Détection et analyse de l'ADN dommages souris muscle squelettique<em> In Situ</em> Utilisation de la méthode TUNEL

Summary

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Abstract

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3’ ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Introduction

Désoxynucléotidyl transférase (TdT) dUTP nick Terminal étiquetage final (TUNEL) est le processus d'utilisation de l'enzyme TdT pour fixer dUTP à 3 'extrémités de double et l'ADN simple brin casse ^12,23. La méthode TUNEL pour la détection de l'apoptose et dommages à l'ADN a été signalée il ya plus de 20 ans par Gavrieli et al. ^1,12,24. Depuis, il a été évalué et optimisé dans les différentes préparations de tissu ^7,23,27,40. TUNEL a été utilisée pour étudier la mort cellulaire induite par l'ischémie des neurones et des cardiomyocytes ^{43,44 6,14,29,} excitotoxique mort des cellules neuronales ^30,31, et en tant que biomarqueur pour le traitement de l'arthrite ^39. Il a également été utilisé en tant que facteur de pronostic et le marqueur de cellules tumorales dans divers cancers humains ^{2,3,15,32,37,38,42.}

Des méthodes alternatives existent pour dommages à l'ADN et la détection de la mort cellulaire, mais ils ont des défis techniques et mises en garde. Southern blot peut être utilisée pour QUANTIFdommages à l'ADN dans les lysats y tissus entiers ^7,9-11, mais cette méthode ne fournit pas la résolution au niveau cellulaire et est difficile à quantifier. Le dosage comète est une méthode à base de cellules de remplacement qui nécessite l'extraction des noyaux de cellules conservées ^4,20,28,36. Bien que le test des comètes fonctionne bien sur des cellules isolées en culture, il est beaucoup plus difficile de préparer des noyaux intacts à partir de tissu musculaire squelettique ^8,21. Comme Southern blot, le dosage comète ne fournit pas d'informations de type cellule-spécifique de tout un homogénat du tissu musculaire. Une autre alternative à la méthode TUNEL est immunohistochimie utilisant des anticorps contre l'ADN simple brin ^25,33,41 ou contre des protéines qui participent dans les voies dommages à l'ADN d'intervention et de mort cellulaire (par exemple p53, H2AX et caspases) ^13,17,22,40. De telles méthodes à base d'anticorps nécessite la caractérisation d'anticorps complète et une excellente spécificité de l'anticorps pour donner un rapport signal à bruit de fond. Même lorsque specific anticorps existent, ils peuvent nécessiter une dénaturation de la protéine cible par des procédures de récupération de l'antigène ^34,35. Comme nous le verrons ici, la récupération d'antigène dans les résultats de tissu musculaire dans inacceptablement élevé autofluorescence. Contrairement aux autres méthodes, TUNEL atteint dommages détection de l'ADN avec un signal élevé et faible bruit de fond, une excellente spécificité qui peut être testée avec des contrôles simples positifs et négatifs, une bonne pénétration de tissu qui ne nécessitent pas de récupération d'antigène, et la résolution de niveau cellulaire. En outre, la méthode TUNEL faut environ quatre heures pour terminer, alors que les méthodes alternatives nécessitent généralement incubations nuit.

Nous étudions squelettique mort des cellules musculaires dans un modèle murin de l'atrophie musculaire spinale (SMA) ¹⁰ qui a été généré par Hsieh-Li et ses collègues ^16. Pour quantifier les cellules apoptotiques dans le muscle, nous avons développé une méthode de préparation des tissus, la coloration, et la quantification robuste qui fonctionne à travers skele différenteTal groupes musculaires à différents points de temps de développement chez la souris. Nous utilisons un kit TUNEL d'étiquetage disponible dans le commerce et commercialisés logiciel d'analyse d'image. Nous avons également utilisé avec succès l'essai TUNEL en combinaison avec coloration immunofluorescente dans la ¹⁰ moelle épinière.

Les méthodes décrites ici sont utiles pour les enquêteurs qui veulent évaluer la pathologie des tissus, des mécanismes de la maladie, les mécanismes du vieillissement et de développement (pré et post-natal) la mort cellulaire dans le muscle squelettique. La technique TUNEL est particulièrement utile pour l'étude des lésions de l'ADN et la réparation et la mort cellulaire dans des systèmes modèles où seul un sous-ensemble de cellules est affecté résolution au niveau cellulaire et ne est nécessaire.

Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement, et basé sur la fluorescence étiquetage TUNEL du muscle squelettique de souris. Il décrit également un procédé de semi-automatisé TUNEL signal de quantification.

Protocol

NOTE: Toutes les procédures d'animaux décrits dans le présent protocole ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health 26. Le protocole (MO13M391) a été approuvé par le Comité Université soin et l'utilisation des animaux Johns Hopkins. Sacrifice 1. néonatale souris, Dissection, et fixation Sacrifiez une souris néonatale par in…

Representative Results

Avec coloration réussie, signal de TUNEL positif doit être assez brillant pour isoler autofluorescence en fixant des seuils d'intensité. Objets TUNEL-positives à faible grossissement peuvent apparaître fragments irréguliers brillants dans le muscle squelettique (Figure 1A). Toutefois, à plus fort grossissement, certains objets TUNEL positif avec la morphologie apoptotique classique doivent être respectées, si le type de mort cellulaire impliquée est l'apoptose (figure 1B).</str…

Discussion

Une méthode pour détecter et analyser quantitativement dommages à l'ADN associée apoptose dans le muscle squelettique de souris est décrit. La procédure comprend la récolte des tissus, coloration TUNEL, l'acquisition d'image numérique, et l'analyse d'image. Fournitures et des outils histologiques communes sont nécessaires, et un kit spécial commerciale TUNEL est nécessaire. Les grands éléments essentiels de l'équipement nécessaires sont un cryostat, un microscope à épifluorescenc…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline	Electron Microscopy Sciences	19202	For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose	Sigma	S0389	Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound	Tissue-Tek	4583	Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat	Leica	CM 3050S	A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	Slides from any supplier may be used.
Gelatin	Sigma	G-9391	Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 mL distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum)	Sigma	243361	Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent	Vector Labs	SP-1800	Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gellatin-coated slides may be used instead.
Tween20	Sigma	P9416	A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100	Sigma	T8787	A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit	Trevigen	4812-30-K	Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
DNase/nuclease buffer	Trevigen	4812-30-K	(included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Amresco	780	Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water	Quality Biologicals	351-029-131	Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M	multiple	807	Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera	–	–	Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media	Vector Labs	H-1000	Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness	Brain Research Labs	2222-1	Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22×22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish	Ted Pella	114-8	Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.