Abstract
鼠标是目前用于模拟各种肺部疾病的主要动物。研究背后等病理机制，能够量化的病理改变是需要的表型的方法。此外，以提供平移的相关性的小鼠模型中，这样的测量应测试，可以很容易地在人类和小鼠中进行。不幸的是，在本文献中很少的表型肺功能的测量直接适用于人类。一个例外是对一氧化碳，这是一种测量被定期在人中进行的弥散能力。在本报告中，我们描述了快速，简单地衡量这种扩散能力的小鼠的一种手段。该过程涉及简要肺膨胀与示踪气体麻醉小鼠，接着是1分钟的气体分析时间。我们已经测试了该方法的检测几个肺病理学，包括肺气肿，纤维化，急性肺损伤，和流感和能力真菌肺部感染，以及在年轻幼仔监测肺成熟。结果表明在所有的肺病理学显著下跌，以及增加漫射容量与肺成熟。肺弥散量这一测量从而提供了一个肺功能测试有其检测与大多数现有的病理肺模型的表型的结构性变化的能力具有广阔的应用。
Introduction
鼠标是目前用于模拟各种肺部疾病的主要动物。研究认为underly这样的病理机制，可以量化它的病理改变是需要的表型的方法。虽然有许多小鼠研究，其中通风力学测量，这些测量通常是无关的肺功能的标准评估在人类正常完成。这是不幸的，因为要执行在小鼠和人类受试者等效测量可以便于结果的翻译在小鼠模型与人类疾病的能力。
一种在人受试者中最常见的，并很容易地进行的测量的是一氧化碳（弥散）1,2-扩散能力，但是这种测量只有很少在小鼠模型中进行。在那些已经报道3-7的研究，没有出现过的后续研究中，部分是因为程序往往笨重，或者可以REQuire复杂的设备。另一种方法是在稳定状态下的系统，其具有能够测量CO扩散在有意识的小鼠的优点使用CO再呼吸方法。然而，这种方法非常麻烦，而且结果可以用鼠标的通风的水平以及O 2和CO 2浓度的8,9而改变。这些困难似乎已经排除了常规使用弥散量来检测小鼠肺病理学的，尽管它的几个优点。
规避问题漫射小鼠容量的测定中，一个简单的装置的细节，以测量它在小鼠中最近已报道10。该过程消除了快速采样体积等于整个灵感气体采样未被污染的肺泡气难的问题。这个过程的结果在一个非常可重复的测量，称为扩散系数为一氧化碳（DFCO），即到主机PA的敏感thologic变化在肺表型。因此DFCO计算为1 - （CO 9 / CO C）/（氖9 /氖c）中 ，其中c和9标是指注入的校准气体的浓度和后9秒屏气时间除去气体，分别。 DFCO是无量纲变量，0和1之间变化，其中1反映所有的CO完全吸收，而0反映无吸收的CO。
在这份报告中，我们展示了如何让这个弥散量的测量，以及如何可以用来记录变化，几乎所有现有的小鼠肺疾病模型，包括肺气肿，肝纤维化，急性肺损伤，以及病毒和真菌感染。
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Protocol
注：所有动物方案批准了约翰·霍普金斯大学动物护理和使用委员会。
1.动物准备
- 制备6的C57BL / 6对照小鼠为DFCO测定，通过如以下步骤2.3中概述用氯胺酮和赛拉嗪麻醉它们。
- 通过使用相同的程序作为用于控制准备的所有其他小鼠在表1所示的不同的肺病理学。建立这些模型需要的具体细节中找到相关的文献。对照小鼠和那些在其他病理队列都是6-12周龄。
2.测量扩散系数一氧化碳（DFCO）
- 建立与机器供给至测量为氮，氧，氖，和一氧化碳峰的气相色谱仪模块。对于这个应用程序只使用霓虹灯和CO的数据。
注：本仪器采用分子sieve柱以氦作为载气，用12.00微米膜，320.00微米ID和10米长。色谱仪柱具有0.8毫升的体积，但我们用来2毫升确保连接管与样品的充分清除。 - 在每个实验日的开始之前，使得从小鼠的样品的测量结果，取2ml样品直接从含有大约0.5％的氖，0.5％的CO的气体混合物包，和平衡空气，并且使用该样本来校准气相色谱仪。
- 麻醉小鼠用氯胺酮（90毫克/千克）和赛拉嗪（15毫克/千克），并由于没有反射运动的确认麻醉。取适量涂抹于眼睛兽医药膏，以防止干燥。 Tracheostomize的小鼠存根针管（18克成人或20G的非常年轻小鼠）。
注：DFCO完成在麻醉后不到10分钟，并优先于任何机械通风或其他程序。 - 在小鼠中大于6周龄，使用3毫升注射器吨ø撤回0.8毫升气体从气体混合物包。注射器连接到气管插管，迅速膨胀的肺。使用节拍器，算上9秒，然后迅速撤回0.8毫升（呼出的空气）。
- 淡化这种撤回0.8毫升呼出的空气〜2毫升室内空气，让它休息至少15秒。然后注入整个样品注入气相色谱仪进行分析。
- 在分析该第一DFCO样品，膨胀的小鼠肺与第二0.8毫升从气体混合物包，然后处理该样品与第一样品。平均两个DFCO测量。
注：有关小鼠年仅2周龄时测量，用0.4毫升的体积，因为0.8毫升过大的体积，使测量非常年轻小鼠的肺部。最好是使用0.8毫升体积超过6周小鼠，而且如果是需要一些小鼠0.4毫升体积，应当一致地用于正在研究中的队列的所有小鼠。 - 计算DFCO如1 - （CO 9 / CO C）/（氖9 /氖c）中 ，其中c和9标是指注入的校准气体的浓度，并分别经过9秒屏气时间除去气体。
- 分析和比较用单向ANOVA差异和评估与Tukey的校正中的所有队列小鼠多重比较的显着性水平。考虑P <0.05为显著的价值。
注意：所有在这里所用的小鼠是涉及肺通气，力学，肺灌洗，或组织学的几个后续测量，这未在此处报道的实验研究的一部分。此外，由于该方法是在所有的实验模型如在对照小鼠上面做了同样的，只能从各种病理模型的结果。这些模型的进一步信息呈现在补充表。 - 安乐死的动物深anesthe抽动过量颈椎脱位或斩首。在需要的地方，从死老鼠进一步生物或组织学处理和分析取出肺细胞和/或组织。
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Representative Results
图1示出了从成年小鼠在组A，B，C，D，E和F的DFCO测量有显著下跌同时与曲霉属和流行性感冒感染，以及在纤维化，气肿显著减少，急性肺损伤的模型。 图2示出在DFCO随时间小鼠年龄2-6周的G组的发展变化。有轻微但显著增加与肺发育超过这个时间过程。使用较小的膨胀体积的效果也是在6周的时间点相当明显。有对女性具有稍高DFCO的倾向，但是这只是在5周时间点显著。
| 组 | 病理或条件 | 评论 |
| 一 | C57BL / 6控制（8-10周），N = 6 | 健康小鼠</ TD> |
| B | C57BL / 6小鼠给予25 A型流感病毒（PR8）鼻内的TCID 50中，n = 10 | 流感模型中，研究了6和8天后感染后 |
| Ç | C57BL / 6小鼠给予5.4ü胰弹性蛋白酶气管内，N = 6 | 肺气肿模型10,13研究弹性蛋白酶的挑战后21天 |
| ð | C57BL / 6小鼠给予0.05ü博莱霉素气管内，N = 6 | 纤维化模型14研究14天博莱霉素攻击后 |
| Ë | CFTR空控制以及那些感染了烟曲霉 （株AF293）雾化吸入，N = 6 | 真菌感染模型11,17研究12天真菌感染后， |
| ˚F | 定3微克/克体重的LPS（ 大肠杆菌 ）C57BL / 6小鼠气管中，n = 6 | 急性肺损伤（ALI）模型研究15第1天和第4脂多糖损伤后 |
| 摹 | C57BL / 6雄性小鼠在2-6周龄，每组5在每个年龄 | 龙发展模式 |
表1：不同的小鼠模型的DFCO是衡量地方上市。
图1：DFCO在控制C57BL / 6小鼠（A组）测量与各5种不同病理模型显示的是结果6和8天PR8流感（B组），气管内弹性蛋白酶后21天后（组C），气管内博来霉素（D组）后14天，曲霉菌感染的CFTR空小鼠（E组），1个4天LPS滴注（F组）后的12天之后。 *表示P <0.01 与对照时，＃表示P <0.01 6之间8天流感小鼠和1和4天LPS小鼠和+表示P <0.05 与对照。
图2：DFCO的雄性C57BL / 6小鼠，从2测量到6周龄（G组），该测量是在所有的小鼠中为0.4毫升充气体积制成，并且在6周龄小鼠的第二测量了。用0.8mL制成。与0.4毫升体积，有显著增加DFCO 2周雄性和那些之间的4，5，和6周（P <0.05）。
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Discussion
在目前的工作中，我们定义了一个新的指标来量化小鼠肺的气体交换能力。这个度量类似于扩散能力，临床上常见的测量，其测量肺的主要功能，也就是它的交换气体的能力。扩散能力是唯一的肺功能测量，可以在小鼠和人类可容易且快速地进行。对于肺部疾病的小鼠的检测中，一个主要的目的是量化控制和实验队列之间肺功能的变化。为了实现这一目标，我们已经定义和使用的DFCO展示quanitfying在大部分肺疾病中最常见的模型小鼠的表型变化，包括与肺发育功能改变其能力。
它简化了在小鼠中的DFCO测量一个假设中固有的做法是，未混合的吸入气体在解剖和设备死空间的效果是IGN或运算。然而，如先前所述10，使用了0.8毫升充气体积的介绍中所有的测量小而一致的错误。此误差的幅度是通货膨胀和死空间体积的相对大小的函数。另外，在本方法中，该错误是通过消除在旋塞或T-连接器的死区最小化，并且如图中视频，只需使用一个指尖来密封注射器和促进气体转移。这个过程会导致测量之间的高重复性。在年轻小鼠中所要求的更小的膨胀体积的效果清楚，在图2中，其中初始0.4毫升试验之后，随即用0.8毫升测试在每个小鼠中所示6周龄的小鼠。用0.8mL在DFCO值是为C57BL / 6小鼠中的其它基团的范围内，但是测量用0.4ml是一致较小。这是一个事实的直接表现，与较小的体积，所述recovereD 9秒样品具有死空间的空气，这只是由控制气体浓度的较大部分。这一事实本身表现为较小的相对变化中的CO浓度，从而使之更接近于在氖浓度的变化。用CO /氖的增加的比率，计算出的DFCO（1 - 这比）是这样小。
在肺病理学的很多车型如图1所示，有在DFCO观察显著下降。但是，也有几种不同的原因DFCO在这些不同的模式而减小。在所造成的博莱霉素的单剂量纤维化，有炎症和扩散屏障，导致减少在漫射能力16的增厚。在肺气肿，有表面积的损失直接作用以降低两者的表面面积扩散，并且曾经在销毁壁中毛细血管的血液量。与elastas无剂量 - 反应关系e被这里介绍的，但尚未发表的数据显示DFCO的良好的相关性与肺气肿的损害程度。与流感病毒感染，有降低弥散能力可能作为扩散阻挡的两个增厚和增加肺的合并不通风的区域的结果。在这里使用的PR8流感模型中，这恶化随着时间的推移（如反映在第8天在DFCO进一步显著减少），并且小鼠通常模具在约10天在CFTR无效小鼠，有一个较小的DFCO在基线，但这些小鼠在混合遗传背景17发，因此有可能与C57BL6控制结构上的差异。但是，曲霉菌感染引起DFCO一个较大幅度的显著降低，原因下降与真菌感染有可能类似于与流感。在LPS导致急性炎症，导致一个显著下降DFCO，可能从迪的水肿增厚奔放障碍，肺充满液体不通风的区域。与LPS的使用剂量，在DFCO下降的幅度最大，在4天或5，然后恢复回由10天对照（数据未示出）。
对于肺癌的生长在年轻小鼠变化DFCO的分析，0.4毫升充气体积明确允许重复的测量，并能够显示出缓慢增加弥散能力作为肺达到成人成熟（ 图2）。在降低所计算的DFCO使用较小0.4毫升通货膨胀体积的效果也是所预期的，但较大的0.8毫升体积不能在更小的小鼠使用。但随着开发或病理改变仍然应该重复检测，甚至用0.4毫升音量。
总之，这个视频和伴随手稿显示如何获得功能测定在小鼠中是类似于什么可以在人体中进行测量。该指标反映了一个肺的相容性，以与各种引起的最常研究的病理学的肺结构变化交换气体。这一氧化碳（DFCO）扩散的因素是高度重复性好，灵敏度足以侦测与年轻或年老老鼠最实验性病理功能和结构的改变。事实上，它是直接类似于在人类中评估肺部疾病作出类似的测量，使得它以简单的方式来获得，以phenytype小鼠肺病理学非常相关度量。
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Disclosures
的兴趣，并没有什么不冲突透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
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