prongs, 3 mm x 3 mm
1.0 French Millar pressure catheter	Millar Instruments	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart® software	ADInstruments Pty Ltd.
Rectal probe	ADInstruments Pty Ltd.