Abstract
Musen er nå den primære dyr brukes til å modellere et utvalg av lungesykdommer. Å studere mekanismene som ligger bak slike sykdommer, er fenotypiske metoder nødvendig som kan kvantifisere patologiske endringer. Videre, for å tilveiebringe translasjonell relevans i forhold til musemodeller, bør slike målinger være tester som lett kan bli gjort i både mennesker og mus. Dessverre, i den foreliggende litteratur noen fenotypiske måling av lungefunksjon har direkte applikasjon til mennesker. Et unntak er diffuserende kapasitet for karbonmonoksyd, som er en måling som er rutinemessig utført i mennesker. I denne rapporten beskriver vi et middel for å raskt og enkelt måle dette spredende kapasitet hos mus. Fremgangsmåten innebærer kort lungeinnblåsning med sporstoffgasser i en bedøvet mus, etterfulgt av en 1 min gassanalysetiden. Vi har testet evnen av denne metoden for å påvise flere lunge patologier, inkludert emfysem, fibrose, akutt lungeskade, og influensa ogsopplungeinfeksjoner, samt overvåking lungemodning hos unge valper. Resultatene viser en signifikant reduksjon i alle lunge patologier, så vel som en økning av det diffuserende kapasitet lunge modning. Denne måling av lunge spre kapasitet gir dermed en lungefunksjonstest som har bred anvendelse med sin evne til å oppdage fenotypiske strukturelle endringer med de fleste av de eksisterende patologiske lunge-modeller.
Introduction
Musen er nå den primære dyr brukes til å modellere et utvalg av lungesykdommer. Å studere mekanismene som underly slike sykdommer, er fenotypiske metoder nødvendig som kan kvantifisere det de patologiske forandringer. Selv om det er mange mus studier hvor ventilasjons mekanikk måles, disse målingene er generelt relatert til standard vurdering av lungefunksjon normalt gjort hos mennesker. Dette er uheldig, siden evnen til å utføre tilsvarende målinger i mus og humane individer kan lette translasjon av resultatene i musemodeller til human sykdom.
En av de mest vanlige og lett gjort målinger i humane individer er det diffuserende kapasitet for karbonmonoksyd (DLCO) 1,2, men denne måling har kun sjelden vært gjort i musemodeller. I de studiene der det har blitt rapportert 3-7, har det ikke vært noen oppfølgingsstudier, delvis fordi prosedyrene er ofte tungvint eller kan require komplisert utstyr. En annen tilnærming er å bruke en CO rebreathing fremgangsmåte i en stabil tilstand system, som har fordelen av å være i stand til å måle CO diffusjon i bevisste mus. Men denne metoden er svært tungvint, og resultatene kan variere med nivået på musens ventilasjon samt O 2 og CO to konsentrasjoner 8,9. Disse vanskeligheter synes å ha utelukket rutinemessig bruk av diffuserende kapasitet til å detektere lunge patologier hos mus, til tross for sine mange fordeler.
For å omgå problemene med måling av spre kapasitet hos mus, til detaljer om en enkel måte å måle det på mus har nylig blitt rapportert 10. Fremgangsmåten eliminerer vanskelige problemet med prøvetaking ukontaminert alveolar gass ved hurtig sampling et volum lik hele inspirert gass. Denne fremgangsmåten resulterer i en meget reproduserbar måling, betegnet diffusjon faktor for karbonmonoksyd (DFCO), som er følsom for en rekke pathologic forandringer i lunge fenotype. Den DFCO blir således beregnet som 1 - (CO 9 / CO-c) / (Ne 9 / Ne c), hvor c og 9 indekser henviser til konsentrasjoner av kalibreringsgassene injiseres og gassene som fjernes etter en 9 sek pust holdetiden henholdsvis. DFCO er en dimensjonsløs variabel, som varierer mellom 0 og 1, med en reflekterende fullstendige opptak av all CO og 0-gjenspeiler ikke opptaket av CO.
I denne presentasjonen viser vi hvordan du gjør dette spre måling kapasitet, og hvordan den kan brukes til å dokumentere endringer i nesten alle de eksisterende mus lungesykdom modeller, inkludert emfysem, fibrose, akutt lungeskade, og virus- og soppinfeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle dyre protokollene ble godkjent av Johns Hopkins University Animal Care og bruk komité.
1. Animal Forberedelse
- Forbered 6 C57BL / 6 kontrollmus for DFCO måling, ved bedøvelse dem med ketamin og xylazin som beskrevet i trinn 2.3 nedenfor.
- Forbered alle de andre mus med de forskjellige lunge- sykdommer som er vist i tabell 1 ved hjelp av samme prosedyre som for kontrollene. Spesifikke detaljer som trengs for å etablere hver av disse modellene er funnet i de relevante referanser. Kontrollmus og de i de andre patologiske kohorter er alle 6-12 ukers alder.
2. Måling av Diffusion Factor for karbonmonoksid (DFCO)
- Sett opp gasskromatograf modulen som fulgte med maskinen for å måle topper for nitrogen, oksygen, neon, og karbonmonoksid. For denne søknaden bruk bare neon og CO data.
MERK: Dette instrumentet bruker en molekylær sieve kolonne med helium som bærergass, med en 12,00 um film, 320,00 um-ID og 10 m lengde. Kromatografens kolonne har et volum på 0,8 ml, men vi brukte 2 ml for å sikre tilfredsstillende rydding av forbindelsesrøret med prøven. - Ved starten av hver forsøks dag, før å gjøre målinger av prøvene fra musene, ta en 2 ml prøve direkte fra en gassblanding pose inneholdende ca. 0,5% Ne, 0,5% CO, og balansere luften, og bruke denne prøven for å kalibrere gasskromatografen.
- Bedøve mus med ketamin (90 mg / kg) og xylazin (15 mg / kg), og bekrefter anestesi ved fravær av refleksbevegelse. Påfør veterinær salve på øynene for å forhindre tørrhet. Tracheostomize musene med en stump nål kanyle (18 G hos voksne eller 20 G i svært ung mus).
MERK: DFCO er ferdig i mindre enn 10 min etter anestesi og før noen mekanisk avtrekk eller andre prosedyrer. - Hos mus større enn 6 ukers alder, bruk en 3 ml sprøyte to ta ut 0,8 ml av gass fra gassblandingen posen. Koble sprøyten til trakealkanyle og raskt blåses lungen. Ved hjelp av en metronom, telle 9 sek, og deretter raskt trekke 0,8 ml (utåndet luft).
- Fortynne dette trukket tilbake 0,8 ml utåndet luft til 2 ml med romluft, la den hvile i minst 15 sek. Deretter injiserer hele prøven inn i gasskromatograf for analyse.
- Selv om analyse av denne første DFCO prøven, blåses muselunge med en andre 0,8 ml fra gassblandingen posen, og deretter behandle denne prøven er identisk med den første prøven. Gjennomsnitt de to DFCO målinger.
MERK: For målinger i mus så unge som to ukers alder, bruke et volum på 0,4 ml, siden 0,8 ml er for stort volum for å gjøre målinger i lungene av svært små mus. Det er bedre å bruke 0,8 ml volum for mus større enn 6 uker, og at hvis 0,4 ml volum som er nødvendig for enkelte mus, bør det benyttes gjennomgående for alle mus i kullet blir undersøkt. - Beregne DFCOsom 1 - (CO 9 / CO-c) / (Ne 9 / Ne c), hvor c og 9 indekser henviser til konsentrasjoner av kalibreringsgassene injiseres og gassene som fjernes etter en 9 sek pust holdetid, respektivt.
- Analysere og sammenligne forskjeller med en enveis ANOVA og vurdere hvilken betydning nivå med Tukey korreksjon for multiple sammenligninger i alle cohort mus. Tenk p <0,05 som betydelig verdi.
MERK: Alle mus brukt her var en del av eksperimentelle studier som involverer flere senere målinger av lungeventilasjon, mekanikk, lunge kylling, eller histologi, som ikke rapporteres her. I tillegg, siden fremgangsmåten er den samme i alle de eksperimentelle modellene som ble gjort ovenfor i kontrollmusene, er bare resultatene fra de forskjellige patologiske modeller presentert. Ytterligere informasjon om disse modellene er presentert i den supplerende tabellen. - Avlive dyrene ved dyp anesthetic overdose etterfulgt av cervical forvridning eller halshogging. Der hvor det er nødvendig, fjerner lungeceller og / eller vev fra de døde mus for videre biologisk eller histologisk bearbeiding og analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser DFCO målinger fra de voksne mus i gruppe A, B, C, D, E og F. Det var betydelig nedgang med både Aspergillus og influensa infeksjoner, samt en betydelig nedgang i fibrotisk, emphysematous, og akutt lungeskade modeller. Figur 2 viser den gruppa utviklings endringer i DFCO over tid som musene alder fra 2-6 uker. Det var en liten, men signifikant økning med lunge utvikling over denne gangen kurset. Effekten av å bruke et mindre inflasjon volum var også ganske tydelig ved 6 ukers tidspunktet. Det var en tendens til at kvinner å ha en litt høyere DFCO, men dette var bare signifikant på 5 ukers tidspunkt.
| Gruppe | Patologi eller tilstand | Kommentarer |
| A | C57BL / 6 kontroller (8-10 uker), n = 6 | Sunne mus </ Td> |
| B | C57BL / 6-mus gitt 25 TCID50 av influensa A virus (PR8) intranasalt, n = 10 | Influensa-modell, studert 6, og 8 dager etter infeksjon |
| C | C57BL / 6-mus fikk 5,4 U pankreatisk elastase intratrakealt, n = 6 | Emfysem modell 10,13 studert 21 dager etter elastase utfordring |
| D | C57BL / 6-mus fikk 0,05 U bleomycin intratrakealt, n = 6 | Fibrose modell 14 studerte 14 dager etter bleomycin utfordring |
| E | CFTR null kontroller og de som blir smittet med aerosol innånding av Aspergillus fumigatus (stamme AF293), n = 6 | Soppinfeksjon modell 11,17 studert 12 dager etter soppinfeksjon |
| F | C57BL / 6-mus som fikk 3 mg / g BW LPS (Escherichia coli) intratrakealt, n = 6 | Akutt lungeskade (ALI) modell 15 studertepå dag 1 og 4 etter LPS fornærmelse |
| G | C57BL / 6 hannmus på 2 til 6 ukers alder, n = 5 i hver alders | Lunge utviklingsmodell |
Tabell 1: Oversikt over de ulike musemodeller der DFCO ble målt.
Fig. 1: Måling av DFCO i kontroll C57BL / 6-mus (gruppe A), og i hver av de fem forskjellige patologiske modeller Vist er resultatene 6 og 8 dager etter PR8 influensa (Gruppe B), 21 dager etter intratrakeal elastase (Gruppe C) og 14 dager etter intratrakeal bleomycin (gruppe D), 12 dager etter Aspergillus-infeksjon i CFTR-null-mus (gruppe E), og 1 og 4 dager etter LPS instillasjon (gruppe F). Den * indikerer p <0,01 vs. kontroll, # indikerer P <0,01 mellom 6 og8 dagers influensa mus og de 1 og 4 dagers LPS mus, og den indikerer + P <0,05 sammenlignet med kontroll.
Figur 2: Måling av DFCO i hann C57BL / 6 mus fra 2 til 6 uker gamle (gruppe G) Målingene ble foretatt i alle mus med en inflasjonsvolum på 0,4 ml, og i 6 uker gamle mus en andre måling var. laget med 0,8 ml. Med 0.4 ml volum, var det en signifikant økning i DFCO mellom to ukers mannlige og de ved 4, 5 og 6 uker (p <0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det foreliggende arbeid, definert vi en ny beregning for å kvantifisere gass utveksling evne til mus lungen. Denne beregningen er analog med den diffuserende kapasitet, et vanlig klinisk måling som måler den primære funksjon av lungen, det vil si dets evne til å utveksle gassen. Den diffuserende kapasitet er den eneste lunge funksjonell måling som lett og raskt utført i både mus og mennesker. For detektering av lungesykdom hos mus, er et vesentlig mål for kvantifisering av endringer i lungefunksjonen mellom kontrollen og eksperimentelle kullene. For å oppnå dette målet, har vi definert og utnyttet DFCO å demonstrere sin evne til quanitfying fenotypiske endringer i de fleste av de vanligste modellene av lungesykdom hos mus, inkludert funksjonelle endringer med lunge utvikling.
En antagelse iboende i tilnærmingen som forenkler DFCO måling i mus er at effekten av ublandet inspirert gass i anatomiske og utstyr dead space er IGNELLER-behandlet. Imidlertid, som tidligere beskrevet, 10, innfører en liten, men konsistent feil i alle målingene ved bruk av 0,8 ml inflasjon volum. Størrelsen av denne feilen er en funksjon av de relative størrelser av oppblåsing og dødrom volumer. I den foreliggende metode, er denne feilen reduseres til et minimum ved å eliminere dødrom i stoppekraner eller T-kontakter, og som vist i videoen, bruker bare en fingertupp for å forsegle sprøyten og lette gassoverføring. Denne fremgangsmåten resulterer i en høy repeterbarhet mellom målingene. Virkningen av den mindre inflasjon volum som kreves i den unge mus er gjort klart i 6 uker gamle mus vist i figur 2, der den første 0,4 ml prøve ble umiddelbart etterfulgt med en 0,8 ml prøve i hver mus. Med 0,8 ml av DFCO verdi lå i området for C57BL / 6 mus i de andre gruppene, men målingen med 0,4 ml er gjennomgående mindre. Dette er et direkte uttrykk for det faktum at med mindre volum, jo recovered 9 sek prøven har en større fraksjon av det dødrom luft, som bare består av gasskonsentrasjoner kontroll. Dette faktum gjør seg gjeldende som en mindre fraksjonert endring i CO-konsentrasjonen, noe som bringer den nærmere endringen i Ne konsentrasjon. Med økt ratio av CO / Ne, den beregnede DFCO (1 - dette forholdet) er dermed mindre.
I de mange modeller av lungepatologi som er vist i figur 1, var det en betydelig nedgang observert i DFCO. Imidlertid er det flere forskjellige grunner til at DFCO avtar i disse forskjellige modeller. I fibrose forårsaket av enkelt dose av bleomycin, er det betennelse og en fortykning av diffusjonssperren som fører til en reduksjon i kapasiteten 16 diffuserende. I emfysem, er det et tap av overflateareal virker direkte til å redusere både den overflateareal for diffusjon og volumet blod i kapillærene som hadde vært i de ødelagte vegger. Ingen dose-respons relasjoner med de elastase er presentert her, men upubliserte data viser en god korrelasjon av DFCO med nivået på emphysematous skade. Med influensainfeksjon, er det redusert diffuserende kapasitet sannsynligvis som et resultat av både en fortykkelse av diffusjonsbarrieren og en økning i konsoliderte uventilerte områder av lungen. I pr8 influensa modellen som brukes her, forverrer dette over tid (som gjenspeiles i den videre betydelig reduksjon i DFCO på dag 8), og musene generelt dø på rundt dag 10. I CFTR null mus, var det en mindre DFCO ved baseline , men disse musene er laget på en blandet genetisk bakgrunn 17, så det kan være strukturelle forskjeller med C57BL6 kontroller. Men den Aspergillus infeksjon forårsaket en mer betydelig betydelig reduksjon i DFCO, og årsaker til denne nedgangen med soppinfeksjon er sannsynlig lik de med influensa. LPS resulterer i akutt betennelse som forårsaker en betydelig redusert DFCO, sannsynligvis fra edematous fortykkelse av diffusion barriere og uventilerte områder av lungen som er fylt med væske. Med dose av LPS anvendt, er den reduksjon i DFCO størst på dag 4 eller 5, og deretter gjen tilbake til kontroll ved dag 10 (data ikke vist).
For analyse av endringer i DFCO med lunge vekst i de unge mus, 0,4 ml inflasjon volum klart tillatt reproduserbare målinger, og var i stand til å vise en langsom økning i å spre kapasitet som lunge nådd voksen modenhet (figur 2). Effekten av å bruke en mindre 0,4 ml inflasjon volum i nedad den beregnede DFCO er også det som var ventet, men den større 0,8 ml volum, kan ikke brukes i de mindre mus. Men endringer med utvikling eller patologi bør fortsatt være reproduserbart påviselig selv med 0,4 ml volum.
I konklusjonen, denne videoen og tilhørende manuskript viser hvordan å få en funksjonell måling i mus som ligner på det som kan måles hos mennesker. Det metriske reflekterer enbilitet i lungene til å utveksle gasser med en rekke lunge strukturelle endringer som forårsakes av de mest studerte patologier. Dette diffusjon faktor for karbonmonoksid (DFCO) er svært reproduserbare, og sensitive nok til å oppdage funksjonelle og strukturelle endringer med mest eksperimentelt indusert patologi hos unge eller gamle mus. Det faktum at det er mange paralleller til lignende målinger gjort i mennesker for å vurdere lungesykdom, gjør det en enkel måte å få et meget relevant metriske å phenytype muselunge patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter, og ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas Chromatograph | Inficon | Micro GC Model 3000A | Agilent makes a comparable model |
| 18 G Luer stub needle | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| 3 ml plastic syringe | Becton Dickenson | Several other possible vendors | |
| Polypropylene gas sample bags | SKC | 1 or 2 L capacity works well | Other gas tight bags will work well |
| Gas tank, 0.3% Ne, 0.3% CO, balance air; (size ME) | Airgas, Inc | Z04 NI785ME3012 | This is the standard mixture used for DLCO in humans |
| 25 TCID50/mouse of influenza virus A/PR8 diluted in phosphate buffered saline. | |||
| Porcine pancreatic elastase | Elastin Products, Owensville, MO | 5.4 U | |
| Bleomycin | APP Pharmaceuticals, Schaumburg, IL | 0.25 U | |
| Escherichia coli LPS | Sigma L2880 | 3 μg/g body weight; O55:B5 | |
| Aspergillus fumigatus (isolate Af293) conidia were collected from mature colonies grown on potato dextrose agar. |
References
- Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).
- Miller, A., Warshaw, R., Nezamis, J. Diffusing capacity and forced vital capacity in 5,003 asbestos-exposed workers: Relationships to interstitial fibrosis (ILO profusion score) and pleural thickening. Am J Ind Med. 56 (12), 1383-1393 (2013).
- Enelow, R. I., et al. Structural and functional consequences of alveolar cell recognition by CD8(+) T lymphocytes in experimental lung disease. J Clin Invest. 102 (9), 1653-1661 (1998).
- Hartsfield, C. L., Lipke, D., Lai, Y. L., Cohen, D. A., Gillespie, M. N. Pulmonary mechanical and immunologic dysfunction in a murine model of AIDS. Am J Physiol. 272 (4 Pt 1), 699-706 (1997).
- Wegner, C. D., et al. Intercellular adhesion molecule-1 contributes to pulmonary oxygen toxicity in mice: role of leukocytes revised. Lung. 170 (5), 267-279 (1992).
- Reinhard, C., et al.
- Sabo, J. P., Kimmel, E. C., Diamond, L. Effects of the Clara cell toxin, 4-ipomeanol, on pulmonary function in rats. J Appl Physiol. 54 (2), 337-344 (1983).
- Depledge, M. H. Respiration and lung function in the mouse, Mus musculus (with a note on mass exponents and respiratory variables). Respir Physiol. 60 (1), 83-94 (1985).
- Depledge, M. H., Collis, C. H., Barrett, A. A technique for measuring carbon monoxide uptake in mice. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 7 (4), 485-489 (1981).
- Fallica, J., Das, S., Horton, M. R., Mitzner, W. Application of Carbon Monoxide Diffusing Capacity in the Mouse Lung. J Appl Physiol. 110 (5), 1455-1459 (2011).
- Chaudhary, N., Datta, K., Askin, F. B., Staab, J. F., Marr, K. A. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator regulates epithelial cell response to Aspergillus and resultant pulmonary inflammation. Am J Respir Crit Care Med. 185 (3), 301-310 (2012).
- Foster, W. M., Walters, D. M., Longphre, M., Macri, K., Miller, L. M. Methodology for the measurement of mucociliary function in the mouse by scintigraphy. J Appl Physiol. 90 (3), 1111-1117 (2001).
- Yildirim, A. O., et al. Palifermin induces alveolar maintenance programs in emphysematous mice. Am J Respir Crit Care Med. 181 (7), 705-717 (2010).
- Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis. PLoS One. 7 (2), e31299 (2012).
- Alessio, F. R., et al. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).
- Martinez, F. J., et al. The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).
- Zhou, L., et al. Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR. Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).
