Introduction
En uundgåelig konsekvens af at blive gammel er den faldende evne af væv og organer til at forblive funktionelle. Voksne stamceller er afgørende for at opretholde vævshomeostase og organ funktionalitet, men som organismer alder, stamcellerne også opleve et fald i deres biologiske adfærd. Dette er særligt skadelig for væv, som har en høj omsætningshastighed, såsom tarmepitelet. Kendetegnende for alderen stamceller omfatter genomisk skader, nedsat reparationsmekanismer, nedsat cellecyklusregulering og misregulated signalveje, som alle påvirker normal stamcelle adfærd (revideret i 1-3). Ved at manipulere specifikke signalveje eller vælte specifikke gener, har vi fået indblik i deres roller i reguleringen og opretholde normal stamcelle adfærd. Da de fleste af disse forsøg er kandidatmolekylet fremgangsmåder, vi har meget lidt viden om de endogene molekylære forandringer, der sker i stamceller underaldring. En måde at gribe dette spørgsmål er at sammenligne transkriptomet af unge versus gamle stamceller til at identificere molekyler, hvis ekspressionsprofil ændrer væsentligt under ældning. Desværre har biologiske og tekniske udfordringer hæmmet vores fremskridt med hensyn til denne fremgangsmåde hidtil.
Drosophila melanogaster er meget velegnet model organisme for at studere aldring, da det har en kort levetid (ca. 60-70 dage) og udviser aldrende fænotyper (gennemgået i 4). Desuden kan ældningsprocessen i Drosophila accelereres ved temperaturen. Når holde fluerne ved 29 ° C, kan allerede iagttages en gammel fænotype i tarmvævet efter 15 dage 5. Endvidere Drosophila er modtagelig for en overflod af genetiske manipulationer. Navnlig har Drosophila mellemtarmen opstået som en fremragende model til undersøgelse af indflydelsen af forskellige signalveje og miljømæssige udfordringerbiologi intestinale stamceller (HTT) under aldring (revideret i 6-10). Den Drosophila tarmepitelet har en høj omsætningshastighed og fornyes hver anden uge hos kvinder og cirka en gang om måneden hos mænd 11. Individuelle servicekontrakter med bopæl i Drosophila mellemtarmen har kapacitet til at dele sig og producere en selvstændig fornyet ISC og en post-mitotisk progenitorcelle kaldet enteroblast (EB) 12,13. EB differentierer til enten en absorberende enterocytterne eller en sekretorisk enteroendokrin celle. Til denne dato, er den eneste markør kombination, der utvetydigt mærker en ISC er udtryk for transkriptionsfaktoren escargot (ESG) og Notch ligand Delta (DL) 14. Men dette kun gælder for en ung og sund tarm. Under ældning er mellemtarmen epitel kendetegnet ved en stigning i ISC proliferation 15-17. Derudover afvigende Notch signalering forstyrrer skæbne afgørelse af ISC dattercellerog inducerer misdifferentiation EBS 15. Dette resulterer i en ophobning af celler, der er aktive for Notch signalering og co-express ESG og Dl, hvorved Dl ekspression utilstrækkelig til at identificere bona fide stamceller i en gammel mellemtarmen. Vanskeligheden ved at identificere sande individuelle servicekontrakter har hindret mulighed for at undersøge endogene ændringer i aldrende individuelle servicekontrakter indtil nu.
Vi har behandlet dette spørgsmål ved at drage fordel af ESG -Gal4, UAS-GFP transgene fluelinen, hvor niveauet af GFP-ekspression i individuelle servicekontrakter og EBS er i sagens natur anderledes og forbliver anderledes i hele aldring. En lignende fremgangsmåde er blevet beskrevet til isolering af larver neuroblaster og neuroner 18,19. Midguts af unge og gamle ESG -Gal4, UAS-GFP fluer blev dissekeret og dissocieret i enkeltceller. Cellerne blev derefter sorteret for GFP-positive celler under anvendelse af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Interessant sorteret GFP-positive calen fordelt i to adskilte toppe baseret på GFP-fluorescens intensitet (GFP høj og GFP lav). Desuden er fordelingen af GFP-positive celler i de to toppe også korreleret med cellestørrelse: de celler, der udviste lav GFP intensitet var små og mindre kornet hvorimod celler med høj GFP intensitet var større og mere detaljeret. Denne observation tydede på, at de mindre individuelle servicekontrakter kunne skelnes fra de større EB'er hjælp af FACS baseret på GFP intensitet og vælge passende forward scatter (FSC) og sidespredning (SSC) indstillinger. Interessant nok forblev de to toppe tydeligt adskilt under aldring. Endvidere er forholdet mellem de to toppe ændret på en måde, der afspejler de førnævnte kendetegnende aldrende midguts: nemlig at antallet af store, misdifferentiated EBS stiger over tid. Fra disse resultater konkluderer vi, at ved at sortere for GFP-positive celler under anvendelse af de passende FACS parameterindstillinger kan vi berige for ISC og EB'er på noget tidspunkt dnder aldring.
Sammenfattende indfører vi en FACS strategi, der gør det muligt for forskerne at berige for to forskellige cellepopulationer, individuelle servicekontrakter og EBS fra Drosophila midguts i alle aldre og isolere disse celler til yderligere analyse, såsom næste generation sekventering. Denne kraftfulde metode giver mulighed for at studere de endogene molekylære mekanismer, der er uløseligt forbundet med befolkningens aldring i en beriget population af stamceller eller stamceller. De opnåede data fra disse undersøgelser vil uden tvivl gøre det lettere at identificere konserverede molekyler, der er væsentlige i aldring på tværs af arter.
Protocol
BEMÆRK: Hvis denne protokol bruges for første gang at isolere individuelle servicekontrakter med FAC sortering følgende kontroller er obligatoriske for at oprindeligt indstille FACS parametre korrekt: dissocierede celler fra vildtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts uden Sytox. Dissocierede celler fra vildtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts med Sytox (se trin 3.6). Dissocierede celler fra midguts af ESG -Gal4, UAS-GFP fluelinen uden Sytox.
1. Fremstilling af løsninger og retter til Gut Dissection
- Forbered 4-6 hætteglas indeholdende 40 kvindelige flyver fra ESG -Gal4, UAS-GFP fluelinen.
- Fra et 10x PBS stamopløsning forberede 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH 2 PO 4 · H2O, 8,4 mM Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 175 mM NaCl, justere pH til 7,4).
- Forbered en 3,5% Agaroseopløsning i 1X PBS (3,5 g elektroforese klasse agarose i 100 ml 1x PBS). Forbered dissektion plader ved at hælde denne opløsning i petriskåle (diameter 8,5 cm) til at dække bunden. Det agarose lag forhindrer skade spidserne af tang under dissektion procedure. Efter gelen er størknet gemme dissektion pladerne ved 4 ° C.
- Forbered 300 ml 1x PBS + 1% BSA frisk før dissekering og placere flasken på is eller ved 4 ° C.
- Tænd centrifuge og lad den køle til 4 ° C.
- Flamme tips af 2 glas Pasteur-pipetter at udjævne kanterne.
- Rene to par tænger og et barberblad med 70% ethanol.
- Placer 4-6 1,5 ml mikrocentrifugerør til indsamling dissekerede midguts på is.
2. Fremstilling af mavetarmkanalen og Dissektion af mellemtarmen
- Bedøver fluer fra et hætteglas (40 fluer) med CO 2 på en standard flue seng, halshugge alleflyver ved hjælp af et barberblad og overføre dem til dissektion fad. Hæld kold 1x PBS / 1% BSA løsning i dissektion fad til at dække agarosegelen. De fluer vil flyde.
- Grab flyve maven med et par pincet, mens du holder brystkassen med det andet par pincet. Adskil thorax fra maven. Tarmen bliver synlig, og fortarm / afgrøde vil sandsynligvis stadig være forbundet til thorax.
- Grib tarmen og træk den ud af brystkassen. For at udfolde tarmen, tag fat i afgrøden og træk tarmen lidt fortil væk fra maven.
- Tag den bageste ende af maven med en tang og kanten af den fortil åben kutikula med det andet par af pincet. Pas på ikke at ødelægge den fremspringende tarm væv. Træk bageste ende væk for at bryde kutikula og fortsætte med at trække bagtil meget forsigtigt, indtil hele tarmen er blevet trukket ud af bughulen. Afgrøden kan skal fjernes på forhånd, hvis det er for stort til at passegennem kroppen hulrum.
- Fjern fortarm, Malpighian tubuli, stortarmen og æggestokke forlader nøgne mellemtarmen.
- Ved hjælp af et glas Pasteur pipette det parti dissekerede midguts til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende kold 1x PBS / 1% BSA løsning og holde røret på is. Prøverne skal behandles inden 2 timer.
- Efter dissektion af en hele partiet er færdig, skylles dissektion skål med dobbelt destilleret vand til at vaske tilovers vragrester. Start dissekere den næste batch af midguts (Gentag trin 2,1-2,7). Dissekere så mange partier som muligt inden 2 timer, derefter fortsætte til trin 3.1.
3. fordøjelse af Gut Tissue at høste celler til FAC Sortering
- Fjern 1x PBS / 1% BSA-opløsning fra midguts og tilsæt 500 pi 0,5% trypsin-EDTA-opløsning til hver prøve.
- Vortex godt i 20 sekunder og inkuber prøverne ved forsigtig rocking / roterer ved 20 rpm ved stuetemperatur i 25-30 min.
- Vortex igen efter ca. 30 min og lad den intakte mellemtarmen væv synker til bunden af røret. Fjern forsigtigt celler, der er i suspension med en Flammet glas Pasteur-pipette og filtrere dem gennem et 35 um nylon mesh i et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Spin cellerne ned ved 100 x g i 5 min ved 4 ° C. Notatet, når du starter fordøjelsen, en cellepellet måske ikke være synlige i starten, men bliver synlig som vævet fordøje skrider frem.
- Overføre forsigtigt trypsinopløsning tilbage til den oprindelige prøveglas indeholdende resterende intakt mellemtarmen væv. Undgå at overføre for mange celler fra pelleten.
- Forsigtigt genopslæmmes cellepelleten i 400 pi kold 1x PBS / 1% BSA. Hold mikrocentrifugerør indeholdende de dissocierede celler på is og dækker rørene med aluminiumfolie for at beskytte cellerne mod lys.
- Vortex trypsin opløsning indeholdende det resterende intakte mellemtarmen væv igen og placere prøvernepå rocker i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur.
- Gentag trin 3.3 til 3.4.3, indtil alle mellemtarmen væv er blevet fordøjet. Kombiner de dissocierede celler fra alle mikrocentrifugerør i en mikrocentrifugerør. Dette kan kræve centrifugering som i 3.4, da omfanget af alle celleopslæmninger tilsammen kan overstige 1,5 ml. Hold cellesuspensionen på is og beskytter cellerne mod lys.
- Spin de dissocierede celler ned ved 100 x g i 5 min ved 4 ° C. Fjern forsigtigt så meget af supernatanten som muligt forlader ca. 50-100 pi 1X PBS / 1% BSA-opløsning i mikrocentrifugerør. Forsigtigt resuspendere dissocierede celler i 800 pi 1x PBS / 1% BSA indeholdende Sytox (1: 20.000).
- Overfør cellesuspensionen til en 5 ml rundbundet Falcon-rør ved filtrering af cellerne gennem et cellefilter snap cap (35 um nylon mesh). Hold altid celleprøver på is og beskyttet mod lys. Cellerne er nu klar tilsorteres.
- Pipette 600 pi RNAlater opløsning i hver mikrocentrifugerør, i hvilke celler vil blive sorteret til efterfølgende RNA-isolering. For andre efterfølgende anvendelser cellerne kan opsamles i en anden løsning, f.eks i sterilt PBS.
4. FAC Sortering at isolere Intestinale stamceller
- Tænd for flowcytometri instrument mindst en time før sortering. Sørg for, at fluide system er fri for luftbobler.
- Vælg 70 um dysestørrelse at injicere celler ind i hylsteret fluidstrømmen.
- Juster amplituden af kernen fluidstrømmen, således at mellemrummet værdi svarer til referenceværdien (6-7, ved brug af 70 um dyse). Lad kernen fluidstrømmen stabilisere, før du begynder at sortere.
- Følg denne ordre ved første indstilling af parametrene til sortering:
- Læg de dissocierede celler opnået fra vildtype indvolde. Først justere FSC og SSC spændingerat plotte cellerne i centrum af scatter plot. For det andet, justere FITC (GFP) spænding, således at alle celler er afbildet under 10 2 på logaritmisk x-aksen. Indstilling af FITC parameter sætter grænsen for autofluorescens.
- Læg de dissocierede celler fra vild type tarme med Sytox tilføjet. Juster Pacific Blue spændingsværdi og gate til at identificere og separate levende celler fra døde, Sytox-positive celler i Pacific Blue vs. FSC-A punktdiagram.
- Læg de dissocierede celler opnået fra ESG -Gal4, UAS-GFP fluelinen uden Sytox og juster FITC spænding til at sikre, at alle GFP-positive celler er plottet i scatter plot.
- Læg de dissocierede celler opnået fra ESG -Gal4, tilføjede UAS-GFP fluelinen med Sytox. Juster Pacific Blue spændingsværdi og gate til at identificere og separate levende celler fra døde, Sytox-positive celler (gate P1).
- Indstil SSC-A og FSC-En port til at identificere GFP-positive celler (baseret på histogrammet plot), bestemt ved størrelse og granularitet (gate P2).
- Indstil FSC-H og FSC-W port til at identificere og udelukke GFP-positive celle dubletter baseret på deres størrelse (gate P3).
- Indstil SSC-H og SSC-W port til at identificere og udelukke GFP-positive celle dubletter baseret på deres nøjagtighed (gate P4).
- Brug gate P4 at skildre de GFP-positive celler i et histogram plot, der viser antallet af celler (tæller) vs. GFP intensitet. To distinkte toppe af GFP-positive celler vil være synlige. Opret en gate for hver top (gates P5 og P6). Gate P5 indeholder cellepopulationen, der er beriget for ISC og kan sorteres separat fra cellerne i gate P6.
- Back-port i en kontur plot at kontrollere, at de to forskellige GFP-positive cellepopulationer indeholder levende celler (sammenlign med gate P1) og celler i den korrekte størrelse (sammenligne med gate P2).
- Sortere celler i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, der indeholder 600 & #181 l af RNAlater opløsning. Sorteringen sker ved en lav strømningshastighed (max. 2,0, 70 um dyse, 1000 hændelser / sek, 70 psi) og anvendelse af en to-vejs renhed slags.
- Efter sortering er færdig, straks Vortex sorterede celler kortvarigt og holder mikrocentrifugerør på is indtil videre med RNA isolering eller andre efterfølgende anvendelser.
Representative Results
For at opnå mellem 50.000-100.000 celler fra FAC sortering, mellem 160 og 200 midguts skal dissekeres. Naturligvis er dette den mest tidskrævende trin i hele proceduren. Vist i figur 1A tegneserie illustrerer de vigtigste trin i tarmen dissektion, som er beskrevet i detaljer i protokollen tilvejebragt her. Denne procedure kan individuelt ændres. En dissekeret, hele mavetarmkanalen er vist i figur 1B.
Når alle mellemtarmen væv er blevet fordøjet straks fortsætte med FAC-sortering. Efter gating strategi beskrevet i protokollen giver mulighed for vellykket identifikation og sortering af en cellepopulation beriget med ISC og EB'er fra unge (figur 2) og fra gamle midguts (Figur 3). P1 gate er indstillet til at omfatte kun raske levende celler og til at udelukke døde celler. Celler, plotte over 10 3 på den logaritmiske y-axer ved brug af Pacific Blue-kanalen er defineret som døde celler. Prikkerne at plot under 40 på x-aksen (FSC-A) er for det meste snavs, og derfor er også udelukket (figur 2A). I scatter plot af SSC-A vs. FSC-A cellerne fordeles på grundlag af deres størrelse og nøjagtighed. For en optimal opløsning cellerne placeret i scatter plot som vist i figur 2B ved at justere fotomultiplikatorrør (PMT) spænding. I scatter plots FSC-H vs. FSC-W og SSC-H versus SSC-W enkeltceller er adskilt fra aggregater og dubletter baseret på størrelse (figur 2C) og er baseret på nøjagtighed (figur 2D). Når afbilder celler indgår i gate P4 i et histogram plot, særskilte adskillelse af GFP-negative, GFP lav (gate P5) og GFP høj (gate P6) celler er synlig (figur 2E). Celler, der udviser lavere GFP intensitet er små og mindre kornet og repræsentere individuelle servicekontrakter. Celler, der udviser højere GFP intensity er større og mere detaljeret og repræsenterer EB'er. Reverse transkriptase (RT) -PCR for Dl på cDNA syntetiseret fra RNA fra celler af hver GFP-positive population (gates P5, P6) viste, at DL-signalet er faktisk stærkere i de mindre, GFP lave celler end i de større, GFP høj celler (Figur 2H). Cellerne blev derefter backgated og afbildet i kontur plots at bekræfte, at GFP lav (gate P5) og GFP høj (gate P6) celler er forskellige i størrelse og granularitet (figur 2F), og er stadig i live (figur 2G). Af note, kan de to toppe af GFP-positive celler (GFP lav og GFP høj) kun være pænt skelnes hvis FITC (GFP) kanal er kalibreret korrekt efter metoden i protokollen kontrol.
Den samme gating strategi blev anvendt ved sortering ISC afledt fra gamle indvolde (Figur 3). De scatter plots (Figure 3A-D), histogrammet (figur 3E) og kontur plots (figur 3F, G) er analoge med dem, der vises i figur 2. Som nævnt ovenfor er der ingen bona fide markør til at identificere ISC i gamle midguts og derfor ingen RT-PCR data præsenteres her. Men interessant observation er, at de to toppe, der indeholder GFP lav (gate P5) eller GFP høj (gate P6) celler forbliver tydeligt adskilt under ældning. Desuden er antallet af celler i GFP høj (gate P6) peak stiger betydeligt under ældning, hvilket klart emulerer den kendte akkumulering af misdifferentiated EB'er med alderen. Ændringen i forholdet mellem de to cellepopulationer kan også ses i scatter plots (sammenlign figur 3A-D med figur 2A-D) og i kontur plots (sammenlign figur 3F, G med figur 2F, G). Ud fra disse resultater konkluderer vi, at ved at sortere for GFP-positive celler ved anvendelse FACS vi kan berige for individuelle servicekontrakter og EB'er i unge og gamle midguts.
For at validere renheden af det isolerede ISC og EBS var en slags analyse stilling udføres (figur 4). De histogram plots af den post-sorteres individuelle servicekontrakter og EBS (figur 4B, C) skildrer renheder mellem 95% og 98%.
Hvis hierarki indstilling af FACS parametre som beskrevet ovenfor nøje følges, kan allerede skelnes de to forskellige cellepopulationer (GFP lav, små og GFP høj, større) i et punktdiagram GFP vs. FSC-A (figur 5A). Disse to cellepopulationer kan ikke skelnes hvis dette hierarki ses bort (figur 5B-D).
Figur 1: (A) en skematisk afbildning af de vigtigste trin i thesecting fluen tarmen. Først hovedet fjernes (fjernelse af vingerne er valgfrit) efterfulgt af en adskillelse af thorax og abdomen at eksponere tarmen. Tarmen efterfølgende frigjort fra kroppen hulrum i de følgende trin. De sorte pile viser progressionen af dissektion, mens de mørke røde pile angiver trækretningen. De røde linier i det sidste billede angiver anteriore og posteriore grænser mellemtarmen. (B) et lysmikroskop billede af den voksne flue tarmen. De vigtigste regioner og anatomiske træk er mærket. Røde linjer markerer grænserne for mellemtarmen.
Figur 2:. FAC sortering strategi til at identificere og isolere individuelle servicekontrakter og EB'er fra unge (7 dage) midguts For bedre visualisering, celler, der repræsenterer individuelle servicekontrakter er fremhævet med rødt, og celler, der repræsenterer EB'er er fremhævetmed blåt i scatter plots (AD) og i kontur plots (F, G). (A) P1 gate er indstillet til at udelukke døde, Sytox-positive celler plottet over 10 3 på den logaritmiske y-aksen. Tærsklen på FSC-A er fastsat til 40 til også at udelukke døde celler og debris. (B) Celler blev gated for FSC-A og SSC-A for at vælge celler, efter størrelse og granularitet (gate P2). Histogrammet plot (E) blev anvendt parallelt at identificere GFP-positive celler i FSC-A versus SSC-A punktdiagram (B). (C, D) scatter plots FSC-H vs. FSC-W og SSC-H versus SSC-W tjener til at fjerne aggregater og dubletter og selektere for singletter (gate P3 i C og gate P4 i D). (E) Histogrammet plot viser antallet af celler og deres GFP intensitet. Kan skelnes. (F, G) Celler blev back-gated i en kontur plot at kontrollere, at de to særskilte GFP-positive celle populat to toppe, GFP lav (gate P5) og GFP høj (gate P6)ioner af den korrekte størrelse (F), og som indeholder levende celler (G). (H) revers transkriptase (RT) -PCR for Dl på cDNA syntetiseret fra RNA isoleret fra cellerne til stede i den første top (gate P5) og i anden top (gate P6) hhv. Mere Dl-ekspression kunne påvises i celler til stede i porten P5 vs. gate P6. Tubulin tjente som lastning kontrol. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: FAC sortering strategi til at identificere og isolere individuelle servicekontrakter og EB'er fra gamle (60 dage) midguts For bedre visualisering, celler, der repræsenterer individuelle servicekontrakter er fremhævet med rødt, og celler, der repræsenterer EB'er er fremhævet med blåt i scatter plots (AD) og i. kontur plots (F, G). (A) P1 gate er indstillet til at udelukke døde, Sytox-positive celler plottet over 10 3 på den logaritmiske y-aksen. Tærsklen på FSC-A er fastsat til 40 til også at udelukke døde celler og debris. Notatet, alder-afhængig stigning i større GFP-positive celler er allerede tydelig i dette plot. (B) Celler blev gated for FSC-A og SSC-A for at vælge celler, efter størrelse og granularitet (gate P2). Histogrammet plot (E) blev anvendt parallelt at identificere GFP-positive celler i FSC-A versus SSC-A punktdiagram (B). (C, D) scatter plots FSC-H vs. FSC-W og SSC-H versus SSC-W tjener til at fjerne aggregater og dubletter og selektere for singletter (gate P3 i C og gate P4 i D). (E) Histogrammet plot viser antallet af celler og deres GFP intensitet. Der skelnes mellem to toppe, GFP lav (gate P5) og GFP høj (gate P6). Notatet har cellepopulationen GFP høj indeholdende større celler steg in nummer under ældning. (F, G) Celler var tilbage-gated i en kontur plot at kontrollere, at de to forskellige GFP-positive cellepopulationer er af den korrekte størrelse (F) og indeholder levende celler (G). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. En post slags analyse blev udført for at bestemme renheden af de isolerede individuelle og fælles EBS (A) GFP-positive celler fra unge (7 dage) og gamle (60 dage) midguts var FAC sorteret og histogram plots viser deres fordeling i to toppe baseret på GFP intensitet. (B) Stillingen slags analyse viser renheden af de isolerede indgå individuelle servicekontrakter fra unge og gamle midguts som er> 97%. (C) Stillingen slags analyse af sorterede EB fra unge og gamle midguts viser en renhed på> 95%. De små urenheder kan skyldes fluorescensundertrykkelse eller mekanisk beskadigede GFP-udtrykkende celler forårsaget af re-sortere cellerne. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5: Eksempler på scatter plots, der viser suboptimale FACS data, hvilket ses, når FACS parametrene ikke var indstillet korrekt (A) Repræsentant FACS profilen af alle celler, når de FACS parametre indstillet korrekt baseret på de i protokollen kontrol.. Befolkningen celle, der indeholder individuelle servicekontrakter er rød cirkel og cellepopulationen indeholdende EBS er en cirkel med blåt. Cellerne kredsede i grøn er døde celler, der har en stærkere autofluorescens i forhold tillevende celler, som er plottet under 10 3 på den logaritmiske y-aksen. (B) punktdiagram viser et typisk resultat opnået, når FACS instrumentet ikke blev kalibreret. Der ikke registreres GFP-positive celler. (C) Hvis FSC ikke er indstillet korrekt, er de forskellige GFP-positive cellepopulationer ikke påvist. (D) Hvis FITC (GFP) kanal ikke er justeret korrekt, at størstedelen af GFP- positive celler, der skal sorteres, er ikke plottet i scatter plot, men langs den øvre kant af plottet. Også i plottet vist her, grænsen for autofluorescens blev ikke justeret, derfor celler, plot over 10 2 om logaritmiske y-aksen er faktisk autofluorescerende og kunne forveksles som GFP-positive celler.
Discussion
Den præsenterede protokol beskriver en metode til at isolere individuelle servicekontrakter fra unge og gamle voksne Drosophila midguts, som efterfølgende kan anvendes til yderligere molekylære analyser såsom næste generation sekventering. FAC sortering af GFP-positive cellepopulation fra ESG -Gal4 har UAS-GFP fluelinen allerede nået ved flere grupper 21,22. Men indtil nu er tilstedeværelsen af de to forskellige toppe af GFP-positive celler er blevet enten overset eller undervurderet. Vi viser, at denne adskillelse ikke kun repræsenterer to forskellige populationer af celletyper (HTT og EBS), men også, at de to toppe af GFP-positive celler ophold tydeligt adskilt under ældning. Denne observation er yderst relevant og værdifuldt for forskere interesseret i at studere stam- eller progenitorceller under aldring. Isolering af individuelle servicekontrakter fra gamle midguts har været hæmmet af, at der ikke er nogen molekylær markør kombination til at identificere individuelle servicekontrakter i en gammel mellemtarmen. Den eneste markør, unambiguously identificerer individuelle servicekontrakter i en gammel mellemtarmen er phospho-histone3 (PH3), da individuelle servicekontrakter er de eneste delende celler i mellemtarmen 12,13. Men PH3 er et uegnet markør til isolering ISC da antallet af dividere stamceller på ethvert givet tidspunkt er for lav for at opnå en ordentlig mængde ISC for efterfølgende analyser. Fluelinen ESG -Gal4, UAS-GFP er den mest almindelige fluelinen bruges af forskere, der studerer ISC funktion, vedligeholdelse og differentiering. Vores nuværende viden om den molekylære regulering af individuelle servicekontrakter homeostase er baseret på studier, hvor specifikke molekyler og signalveje er blevet manipuleret (revideret i 7). Derfor mangler vi stadig viden om de endogene molekylære forandringer, der sker i løbet af aldring. Den heri beskrevne fremgangsmåde lukker dette hul og er baseret på det faktum, at ISC kan isoleres baseret på deres størrelse, granularitet og GFP intensitet fra voksne midguts på noget tidspunkt under ældning.
Mensoprettelse og optimering af denne metode har vi fundet følgende trin for at være kritisk for en pålidelig resultat. Ca. 200 indvolde skal dissekeret for at opnå en god mængde af ISC for FAC-sortering. Hastigheden af dissektion er afgørende og afhænger af den enkelte praksis. En uddannet person kan dissekere 40 indvolde inden 20-30 min. Da GFP også kommer til udtryk i de Malpighian tubuli i ESG -Gal4, UAS-GFP fluelinen, er det vigtigt helt at fjerne Malpighian tubuli fra mellemtarmen. De dissekerede midguts skal opbevares på et køligt miljø for at undgå vævsnedbrydning og reducere RNAse-aktivitet i vævet. Derfor skal dissekerede midguts overføres fra dissekere fad i mikrocentrifugerør indeholdende kold 1x PBS / 1% BSA opløsning efter maksimalt 20-30 min og holdt på is. Dog bør de dissekerede midguts ikke efterlades på is i mere end 2 timer før start vævet dissociation med trypsin. Den mest efficient tilgang er at dissekere så mange partier af fluer som muligt inden for disse 2 timer, start derefter trypsin fordøje for disse partier. Hvis der er behov for flere midguts, kan de dissekeres under inkubationen tidspunkter af trypsin fordøjelse.
Selvom trypsin er en meget potent enzym og kan have skadelige virkninger på celler, vi stadig fået nok levende, raske celler til efterfølgende FAC sortering. Det afgørende skridt i vores procedure, der giver mulighed for isolering af intakte celler er, at de dissocierede celler fjernes fra trypsinopløsning hver 30 min. Hvis dissekerede midguts inkuberes i 2 ½ time i en trypsin indeholdende opløsning ved stuetemperatur, observerede vi en stigning i døde, Sytox-positive celler 20-30%. Det skal påpeges, at trypsinopløsningen vi bruger indeholder EDTA. Tilstedeværelsen af EDTA sandsynligvis letter væv disintegration ved chelaterende calcium- og magnesiumioner er nødvendige for en korrekt funktion af ekstracellulære matrix-molekyler. Det mest afgørende skridt til succes sortere HTT fra unge og gamle indvolde er passende indledende indstillinger af FACS og gating parametre via de beskrevne kontroller og efter en konkret sortering hierarki. Vi udførte FAC sortering på en ARIA II flowcytometer (FACSDiva software). Det er vigtigt, at instrumentet er tændt mindst en time før sortering at varme op lasere. Notatet, når FAC sortering af individuelle servicekontrakter udføres for første gang, parametrene for sortering og om erstatning skal indstilles ved hjælp af de førnævnte knapper: (1) dissocierede celler fra vildtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts uden tilsætning af Sytox - fastsættelse af denne parameter (trin 4.4.1) forhindrer, sortering celler baseret på deres autofluorescens; (2) dissocierede celler fra vildtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts med Sytox tilføjet - at sætte denne parameter(Trin 4.4.2) tillader adskillelse døde fra levende celler (døde celler har en høj autofluorescens og kan forurene de sorterede GFP-positive celler); (3) dissocierede celler fra midguts af ESG -Gal4, UAS-GFP fluelinen uden Sytox - sikrer at sætte denne parameter (trin 4.4.3), at alle GFP-positive celler er plottet i scatter plot. Hvis disse parametre ikke er indstillet korrekt, vil det sorterede cellepopulation sandsynligvis indeholde døde celler og debris (figur 5B, C), mange GFP-positive celler vil blive savnet (figur 5D) og to forskellige toppe for GFP-positive celler som ses i histogram plot vil (figur 2E og figur 3E) ikke påvises. Når FACS og gating parametre er indstillet, instrumentet kalibreret og klar til at sortere celler fra ESG -GAL4, UAS-GFP fluelinen. Da disse parametre kan gemmes, alle fremtidige sortering sessioner for individuelle servicekontrakter og EB'er fra ESG -GAL4, UAS-GFP fluelinen kan starte fra trin 4.5. Selv vælge "renhed" tilstand og udføre en tovejs renhed slags nedsætter antallet af celler sorteret, det giver mulighed for en højere sortering stringens (trin 4.6 og figur 4B, C). Af note, fordelen ved at bruge Sytox stedet for propidiumiodid at mærke døde celler er, at der er kun en lav afsmitning til FITC (GFP) kanal, hvilket gør det let at kompensere for spillover.
Vores metode til at berige for ISC og EB'er henholdsvis er baseret på sortering af celler i henhold til forskellige GFP ekspressionsniveauer. Det kan være, at under ældning af misdifferentiated EB'er også udtrykke GFP på et lavere niveau og kunne forveksles som individuelle servicekontrakter. Da de sorterede celler er også forskellige i størrelse og granularitet, mener vi dog, at vores sortering strategi er den mest velegnede til denne dato for at berige for individuelle servicekontrakter og EB'er. Det er også kendt, at celler i en aldrende mellemtarmen støttemure ISC identitet har en lille kerne 15. For at få mere klarhed om identiteten af de sorterede celler, kunne man sortere celler fra en transgen fluelinen, der bærer ESG -GAL4, UAS-GFP og et Notch signalering reporter transgen. Da Notch har vist sig at være aktive kun EBS 12,13, individuelle servicekontrakter isoleret fra en ung mellemtarmen ville være negativt for Notch reporter, mens EBS vil være positivt for Notch reporter. Men aldrende Notch signalering bliver under afvigende i mellemtarmen væv. Derfor skal det skal testes, om denne eksperimentelle oprettet er faktisk mere pålidelige til at skelne mellem individuelle servicekontrakter og EB'er isoleret fra en gammel mellemtarmen.
Vi har allerede ansat denne tilgang til sammenlignende transkriptom analyse af individuelle servicekontrakter fra unge og gamle midguts og identificeret en række faktorer, der differentielt reguleret under aldring (unpub. Observ.). Desuden er denne metode giver mulighed for at analysere forskelle i genekspression mellem individuelle servicekontrakter og EBS. En sådan undersøgelses vil give indsigt i de oprindelige molekylære ændringer, der forekommer som en celle kommer ind i differentieringsprocessen. Desuden vil isoleringen af EB'er under aldring og efterfølgende analyser belyse de molekylære ændringer af alder-induceret misdifferentiation. Endvidere kan denne metode kombineres med andre genetiske værktøjer, der anvendes i Drosophila at undersøge genfunktion. Sammenfattende denne metode giver en fordomsfri tilgang til at undersøge molekylære karakteristika og ændringer i individuelle servicekontrakter og EB'er under ældning. Dette er et værdifuldt redskab, som vil lette udforskningen af aldrende mekanismer i voksne stamceller og stamceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
- Jones, D. L., Rando, T. A. Emerging models and paradigms for stem cells ageing. Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).
- Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Signer, R. A., Morrison, S. J. Mechanisms that regulate stem cell aging and life span. Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).
- Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. Healthy Aging – Insights from Drosophila. Front. Physiol. 3, 106 (2012).
- Biteau, B., Jasper, H. EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila. Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).
- Jasper, H., Jones, D. L. Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging. Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity. Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).
- Wang, L., Jones, D. L. The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila. Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).
- Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).
- Ayyaz, A., Jasper, H. Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster. Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).
- Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut. Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).
- Ohlstein, B., Spradling, A. The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells. Nature. 439, 470-474 (2006).
- Micchelli, C. A., Perrimon, N. Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. Nature. 439, 475-479 (2006).
- Ohlstein, B., Spradling, A. Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling. Science. 315 (5814), 988-992 (2007).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut. Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).
- Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor. Aging Cell. 7, 318-334 (2008).
- Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila. AGING. 1 (7), 637-651 (2009).
- Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Yagi, Y., Hayashi, S. Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis. Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).
- Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells. J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).
- Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).
