Abstract
La souris est maintenant l'animal primaire utilisé pour modéliser une variété de maladies pulmonaires. Pour étudier les mécanismes qui sous-tendent ces pathologies, les méthodes phénotypiques sont nécessaires qui peuvent quantifier les changements pathologiques. En outre, de fournir la pertinence de translation les modèles de souris, de telles mesures devraient être des tests qui peuvent facilement être faites chez les humains et les souris. Malheureusement, dans la littérature actuelle quelques mesures phénotypiques de la fonction pulmonaire ont une application directe pour l'homme. Une exception est la capacité de diffusion du monoxyde de carbone, qui est une mesure qui se fait couramment chez l'homme. Dans le présent rapport, nous décrivons un moyen de mesurer rapidement et simplement cette capacité de diffusion chez les souris. La procédure implique une brève inflation des poumons avec un gaz témoin dans une souris anesthésiée, suivie d'un temps d'analyse des gaz 1 min. Nous avons testé la capacité de cette méthode pour détecter plusieurs pathologies pulmonaires, y compris l'emphysème, la fibrose, une lésion pulmonaire aiguë et de la grippe etinfections pulmonaires fongiques, ainsi que la surveillance maturation pulmonaire chez les jeunes chiots. Les résultats montrent une diminution significative dans toutes les pathologies du poumon, ainsi que l'augmentation de la capacité de diffusion de la maturation pulmonaire. Cette mesure de la capacité de diffusion du poumon fournit donc un test de la fonction pulmonaire qui a une large application avec sa capacité à détecter des changements structurels phénotypiques avec la plupart des modèles pulmonaires pathologiques existants.
Introduction
La souris est maintenant l'animal primaire utilisé pour modéliser une variété de maladies pulmonaires. Pour étudier les mécanismes qui sous-tendent ces pathologies, les méthodes phénotypiques sont nécessaires qui peuvent quantifier les changements pathologiques il. Bien qu'il existe de nombreuses études sur les souris où la mécanique de ventilation sont mesurés, ces mesures sont généralement sans rapport avec les évaluations standard de la fonction pulmonaire chez l'homme fait normalement. Ce est malheureux, car la capacité d'effectuer des mesures équivalentes dans les souris et les sujets humains peut faciliter la traduction des résultats dans des modèles murins de maladies humaines.
Une des mesures les plus communs et facilement faites sur des sujets humains est la capacité de diffusion du monoxyde de carbone (DLCO) 1,2, mais cette mesure n'a que rarement été fait dans les modèles de souris. Dans les études où il a été rapporté 3-7, il ya eu aucune étude de suivi, en partie parce que les procédures sont souvent lourds ou peuvent REQUIRE équipements complexes. Une autre approche consiste à utiliser une méthode de CO réinspiration dans un système de l'état d'équilibre, qui a l'avantage d'être capable de mesurer la diffusion de CO chez des souris conscientes. Cependant cette méthode est très lourd, et les résultats peuvent varier avec le niveau de la ventilation de la souris ainsi que O 2 et CO 2 concentrations 8,9. Ces difficultés semblent avoir empêché l'utilisation systématique de la capacité de diffusion pour détecter des pathologies pulmonaires chez la souris, en dépit de ses nombreux avantages.
Pour contourner les problèmes de mesure de la capacité de diffusion chez les souris, les détails d'un moyen simple de mesurer dans des souris ont été récemment rapporté 10. La procédure élimine le difficile problème de prélèvement des gaz alvéolaire non contaminée par échantillonnage rapidement un volume égal à l'ensemble du gaz inspiré. Ce procédé aboutit à une mesure très reproductible, appelée coefficient de diffusion pour le monoxyde de carbone (DFCO), qui est sensible à un hôte de pathologic changements dans le phénotype du poumon. Le DFCO est donc calculé comme 1 - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), où le c et 9 indices se rapportent aux concentrations des gaz d'étalonnage injectés et les gaz retirés après un temps d'apnée 9 sec, respectivement. DFCO est une variable sans dimension, qui varie entre 0 et 1, avec une réflexion absorption complète de tous CO, 0 et reflétant pas l'absorption de CO.
Dans cette présentation, nous montrons comment faire cette mesure de la capacité de diffusion, et comment il peut être utilisé pour documenter les changements dans presque tous les modèles de maladies pulmonaires de la souris existants, y compris l'emphysème, la fibrose, une lésion pulmonaire aiguë et les infections virales et fongiques.
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Protocol
REMARQUE: Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité Université soin et l'utilisation des animaux Johns Hopkins.
1. Préparation des animaux
- Préparer 6 souris C57BL / 6 de contrôle pour la mesure DFCO, en les anesthésier avec la kétamine et de la xylazine tel que décrit à l'étape 2.3 ci-dessous.
- Préparer tous les autres souris avec les différentes pathologies pulmonaires indiqués dans le tableau 1 en utilisant le même mode opératoire que pour les témoins. Les détails spécifiques nécessaires pour établir chacun de ces modèles se trouvent dans les références pertinentes. Les souris témoins et ceux dans les autres cohortes pathologiques sont tous les 6 à 12 semaines d'âge.
2. Mesure de Diffusion Facteur pour le monoxyde de carbone (DFCO)
- Mettre en place le module de chromatographie en phase gazeuse fourni avec la machine à mesurer les pics de l'azote, de l'oxygène, le néon, et le monoxyde de carbone. Pour cette utilisation de l'application uniquement les données de néon et de CO.
NOTE: Cet instrument utilise un s moléculairesIEVE colonne avec de l'hélium comme gaz porteur, avec un 12,00 um film 320,00 ID um et 10 m de longueur. La colonne de Chromatographie a un volume de 0,8 ml, mais on utilise 2 ml d'assurer la compensation adéquate de la tubulure de liaison avec l'échantillon. - Au début de chaque journée expérimentale, avant de prendre les mesures des échantillons provenant des souris, prendre un échantillon de 2 ml directement d'un sac de mélange gazeux contenant environ 0,5% Ne, 0,5% de CO, et d'équilibrer l'air, et utiliser cet exemple pour calibrer le chromatographe en phase gazeuse.
- Anesthésier les souris avec de la kétamine (90 mg / kg) et de xylazine (15 mg / kg), et de confirmer l'anesthésie par l'absence de mouvement réflexe. Appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse. Tracheostomize les souris avec une canule d'aiguille de stub (18 G chez les adultes ou 20 G chez les très jeunes souris).
NOTE: Le DFCO est terminée en moins de 10 min après l'anesthésie et avant toute ventilation mécanique ou d'autres procédures. - Chez les souris de plus de 6 semaines d'âge, utiliser une seringue de 3 ml to retirer 0,8 ml de gaz dans le sac de mélange de gaz. Connectez la seringue à la canule trachéale et gonfler rapidement le poumon. Utiliser un métronome, comptez 9 sec, puis rapidement retirer les 0,8 ml (air expiré).
- Diluer cette retirés 0,8 ml air expiré à 2 ml avec l'air ambiant, laisser reposer pendant au moins 15 secondes. Puis injecter la totalité de l'échantillon dans le chromatographe en phase gazeuse pour analyse.
- Bien que l'analyse de ce premier échantillon DFCO, gonfler le poumon de souris avec une seconde 0,8 ml dans le sac de mélange de gaz, puis traiter cet échantillon identique au premier échantillon. La moyenne des deux mesures DFCO.
NOTE: Pour les mesures dans des souris aussi jeunes que 2 semaines d'âge, utiliser un volume de 0,4 ml, 0,8 ml est depuis un volume trop important de faire des mesures dans les poumons de souris très jeunes. Il est préférable d'utiliser le volume de 0,8 ml pour les souris âgées de 6 semaines, et que si le volume de 0,4 ml est nécessaire pour certaines souris, il devrait être utilisé systématiquement pour toutes les souris de la cohorte à l'étude. - Calculer DFCOcomme une - (CO 9 / CO c) / (Ne 9 / Ne c), où c et 9 indices se rapportent aux concentrations de gaz d'étalonnage et les gaz injectés retirées après un temps de maintien 9 souffle sec, respectivement.
- Analyser et comparer les différences avec une analyse de variance à une voie et d'évaluer le niveau avec la correction de Tukey pour les comparaisons multiples dans toutes les souris de la cohorte de signification. Considérez p <0,05 de valeur aussi importante.
NOTE: Toutes les souris utilisées ici ont fait partie des études expérimentales impliquant plusieurs mesures ultérieures de la ventilation pulmonaire, la mécanique, le lavage du poumon, ou l'histologie, qui ne sont pas signalés ici. En outre, puisque le procédé est le même dans tous les modèles expérimentaux comme l'a fait ci-dessus dans les souris témoins, seuls les résultats des différents modèles pathologiques sont présentés. De plus amples informations sur ces modèles est présentée dans le tableau supplémentaire. - Euthanasier les animaux par anesthe profondesurdosage tic suivie par dislocation cervicale ou décapitation. Le cas échéant, éliminer les cellules et / ou tissus pulmonaires des souris mortes pour la poursuite ou de la transformation biologique et l'analyse histologique.
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Representative Results
La figure 1 montre les mesures DFCO des souris adultes dans les groupes A, B, C, D, E et F. Il y avait une diminution significative avec les deux infections à Aspergillus et à la grippe, ainsi que des diminutions significatives de la fibrose, emphysème, et aiguë modèles de lésion pulmonaire. La figure 2 montre les changements dans le développement du Groupe G en DFCO au fil du temps que l'âge de la souris 2-6 semaines. Il y avait une augmentation légère mais significative avec le développement du poumon au cours de cette évolution dans le temps. L'effet d'utiliser un volume d'inflation plus faible était également très apparente au point de temps de six semaines. Il y avait une tendance pour les femmes d'avoir un DFCO légèrement plus élevé, mais ce ne était significative au point de temps de 5 semaines.
| Groupe | Pathologie ou condition | Commentaires |
| Un | C57BL / 6 contrôles (8-10 semaines), n = 6 | Souris saines </ Td> |
| B | C57BL / 6 ont reçu 25 TCID50 de virus grippal A (PR8) par voie intranasale, n = 10 | modèle de la grippe, a étudié six et huit jours après l'infection |
| C | Souris C57BL / 6 ont reçu 5,4 U élastase pancréatique par voie intratracheale, n = 6 | modèle de l'emphysème 10,13 étudié 21 jours après la provocation de l'élastase |
| Ré | C57BL / 6 donnée 0,05 U bléomycine intratrachéale, n = 6 | modèle de fibrose 14 étudié 14 jours après la provocation bléomycine |
| E | CFTR contrôles NULL et les personnes infectées par l'inhalation d'aérosols d'Aspergillus fumigatus (souche AF293), n = 6 | Modèle d'infection fongique 11,17 étudié 12 jours après l'infection fongique |
| Fa | C57BL / 6 souris ayant reçu 3 pg LPS / g de BW (Escherichia coli) intra-trachéale, n = 6 | Blessure (ALI) modèle pulmonaire aiguë 15 étudiéaux jours 1 et 4 après l'insulte LPS |
| Sol | C57BL / 6 de souris mâles à 2-6 semaines d'âge, n = 5 à chaque âge | Modèle de développement pulmonaire |
Tableau 1: Liste des différents modèles de souris où le DFCO a été mesurée.
Figure 1:. Mesure de DFCO en contrôle la souris C57BL / 6 (groupe A) et dans chacun des cinq différents modèles pathologiques Sont représentés les résultats 6 et 8 jours après la grippe PR8 (Groupe B), 21 jours après l'élastase intratrachéale (Group C), 14 jours après la bléomycine intratrachéale (Groupe D), 12 jours après l'infection par Aspergillus chez les souris nulles CFTR (groupe E), et de 1 à 4 jours après l'instillation de LPS (groupe F). Le * indique P <0,01 par rapport au témoin, le # indique P <0,01 entre le 6 et8 souris de la grippe de jour et les souris 1 et 4 LPS de jour, et la + indique P <0,05 par rapport au témoin.
Figure 2: Mesure de DFCO mâles C57BL / 6 de 2 à 6 semaines d'âge (Groupe G) Les mesures ont été faites chez toutes les souris avec un volume d'inflation de 0,4 ml, et dans la vieille six semaines souris une seconde mesure était. à base de 0,8 ml. Avec le volume de 0,4 ml, il y avait des augmentations significatives de la DFCO entre 2 semaines mâle et ceux à 4, 5, et 6 semaines (P <0,05).
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Discussion
Dans le présent travail, nous avons défini une nouvelle mesure pour quantifier la capacité des poumons de souris de gaz échanger. Cette métrique est analogue à la capacité de diffusion, une mesure clinique courant qui mesure la fonction primaire du poumon, ce est-à sa capacité à échanger des gaz. La capacité de diffusion est la seule mesure fonctionnelle du poumon qui peut être fait facilement et rapidement chez les souris et les humains. Pour la détection de la maladie du poumon chez la souris, un objectif majeur est de quantifier les changements dans la fonction pulmonaire entre contrôle et cohortes expérimentales. Pour atteindre cet objectif, nous avons défini et utilisé le DFCO pour démontrer sa capacité de quanitfying changements phénotypiques dans la plupart des modèles les plus courants de la maladie du poumon chez les souris, y compris les changements fonctionnels avec le développement des poumons.
Une hypothèse inhérente à l'approche qui simplifie la mesure DFCO chez la souris, ce est que l'effet de gaz inspiré non mélangés dans l'espace mort anatomique et l'équipement est ignORed. Cependant, comme 10 décrit précédemment, l'utilisation du volume de 0,8 ml de gonflage introduit une petite mais constante erreur dans toutes les mesures. La grandeur de cette erreur est fonction de la taille relative de l'inflation et de volumes morts dans l'espace. Dans l'approche actuelle, cette erreur est minimisée en éliminant l'espace mort dans les robinets ou des connecteurs en T, et comme le montre la vidéo, utilise simplement un doigt pour sceller la seringue et faciliter le transfert de gaz. Cette procédure entraîne une répétabilité élevée entre les mesures. L'effet du volume d'inflation plus faible nécessaire chez les jeunes souris est précisé dans les six semaines vieilles souris à la figure 2, où le test initial de 0,4 ml a été immédiatement suivie par un test de 0,8 ml dans chaque souris. Avec 0,8 ml à la valeur DFCO était de l'ordre de souris C57BL / 6 dans les autres groupes, mais la mesure avec 0,4 ml est toujours plus petite. Il se agit d'une manifestation directe du fait que, avec le plus petit volume, le recovered 9 échantillon sec a une plus grande fraction de l'air de l'espace mort, qui consiste simplement à les concentrations de gaz de contrôle. Cet effet se manifeste par un changement fractionnaire inférieure à la concentration de CO, ce qui la rapproche du changement de concentration Ne. Avec un ratio accru de CO / Ne, le DFCO calculée (1 - ce ratio) est donc plus petite.
Dans les nombreux modèles de pathologie pulmonaire représentés sur la figure 1, il y avait des diminutions significatives observées dans DFCO. Cependant, il ya plusieurs raisons différentes pour lesquelles le DFCO diminue dans ces différents modèles. Dans fibrose provoquée par la dose unique de la bléomycine, il ya une inflammation et un épaississement de la barrière de diffusion qui conduit à une réduction de la capacité de diffusion 16. Dans l'emphysème, il ya une perte de surface agit directement à la fois à diminuer la surface de diffusion et le volume de sang dans les capillaires qui ont été détruits dans les parois. Aucune relation dose-réponse avec les elastase sont présentés ici, mais les données non publiées montre une bonne corrélation du DFCO avec le niveau de dommages emphysème. Avec l'infection grippale, on réduit la capacité de diffusion, probablement en raison à la fois d'un épaississement de la barrière de diffusion et une augmentation dans les régions non ventilées consolidés du poumon. Dans le modèle de la grippe PR8 utilisée ici, cela aggrave au fil du temps (comme en témoigne la poursuite de la diminution significative de la DFCO au jour 8), et les souris meurent généralement pendant la journée autour 10. Dans les souris nulles CFTR, il y avait un petit DFCO au départ , mais ces souris sont rendues sur un fond génétique mixte 17, donc il peut y avoir des différences structurelles avec les contrôles C57BL6. Toutefois, l'infection Aspergillus a entraîné une diminution significative plus important dans DFCO, et les raisons de cette baisse avec l'infection fongique sont probablement semblables à ceux de la grippe. Les résultats de LPS dans l'inflammation aiguë qui provoque une diminution significative DFCO, susceptibles de se épaissir oedémateux de la diFFusion barrière et les régions de poumon non ventilé remplies de liquide. Avec la dose de LPS utilisée, la diminution de DFCO est plus grande au jour 4 ou 5 et récupère arrière à commande par 10 jour puis (données non présentées).
Pour l'analyse des changements dans DFCO avec la croissance pulmonaire chez les jeunes souris, le volume de l'inflation de 0,4 ml clairement permis des mesures reproductibles, et a pu montrer une augmentation lente dans la capacité de diffusion que la maturité des adultes du poumon atteint (Figure 2). L'effet de l'utilisation d'une 0,4 ml de volume de gonflage inférieure à diminuer la DFCO calculée est également ce qui était attendu, mais plus 0,8 ml de volume ne peut pas être utilisé chez les souris plus petites. Mais les changements avec le développement ou la pathologie doivent être encore détectable reproductible même avec le volume de 0,4 ml.
En conclusion, cette vidéo et le manuscrit d'accompagnement montre comment obtenir une mesure fonctionnelle chez les souris qui est similaire à ce qui peut être mesurée chez les humains. La mesure reflète l'unbilité du poumon à échanger le gaz avec une variété de modifications structurelles pulmonaires causées par les pathologies les plus couramment étudiées. Ce facteur de diffusion pour le monoxyde de carbone (DFCO) est hautement reproductible et suffisamment sensible pour détecter des changements fonctionnels et structurels avec des pathologies plus expérimentalement induite chez des souris jeunes ou âgés. Le fait qu'il est directement analogue à des mesures analogues réalisées chez l'homme pour évaluer les maladies pulmonaires, en fait un moyen simple d'obtenir une mesure très pertinentes pour phenytype pathologies pulmonaires de souris.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts, et rien à divulguer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al.
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299 (2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
