Abstract
De muis is nu de primaire dierlijke gemodelleerd om verschillende longziekten. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan een dergelijke pathologieën te bestuderen, zijn fenotypische methoden nodig dat de pathologische veranderingen kunnen kwantificeren. Bovendien translationeel relevantie voor de muismodellen, mag dergelijke metingen tests die gemakkelijk kan worden gedaan in zowel mensen en muizen. Helaas, in de huidige literatuur enkele fenotypische metingen van longfunctie rechtstreeks op mens. Een uitzondering is de diffusiecapaciteit voor koolmonoxide, een meting die routinematig wordt gedaan bij de mens. In dit rapport beschrijven we een middel om dit diffusiecapaciteit bij muizen snel en eenvoudig te meten. Deze procedure houdt korte longinflatie met tracer gassen in een verdoofde muis, gevolgd door 1 min gas analysetijd. We hebben het vermogen van deze methode om verschillende long ziekten, met inbegrip van emfyseem, fibrose, acute longbeschadiging, en influenza en detecteren getestschimmel longinfecties, evenals bewaking longrijping bij jonge pups. De resultaten tonen significante dalingen in de longen pathologieën, evenals een verhoging van de verstrooiende capaciteit longrijping. Deze meting long diffusiecapaciteit verschaft aldus een longfunctie test die brede toepassing van haar vermogen om fenotypische structurele veranderingen met de meeste bestaande pathologische longmodellen detecteren haalt.
Introduction
De muis is nu de primaire dierlijke gemodelleerd om verschillende longziekten. Om de mechanismen die ten grondslag liggen aan een dergelijke pathologieën te bestuderen, zijn fenotypische methoden nodig die kunnen kwantificeren is de pathologische veranderingen. Hoewel er veel muizenstudies geventileerde mechanica gemeten, deze metingen algemeen los van de standaardbeoordelingen longfunctie normaal gedaan bij de mens. Dit is jammer, aangezien de mogelijkheid om equivalente metingen in muizen en menselijke proefpersonen voeren kan de omzetting van de resultaten in muismodellen voor humane ziekten vergemakkelijken.
Een van de meest voorkomende en gemakkelijk gemaakt metingen bij mensen is het diffusiecapaciteit voor koolmonoxide (DLCO) 1,2, maar deze meting slechts zelden gedaan in muismodellen. In die onderzoeken waar het is gemeld 3-7, zijn er geen follow-up studies geweest, deels omdat de procedures zijn vaak omslachtig of kan aanvruire complexe apparatuur. Een andere benadering is om een CO rebreathing methode in een stabiele toestand, dat het voordeel dat CO diffusie meten bewuste muizen. Deze methode is echter zeer omslachtig en resultaten kunnen variëren met het niveau van de ventilatie van de muis en O2 en CO2 concentraties 8,9. Deze problemen lijken te zijn uitgesloten routinematig gebruik van diffusiecapaciteit long pathologieën bij muizen te detecteren, ondanks de verschillende voordelen.
Om de problemen met bepaling van diffusiecapaciteit bij muizen omzeilen, details van een eenvoudige middelen te meten bij muizen zijn recent gerapporteerd 10. De procedure elimineert het moeilijke probleem van het bemonsteren van niet-verontreinigd alveolaire gas door snel het bemonsteren van een hoeveelheid die gelijk is aan het gehele geïnspireerde gas. Deze procedure resulteert in een zeer reproduceerbare meting zogenaamde diffusie factor voor koolmonoxide (DFCO), dat gevoelig is voor een groot aantal pathologic veranderingen in de longen fenotype. De DFCO wordt dus berekend als 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), waarbij het c en 9 subscripts betrekking op concentraties van de kalibratie gassen geïnjecteerd en de afgevoerde gassen na 9 seconden adem wachttijd, respectievelijk. DFCO is een dimensieloze variabele, die varieert tussen 0 en 1, met 1 als gevolg van volledige opname van alle CO, en 0 geeft het geen opname van CO.
In deze presentatie laten we zien hoe deze diffunderende capaciteitsmeting maken en hoe het kan worden gebruikt om veranderingen in bijna alle bestaande muizenlong ziektemodellen, zoals emfyseem, fibrose, acute longbeschadiging en virale en schimmelinfecties documenteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dieren protocollen werden goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite.
1. Dierlijke Voorbereiding
- Bereid 6 C57BL / 6 controlemuizen voor DFCO meting, door verdoven ze met ketamine en xylazine zoals beschreven in stap 2.3.
- Bereid alle andere muizen met verschillende long pathologieën getoond in Tabel 1 door dezelfde procedure als bij de controles. Bijzonderheden moest elk van deze modellen vastgesteld worden in de relevante referenties. Controlemuizen en die in de andere pathologische cohorten zijn 6-12 weken.
2. Meting van Diffusion Factor voor koolmonoxide (DFCO)
- Het opzetten van de bij de machine geleverd om pieken voor stikstof, zuurstof, neon, en koolmonoxide te meten gaschromatograaf module. Voor deze toepassing gebruik alleen de neon en CO gegevens.
OPMERKING: Dit instrument maakt gebruik van een moleculaire sieve kolom met helium als draaggas, met een 12,00 um film, 320.00 um ID en 10 m lengte. De kolomchromatografie heeft een volume van 0,8 ml, maar we gebruikten 2 ml voldoende clearing van de verbindende buis met het monster te verzekeren. - Aan het begin van elke experimentele dag, alvorens metingen van de monsters van de muizen, rechtstreeks een 2 ml monster van een gasmengsel zak met ongeveer 0,5% Ne, 0,5% CO en balans lucht en gebruik dit monster te kalibreren de gaschromatograaf.
- Verdoven muizen met ketamine (90 mg / kg) en xylazine (15 mg / kg), en bevestig verdoofd door de afwezigheid van reflex beweging. Breng veterinaire zalf op de ogen tot droog voorkomen. Tracheostomize de muizen met een stomp naaldcanule (18 G bij volwassenen of 20 G bij zeer jonge muizen).
OPMERKING: De DFCO is in minder dan 10 minuten na anesthesie voltooid en voorafgaand aan mechanische ventilatie of andere procedures. - Bij muizen meer dan 6 weken oud, gebruikt een 3 ml spuit to trekken 0,8 ml van gas uit het gasmengsel zak. Sluit de spuit aan de tracheacanule en snel op te blazen de long. Met behulp van een metronoom, tel 9 sec, en dan snel terug te trekken van de 0,8 ml (uitgeademde lucht).
- Verdun deze ingetrokken 0,8 ml uitgeademde lucht tot 2 ml met lucht in de ruimte, laat het rusten voor ten minste 15 sec. Injecteren dan is het hele monster in de gaschromatograaf voor analyse.
- Tijdens het analyseren deze eerste DFCO monster opblazen van de muis long met een tweede 0,8 ml van het gasmengsel zak, en verwerk dit voorbeeld identiek aan de eerste monster. Het gemiddelde van de twee DFCO metingen.
OPMERKING: Voor metingen bij muizen zo jong als 2 weken oud gebruikt een volume van 0,4 ml, 0,8 ml aangezien te grote hoeveelheid metingen maken longen van jonge muizen. Het is beter om het volume 0,8 ml muizen ouder dan 6 weken gebruikt, en dat als de 0,4 ml volume nodig voor sommige muizen is consistent moet worden gebruikt voor alle muizen in het cohort bestudeerd. - Bereken DFCOals 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), waarbij c en 9 indices hebben betrekking op concentraties van de kalibratie gassen geïnjecteerd en de gassen verwijderd na een 9 sec adem wachttijd, respectievelijk.
- Analyseren en vergelijken verschillen met een eenzijdige ANOVA en het significantieniveau van Tukey correctie voor meervoudige vergelijkingen in de cohort muizen te beoordelen. Overweeg p <0,05 als significant waarde.
OPMERKING: Alle van de muizen die hier gebruikt maakten deel uit van experimentele studies met meerdere opeenvolgende metingen van longventilatie, mechanica, longlavage of histologie, die hier niet worden vermeld. Bovendien, omdat de werkwijze is hetzelfde in alle experimentele modellen zoals hierboven uitgevoerd in de controle muizen, alleen de resultaten van de verschillende pathologische modellen gepresenteerd. Nadere informatie over deze modellen wordt gepresenteerd in de aanvullende tabel. - Euthanaseren van de dieren door de diepe anesthetic overdosis gevolgd door cervicale dislocatie of onthoofding. Waar nodig, verwijderen van de long cellen en / of weefsels van de dode muizen verdere biologische of histologische verwerking en analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de DFCO metingen van de volwassen muizen in groepen A, B, C, D, E en F. Er waren significante daling van zowel de Aspergillus en influenza-infecties, en significante daling van het fibrotische, emfysemateuze en acute longbeschadiging modellen. Figuur 2 toont de groep G ontwikkelingsveranderingen in DFCO tijd als de muizen leeftijd 2-6 weken. Er was een lichte, maar significante stijging met longontwikkeling gedurende deze tijdsduur. Het effect van het gebruik van een kleiner volume inflatie was ook heel duidelijk bij 6 weken tijdstip. Er was een neiging van de vrouwtjes een iets hogere DFCO, maar dit was slechts significant op het 5 weken tijdstip.
| Groep | Pathologie of Voorwaarde | Reacties |
| Een | C57BL / 6 controles (8-10 weken), n = 6 | Gezonde muizen </ Td> |
| B | C57BL / 6 muizen die 25 TCID50 van influenza A virus (PR8) intranasaal, n = 10 | Influenza-model, studeerde 6 en 8 dagen na de infectie |
| C | C57BL / 6 muizen die 5,4 U elastase intratracheaal, n = 6 | Emfyseem model 10,13 bestudeerde 21 dagen na elastase uitdaging |
| D | C57BL / 6 muizen die 0,05 U bleomycine intratracheaal, n = 6 | Fibrose model 14 bestudeerde 14 dagen na bleomycine uitdaging |
| E | CFTR null controles en die besmet zijn met aërosol inhalatie van Aspergillus fumigatus (stam AF293), n = 6 | Schimmelinfectie model 11,17 bestudeerde 12 dagen na schimmelinfectie |
| F | C57BL / 6 muizen die 3 ug / g BW LPS (Escherichia coli) intratracheaal, n = 6 | Acute Lung Injury (ALI) model 15 bestudeerdeop dagen 1 en 4 na de LPS insult |
| G | C57BL / 6 mannelijke muizen op 2 tot 6 weken oud, n = 5 in elke leeftijdsgroep | Lung ontwikkelingsmodel |
Tabel 1: Lijst van de verschillende muismodellen waar de DFCO werd gemeten.
Figuur 1:. Meting van DFCO in de controle C57BL / 6 muizen (groep A) en elk van de 5 verschillende pathologische modellen Getoond worden resultaten 6 en 8 dagen na het influenza PR8 (groep B), 21 dagen na intratracheale elastase (Group C), 14 dagen na intratracheale bleomycine (groep D), 12 dagen na deze infecties in het CFTR null muizen (groep E), en 1 en 4 dagen na LPS instillatie (groep F). De * geeft P <0,01 versus controle, het # geeft P <0,01 tussen 6 en8 dagen influenza muizen en de 1 en 4 dagen LPS muizen en de + geeft P <0,05 versus controle.
Figuur 2: Meting van DFCO bij mannelijke C57BL / 6 muizen uit 2 tot 6 weken (groep G) De metingen werden alle muizen met een inflatie volume van 0,4 ml, en in de 6 weken oude muizen van een tweede meting was. gemaakt met 0,8 ml. Met het volume van 0,4 ml, waren er significante stijgingen DFCO tussen de 2 weken mannelijke en de 4, 5, en 6 weken (p <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het huidige werk, hebben we een nieuwe metriek om het gas te wisselen vermogen van de muis long kwantificeren gedefinieerd. Deze statistiek is analoog aan de diffusiecapaciteit, gemeenschappelijke klinische meting dat de primaire functie van de longen gemeten, dat wil zeggen het vermogen om gasuitwisseling. De diffusiecapaciteit Alleen long functionele metingen die gemakkelijk en snel kan worden gedaan in zowel muizen als mensen. Voor de detectie van longziekte bij muizen, een belangrijke doelstelling veranderingen in longfunctie tussen controle en experimentele cohorten kwantificeren. Om dit doel te bereiken, hebben we vastgesteld en gebruikt de DFCO haar vermogen van quanitfying fenotypische veranderingen meeste meest gangbare modellen van longziekte bij muizen, inclusief functionele veranderingen met longontwikkeling tonen.
Een aanname inherent in de benadering dat de DFCO meting muizen vereenvoudigd is dat het effect van zuiver geïnspireerd gas in de anatomische en apparatuur dode ruimte ignORed. Zoals eerder beschreven 10, het gebruik van de 0,8 ml inflatie volume wordt een kleine maar consistente fout in de metingen. De grootte van deze fout is een functie van de relatieve grootte van de inflatie en dode ruimte volumes. In deze benadering wordt deze fout geminimaliseerd door het elimineren van de dode ruimte kranen of T-connectoren, en zoals getoond in de video, gewoon gebruikt een vingertop om de spuit te verzegelen en gas te vergemakkelijken. Deze procedure resulteert in een hoge herhaalbaarheid van metingen. Het effect van de kleinere inflatie volume vereist de jonge muizen wordt duidelijk in de 6 weken oude muizen weergegeven in figuur 2, waarbij de eerste 0,4 ml proef onmiddellijk werd gevolgd met 0,8 ml test bij elke muis gemaakt. 0,8 ml van de DFCO waarde lag in het gebied van C57BL / 6 muizen in de andere groepen, maar de meting met 0,4 ml is altijd kleiner. Dit is een rechtstreekse uiting van het feit dat de kleinere volume, de recovered 9 sec monster heeft een grotere fractie van de dode ruimte lucht, die slechts bestaat uit de controle gasconcentraties. Dit feit manifesteert zich als kleine fractionele verandering in de CO -concentratie die dichter brengt de verandering van Ne concentratie. Met een verhoogde verhouding van CO / Ne, de berekende DFCO (1 - deze verhouding) is dus kleiner.
In de vele modellen van longpathologie figuur 1, zijn er significante afnames waargenomen DFCO. Er zijn verschillende redenen waarom de DFCO afneemt deze verschillende modellen. In fibrose veroorzaakt door enkelvoudige dosis bleomycine, er een ontsteking en een verdikking van de diffusiebarrière die leidt tot een vermindering diffusiecapaciteit 16. Bij emfyseem is er een verlies van oppervlak werkt rechtstreeks bij het oppervlak voor diffusie en het bloedvolume in haarvaten dat de vernietigde muren was verlagen. Geen dosis-respons relaties met de elastase worden hier gepresenteerd, maar ongepubliceerde gegevens blijkt een goede correlatie van de DFCO het niveau van emfyseem beschadiging. Met de influenza-infectie, is er verminderde diffusiecapaciteit waarschijnlijk het gevolg van zowel een verdikking van de diffusiebarrière en een hoger geconsolideerd ongeventileerde gebieden van de long. In het influenza PR8 gebruikte model, dit verergert de tijd (zoals weergegeven in de verdere significante daling DFCO op dag 8), en de muizen sterven doorgaans rond dag 10. In het CFTR null muizen was er een kleinere DFCO bij aanvang maar deze muizen worden gemaakt op een gemengde genetische achtergrond 17, zodat er structurele verschillen met de C57BL6 controles kunnen worden. Echter, de Aspergillus-infectie veroorzaakt een meer substantiële significante daling van DFCO, en de redenen voor deze daling met de schimmelinfectie zijn waarschijnlijk vergelijkbaar met die met de griep. De LPS leidt tot acute ontsteking die veroorzaakt een significant verminderde DFCO waarschijnlijk van oedemateuze verdikking van de diffusion barrière en ongeventileerde regio's van de longen gevuld met vloeistof. Met de dosis LPS gebruikt, de afname DFCO het grootst op dag 4 of 5 en vervolgens herstelt naar controle op dag 10 (gegevens niet getoond).
Voor de analyse van veranderingen in DFCO met longgroei in de jonge muizen, 0,4 ml inflatievolume duidelijk toegestaan reproduceerbare metingen en kon een langzame stijging diffusiecapaciteit de longen bereikt volwassen looptijd (figuur 2) tonen. Het effect van het gebruik van een kleinere 0,4 ml inflatievolume afnemende de berekende DFCO ook wat werd verwacht, maar de grotere 0,8 ml volume kan niet worden gebruikt in de kleinere muizen. Maar verandert met de ontwikkeling of pathologie moet nog steeds reproduceerbaar detecteerbaar zelfs met het volume van 0,4 ml.
Kortom, deze video en begeleidende manuscript laat zien hoe een functioneel meting muizen die vergelijkbaar is met wat kan worden gemeten in mensen te verkrijgen. De metriek weerspiegelt het eenbaarheid van de long gasuitwisseling met verschillende long structurele veranderingen veroorzaakt door de meest bestudeerde pathologieën. Deze diffusie factor voor koolmonoxide (DFCO) is zeer reproduceerbaar, en gevoelig genoeg om functionele en structurele veranderingen met de meeste experimenteel geïnduceerde pathologieën bij jonge of oude muizen te detecteren. Het feit dat het direct analoog aan vergelijkbare metingen die bij de mens om longziekte beoordelen, maakt het een eenvoudige manier om een zeer relevante metrische om muislong pathologieën phenytype verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten, en niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al.
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299 (2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
