Introduction
En uunngåelig konsekvens av å bli gammel er den synkende evne til vev og organer for å være funksjonell. Adulte stamceller er avgjørende for å opprettholde vev homeostase og orgel funksjonalitet, men som organismer alder, stamcellene også oppleve en nedgang i sine biologiske oppførsel. Dette er spesielt skadelig for vev som har en høy omløpshastighet, slik som tarmepitelet. Kjennetegn på alderen stamceller inkluderer genomisk skade, svekket reparasjonsmekanismer, svekket cellesyklusregulering og misregulated signalveier, som alle påvirker normal stamcelle atferd (anmeldt i 1-3). Ved å manipulere spesifikke signalveier eller banke ned spesifikke gener, har vi fått innblikk i sine roller i å regulere og opprettholde normal stamcelle oppførsel. Siden de fleste av disse eksperimentene er kandidat molekyl tilnærminger, har vi svært lite kunnskap om de endogene molekylære endringer som skjer i stamceller underaldring. En måte å nærme seg dette spørsmålet er å sammenligne transkriptomet av unge versus gamle stamceller til å identifisere molekyler som uttrykk profilen endrer seg betraktelig under aldring. Dessverre har biologiske og tekniske utfordringer hemmet vår fremgang vedrørende denne tilnærmingen så langt.
Drosophila melanogaster er en svært passende modellorganisme for å studere aldring siden den har en kort levetid (ca. 60 til 70 dager), og oppviser aldring fenotyper (oversikt i 4). Videre kan aldringsprosessen i Drosophila akselereres ved temperatur. Ved å holde fluene ved 29 ° C, kan en alderen fenotype i tarmvevet allerede observeres etter 15 dager 5. Videre er Drosophila mottagelig for en mengde av genetiske manipulasjoner. Spesielt har Drosophila midgut stått som en utmerket modellsystem for å studere påvirkning av ulike signalveier og miljøutfordringer påbiologi tarm stamceller (ISCS) under aldring (anmeldt i 6-10). Drosophila tarmepitelet har en høy omløpshastighet og fornyes annenhver uke hos kvinner og en gang i måneden i menn 11. ISCS bosatt i Drosophila midgut har kapasitet til å dele seg og produsere en selv fornyet ISC og en post-mitotisk stamcelle kalt enteroblast (EB) 12,13. EB differensierer inn enten et absorberende enterocyte eller en sekretorisk enteroendocrine celle. Til denne datoen, er den eneste markøren kombinasjon som entydig etiketter en ISC uttrykk for transkripsjonsfaktoren escargot (ESG) og Notch ligand Delta (DL) 14. Men bare dette gjelder for en ung og sunn tarm. Under aldring, er midgut epitel preget av en økning i ISC spredning 15-17. I tillegg avvik Notch signale forstyrrer skjebnen avgjørelse av ISC dattercellerog induserer misdifferentiation av EBS 15. Dette resulterer i en akkumulering av celler som er aktive for Notch signalering og co-uttrykte ESG og Dl, og derved gjøre Dl ekspresjon utilstrekkelig til å identifisere bona fide stamceller i en alderen tarmen. Vanskeligheten med å identifisere ekte ISCS har hindret muligheten til å undersøke endogene endringer i aldring ISCS før nå.
Vi har taklet dette problemet ved å dra nytte av ESG -Gal4, UAS-GFP transgen fluesnøre da nivået av GFP uttrykk i ISCS og EBS er iboende forskjellige og forblir forskjellig gjennom aldring. En lignende metode er blitt beskrevet for isolering av larve neuroblasts og neuroner 18,19. Midguts av unge og gamle ESG -Gal4, UAS-GFP fluer ble dissekert og dissosiert i enkeltceller. Cellene ble deretter sortert for GFP-positive celler ved bruk av fluorescens-aktivert cellesortering (FACS). Interessant, sortert GFP-positive calen fordelt i to tydelige topper basert på GFP fluorescens intensitet (GFP høy og GFP lav). Videre er fordelingen av de GFP-positive celler i de to toppene også korrelert med cellestørrelse: cellene som viste lav GFP intensitet var små og mindre kornet, mens celler med høy intensitet GFP var større og mer detaljert. Denne observasjonen foreslo at de mindre ISCS kunne skilles fra de større EBS hjelp FACS basert på GFP intensitet og velge passende frem scatter (FSC) og side scatter (SSC) innstillinger. Intrigere, forble de to toppene tydelig atskilt under aldring. Videre er forholdet mellom de to toppene forandret på en måte som reflekterer de nevnte kjennetegnene ved aldring midguts: nemlig at antall store, misdifferentiated EBS øker over tid. Fra disse funnene vi konkludere med at ved å sortere for GFP-positive celler ved hjelp av de aktuelle FACS parameterinnstillingene kan vi berike for ISCS og EBS når som helst punkt during aldring.
I sammendraget, introduserer vi en FACS strategi som gjør det mulig for forskere å berike for to ulike cellepopulasjoner, ISCS og EBS, fra Drosophila midguts i alle aldre og isolere disse cellene for videre analyse, som neste generasjons sekvensering. Denne kraftige metoden gjør det mulig for å studere de endogene molekylære mekanismer som er iboende til aldring i en beriket befolkning på stamceller eller stamceller. De oppnådde data fra disse studiene vil utvilsomt lette identifiseringen av konserverte molekyler som er vesentlig på tvers av arter i aldring.
Protocol
MERK: Hvis denne protokollen brukes for første gang for å isolere ISCS av FAC sortering, Følgende kontroller er obligatorisk for å i utgangspunktet satt FACS parametrene riktig: Dissosierte celler fra villtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts uten Sytox. Dissosierte celler fra villtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts med Sytox (se trinn 3.6). Dissosiert celler fra midguts av ESG -Gal4, UAS-GFP fluesnøre uten Sytox.
1. Utarbeidelse av løsninger og Retter for Gut Dissection
- Forbered 4-6 ampuller som hver inneholder 40 kvinnelige flyr fra ESG -Gal4, UAS-GFP fluesnøre.
- Fra en 10x PBS stamløsning forberede 500 ml 1x PBS (1,8 mM NaH 2 PO 4 · H 2 O, 8,4 mM Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 175 mM NaCl, justere pH til 7,4).
- Forberede en 3,5% Agarose-løsning i 1 x PBS (3,5 g elektroforese karakter agarose i 100 ml 1 x PBS). Forbered disseksjon platene ved å helle denne løsningen i petriskåler (diameter 8,5 cm) til å dekke bunnen. Agarose sjikt hindrer skade tuppen av tang under disseksjonen prosedyren. Etter at gelen har stivnet lagre disseksjon platene ved 4 ° C.
- Forbered 300 ml 1x PBS + 1% BSA friske før dissekere og plassere flasken på is eller ved 4 ° C.
- Slå på sentrifuge og la den avkjøles til 4 ° C.
- Flamme tips av to glass Pasteur pipetter for å jevne ut kantene.
- Rene to par pinsett og ett barberblad med 70% etanol.
- Plasser 05:56 1,5 ml mikrosentrifugerør for innsamling dissekert midguts på is.
2. Utarbeidelse av mage-tarmkanalen og Dissection av midgut
- Bedøve fluer fra et hetteglass (40 fluer) med CO 2 på en standard fly seng, halshogge allefluer ved hjelp av et barberblad og overføre dem til disseksjon parabolen. Helle kaldt 1 x PBS / 1% BSA-oppløsning i disseksjon fatet for å dekke agarosegel. Fluene vil flyte.
- Grab fly magen med en pinsett, mens du holder brystkassen med den andre pinsett. Separer thorax fra magen. Tarmen vil være synlig og fortarmen / avling vil mest sannsynlig fortsatt være koblet til brystkassen.
- Ta tak i tarmen og trekk den ut av brystkassen. Å utfolde seg i tarmen, ta tak i avling og trekk tarmen litt anteriorly bort fra magen.
- Gripe den bakre ende av bukhulen med en pinsett og kanten på hårstråene anteriort åpen med det andre paret av tenger. Vær forsiktig så du ikke ødelegger den utstikk gut vev. Trekk den bakre enden bort for å bryte skjellaget og fortsette å trekke posteriorly veldig forsiktig inntil hele tarmen har blitt trukket ut av bukhulen. Avlingen kan ha til å bli fjernet på forhånd, hvis den er for stor til å passegjennom kroppens hulrom.
- Fjern den forutgående, Malpighian tubuli, hindgut og eggstokker forlater den nakne midgut.
- Ved hjelp av en glass Pasteur pipette, overføre batchen av dissekert midguts til et 1,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende kald 1 x PBS / 1% BSA-oppløsning og holde røret på is. Prøvene skal behandles innen 2 timer.
- Etter disseksjon av en hel batch er ferdig, skyll disseksjon parabolen med dobbelt destillert vann for å vaske av til venstre over rusk. Begynne å dissekere den neste batch av midguts (gjenta trinn 02.01 til 02.07). Dissekere så mange grupper som mulig innen 2 timer, deretter videre til trinn 3.1.
3. Fordøyelse av Gut Tissue til Harvest-Cells for FAC Sorting
- Fjern det 1 x PBS / 1% BSA-oppløsning fra midguts og tilsett 500 ul av 0,5% Trypsin-EDTA-løsning til hver prøve.
- Vortex godt i 20 sekunder, og prøvene inkuberes ved forsiktig vugging / som roterer ved 20 opm ved romtemperatur i 25-30 min.
- Vortex igjen etter ca 30 minutter, og la det intakte midgut vev synke til bunnen av røret. Fjern forsiktig cellene som er i suspensjon med en flammet glass Pasteur pipette og filtrere dem gjennom en 35 mikrometer nylon mesh i en fersk 1,5 ml mikro tube.
- Spinn cellene ned ved 100 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Av notatet, når du starter fordøye, en celle pellet kanskje ikke være synlig i starten, men vil bli synlig som vevet fordøye utvikler seg.
- Overføre forsiktig trypsinoppløsning tilbake til den opprinnelige prøve inneholdende de resterende intakte midgut vev. Unngå å overføre for mange celler fra pelleten.
- Forsiktig re-suspendere cellepelleten i 400 ul kald 1x PBS / 1% BSA. Hold mikrosentrifugerør inneholdende de dissosierte cellene på is og dekke rørene med aluminiumsfolie for å beskytte cellene mot lys.
- Vortex Trypsin løsning som inneholder den gjenværende intakte midgut vev igjen og plassere prøvenepå vippe i ytterligere 30 minutter ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 3.3 til 3.4.3 inntil alt midgut vevet har blitt spaltet. Kombiner de dissosierte celler fra alle mikrosentrifugerør inn en mikrosentrifuge tube. Dette kan kreve et sentrifugeringstrinn som i 3.4, siden volumet av alle cellesuspensjoner kombinert kan overstige 1,5 ml. Hold cellesuspensjonen på is og beskytter cellene mot lyse.
- Spinn dissosierte cellene ned ved 100 xg i 5 min ved 4 ° C. Forsiktig fjerne så mye av supernatanten som mulig forlater omtrent 50-100 ul av 1 x PBS / 1% BSA-oppløsning i mikrosentrifugerør. Forsiktig resuspender dissosierte celler i 800 pl 1 x PBS / 1% BSA inneholdende Sytox (1: 20.000).
- Overfør cellesuspensjonen til en 5 ml rundbunnet Falcon rør ved å filtrere cellene gjennom et cellefilter smekklokk (35 um nylonnett). Alltid holde celleprøver på is og beskyttet mot lys. Cellene er nå klar til åsorteres.
- Pipettere 600 ul av RNAlater løsning i hver mikrosentrifugerør i hvilke cellene vil bli sortert for påfølgende RNA-isolering. For andre nedstrøms applikasjoner cellene kan oppsamles i en annen oppløsning, for eksempel i steril PBS.
4. FAC Sorting å isolere Tarm stamceller
- Slå på flowcytometri instrument minst en time før sortering. Kontroller at fluidic system er fri for luftbobler.
- Velg dysestørrelse på 70 um for å injisere cellene i sliren fluidstrømmen.
- Justere amplituden av kjernen fluidstrøm, slik at gapet verdien svarer til referanseverdien (6-7, ved bruk av 70 um dyse). La kjernen fluidstrømmen stabiliseres før man begynner å sortere.
- Følg denne rekkefølgen når utgangspunktet sette parametere for sortering:
- Laste de dissosierte celler hentet fra villtype guts. Først justere FSC og SSC spenningerå plotte cellene i sentrum av punktplottet. Sekund, justere FITC (GFP) spenning, slik at alle celler er plottet under 10 2 på den logaritmiske x-aksen. Stille FITC parameter setter grensen for autofluorescence.
- Laste de dissosierte celler hentet fra villtype guts med Sytox lagt. Juster Pacific Blue spenningsverdi og gate å identifisere og skille levende celler fra døde, Sytox-positive celler i Pacific Blue vs. FSC-A spredningsdiagram.
- Laste de dissosierte celler hentet fra ESG -Gal4, UAS-GFP fluesnøre uten Sytox og justere FITC spenning for å sikre at alle GFP-positive celler er plottet i spredningsdiagram.
- Laste de dissosierte celler hentet fra ESG -Gal4, lagt UAS-GFP fluesnøre med Sytox. Juster Pacific Blue spenningsverdi og gate å identifisere og skille levende celler fra døde, Sytox-positive celler (gate P1).
- Still SSC-A og FSC-A gate for å identifisere GFP-positive celler (basert på histogrammet tomten) som bestemmes av størrelse og detaljnivå (gate P2).
- Still FSC-H og FSC-W gate for å identifisere og utelukke GFP-positive celle dubletter basert på deres størrelse (gate P3).
- Still SSC-H og SSC-W gate for å identifisere og utelukke GFP-positive celle dubletter basert på deres detaljnivå (gate P4).
- Bruk port P4 til å avbilde de GFP-positive celler i et histogram plott som viser antall celler (teller) vs. GFP intensitet. To distinkte topper av GFP-positive celler vil være synlig. Lag en gate for hver topp (porter P5 og P6). Porten P5 inneholder cellepopulasjonen som er anriket for ISCS og kan sorteres separat fra cellene i porten P6.
- Back-gate i konturplott å bekrefte at de to distinkte GFP-positive cellepopulasjoner inneholde levende celler (sammenligne med gate P1) og celler i riktig størrelse (sammenligne med gate P2).
- Sortere celler inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 600 & #181; l av RNAlater løsning. Sorteringen blir utført ved en lav strømningshastighet (maks. 2,0, 70 um dyse, 1000 hendelser / sek, 70 psi) og ved anvendelse av en to-veis slag renhet.
- Etter sortering er fullført, umiddelbart vortex de sorterte celler kort og holde mikrosentrifugerør på is inntil fortsetter med RNA isolering eller andre nedstrøms applikasjoner.
Representative Results
For å få mellom 50,000-100,000 celler fra FAC sortering, mellom 160 og 200 midguts må dissekert. Tydeligvis er dette den mest tidkrevende trinn i hele prosessen. Tegneserie vist i figur 1A viser de viktigste trinnene av tarmen disseksjon, som er beskrevet i detalj i protokollen gitt her. Denne fremgangsmåten kan modifiseres individuelt. En dissekert, hele mage-tarm-kanalen er vist i figur 1B.
Når alle midgut vevet har blitt spaltet, umiddelbart fortsette med FAC sortering. Etter at portstyringsstrategien beskrevet i protokollen muliggjør vellykket identifisering og sortering av en cellepopulasjon anriket for ISCS og for EBS fra unge (figur 2) og fra gamle midguts (figur 3). P1 gate er satt til å omfatte bare sunn levende celler og for å separere ut døde celler. Celler som plotte over 10 3 på logaritmisk y-økser ved bruk av Pacific Blue kanal er definert som døde celler. Prikkene at tomten under 40 på x-aksen (FSC-A) er mest rusk og derfor er også ekskludert (Figur 2A). I spredningsplott av SSC-A vs. FSC-A cellene er fordelt basert på deres størrelse og detaljnivå. For en optimal oppløsning, blir cellene plassert i spredningsdiagram som vist i Figur 2B ved justering av fotomultiplikatorrøret (PMT) spenning. I spredningsplott FSC-H vs. FSC-W og SSC-H vs. SSC-W enkeltceller skilles fra aggregater og dubletter basert på størrelse (figur 2C), og basert på granularitet (figur 2D). Når skildrer cellene som inngår i gate P4 i et histogram plott, den distinkte separasjon av GFP-negativ, GFP lav (gate P5) og GFP høy (gate P6) celler er synlig (figur 2E). Celler som oppviser lavere GFP intensitet er små og mindre kornet og representerer ISCS. Celler stiller høyere GFP intensity er større og mer detaljert og representerer EBS. Revers transkriptase (RT) -PCR i Dl på cDNA syntetisert fra RNA fra celler av hver GFP-positive populasjon (gates P5, P6) avslørte at Dl-signalet er faktisk sterkere i de mindre, GFP lave celler enn i de større, GFP høy celler (figur 2 H). Cellene ble deretter backgated og avbildet i kontur plott for å bekrefte at GFP lav (gate P5) og GFP høy (gate P6) celler varierer i størrelse og detaljnivå (figur 2F) og er fortsatt i live (figur 2G). Av notatet, kan de to toppene av GFP-positive celler (GFP lav og GFP høy) bare være pent skilles hvis FITC (GFP) kanal har blitt kalibrert riktig å bruke kontrollene beskrevet i protokollen.
Det samme gating strategien ble brukt ved sortering ISCS avledet fra gamle guts (figur 3). XY-plott (Figure 3A-D), histogrammet (figur 3E) og konturhullene plott (figur 3F, G) er analoge med de som er vist i figur 2. Som nevnt ovenfor, er det ingen bona fide markør for å identifisere ISCS i gamle midguts og dermed no RT-PCR data er presentert her. Imidlertid er det interessant observasjon her at de to toppene som inneholder GFP lav (port P5) eller høy (GFP porten P6) celler forblir tydelig adskilt under aldring. Videre er antall celler i GFP høy (gate P6) topp øker betydelig i løpet av aldring, noe som klart emulerer den kjente oppbygging av misdifferentiated EBS med alderen. Forandringen i forholdet mellom de to cellepopulasjoner kan også ses i spredningsplott (sammenlign figur 3A-D med figur 2A-D) og i kontur plott (sammenlign figur 3F, G med figur 2F, G). Fra disse funnene vi konkludere med at ved å sortere for GFP-positive celler ved hjelp FACS vi kan berike for ISCS og EBS hos unge og gamle midguts.
Å validere renheten av isolerte ISCS og EBS, ble en post slags analyse utført (figur 4). Histogrammet plottes i etter sortert ISCS og EBS (4B, C) viser renhet mellom 95% og 98%.
Hvis hierarkiet av innstilling av FACS parametre som er beskrevet ovenfor er strengt fulgt, kan de to forskjellige cellepopulasjoner (GFP lav, liten og GFP høy, større) allerede skjelnes i et spredningsdiagram GFP vs. FSC-A (figur 5A). Disse to cellepopulasjoner kan ikke skilles fra hverandre hvis dette hierarki er sett bort (Figur 5B-D).
Figur 1: (A) Et skjematisk riss av de viktigste trinnene av dissecting fly tarmen. For det første er hodet fjernet (fjerning av vingene er valgfritt), etterfulgt av en separasjon av toraks og buken til å eksponere tarmen. Tarmen er senere frigjort fra kroppen hulrom i følgende trinn. De sorte piler viser progresjon av disseksjon, mens de mørke røde pilene betegner rulleretningen. De røde linjer i det siste bildet viser fremre og bakre grensene av midttarmen. (B) En lett mikroskopbilde av den voksne flue tarmen. De viktigste regioner og anatomiske trekk er merket. Røde linjer markere grensene for midgut.
Figur 2:. FAC sortering strategi for å identifisere og isolere ISCS og EBS fra unge (7 dager) midguts For bedre visualisering, celler som representerer ISCS er uthevet i rødt og celler som representerer EBS er utheveti blått i spredningsplott (AD) og i kontur plott (F, G). (A) P1 gate er satt til å utelukke døde, Sytox-positive celler plottet over 10 3 på logaritmisk y-aksen. Terskelen av FSC-A settes til 40 til også å utelukke døde celler og rusk. (B) Celler ble inngjerdet for FSC-A og SSC-A for å velge celler i henhold til størrelse og detaljnivå (gate P2). Histogrammet tomten (E) ble brukt parallelt for å identifisere GFP-positive celler i FSC-A vs. SSC-A spredningsdiagram (B). (C, D) De spredningsplott FSC-H vs. FSC-W og SSC-H vs. SSC-W tjener til å fjerne aggregater og dubletter, og selektere for singletter (porten P3 i C og porten P4 i D). (E) Histogrammet plottet viser antall celler og deres GFP intensitet. To topper, GFP lav (gate P5) og GFP høy (gate P6) kan skilles. (F, G) Celler ble back-gated i konturplott å bekrefte at de to distinkte GFP-positive celle populationer er av korrekt størrelse (F) og inneholder levende celler (G). (H) revers transkriptase (RT) -PCR i Dl på cDNA syntetisert fra RNA isolert fra celler som er til stede i den første topp (port P5) og i andre topp (porten P6), henholdsvis. Mer Dl ekspresjon kunne påvises i cellene som er tilstede i porten P5 vs. porten P6. Tubulin fungert som en lasting kontroll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: FAC sortering strategi for å identifisere og isolere ISCS og EBS fra gamle (60 dager) midguts For bedre visualisering, celler som representerer ISCS er uthevet i rødt og celler som representerer EBS er uthevet i blått i spredningsplott (AD) og i den. contour plott (F, G). (A) P1-porten settes for å ekskludere døde, Sytox-positive celler er plottet over 10 3 på den logaritmiske y-aksen. Terskelen av FSC-A settes til 40 til også å utelukke døde celler og rusk. Av notatet, er aldersavhengig økning i større GFP-positive celler allerede tydelig i denne tomten. (B) Celler ble inngjerdet for FSC-A og SSC-A for å velge celler i henhold til størrelse og detaljnivå (gate P2). Histogrammet tomten (E) ble brukt parallelt for å identifisere GFP-positive celler i FSC-A vs. SSC-A spredningsdiagram (B). (C, D) De spredningsplott FSC-H vs. FSC-W og SSC-H vs. SSC-W tjener til å fjerne aggregater og dubletter, og selektere for singletter (porten P3 i C og porten P4 i D). (E) Histogrammet plottet viser antall celler og deres GFP intensitet. To topper, GFP lav (gate P5) og GFP høy (gate P6) kan skilles. Av notatet, har cellepopulasjonen GFP høy som inneholder større celler økt in antall under aldring. (F, G) Celler var tilbake-gated i konturplott å bekrefte at de to distinkte GFP-positive cellepopulasjoner er av riktig størrelse (F) og inneholder levende celler (G). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Et innlegg slags analyse ble utført for å bestemme renheten av den isolerte ISCS og EBS (A) GFP-positive celler fra ung (7 dager) og gamle (60 dager) midguts var FAC sortert og histogram tomter vise sin distribusjon i to topper basert på GFP intensitet. (B) Innlegget slags Analysen viser renheten av de isolerte ISCS fra unge og gamle midguts som er> 97%. (C) Innlegget slags analyse av sortert EB fra unge og gamle midguts viser en renhet på> 95%. De små urenheter kan skyldes fluorescensslukking eller mekanisk skadet GFP uttrykke celler forårsaket av re-sortering cellene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Eksempler på spredningsplott som viser suboptimale FACS data, som er sett når FACS parametrene ikke var riktig innstilt (A) Representant FACS profilen til alle cellene når de FACS parametrene ble satt ordentlig basert på de kontrollene som er beskrevet i protokollen.. Cellepopulasjonen inneholder ISCS er innringet i rødt og cellepopulasjonen inneholder EBS er innringet i blått. Cellene sirklet i grønt er døde celler som har en sterkere autofluorescence forhold tillevende celler, som er plottet på under 10 3 på den logaritmiske y-aksen. (B) spredningsdiagram viser et typisk resultat oppnås når FACS instrument ikke var kalibrert. Ingen GFP-positive celler oppdages. (C) Dersom FSC ikke er riktig innstilt, blir de forskjellige GFP-positive cellepopulasjoner ikke oppdaget. (D) Dersom FITC (GFP) kanal ikke er riktig justert, de fleste av GFP- positive celler som skal sorteres ikke er plottet i spredningsdiagram, men snarere langs den øvre kant av tomten. Også i plottet vist her, grensen for autofluorescence ble ikke justert, derav celler som tomten over 10 2 på logaritmisk y-aksen er faktisk autofluorescent og kan forveksles som GFP-positive celler.
Discussion
Den presenterte protokollen beskriver en metode for å isolere ISCS fra unge og gamle voksne Drosophila midguts, som senere kan brukes til ytterligere molekylære analyser som neste generasjons sekvensering. FAC sortering av GFP-positive cellepopulasjon fra ESG -Gal4 har UAS-GFP fluesnøre allerede blitt oppnådd ved flere grupper 21,22. Men inntil nå tilstedeværelsen av de to tydelige topper av GFP-positive celler er enten oversett eller undervurdert. Vi viser at denne separasjon ikke bare representerer to forskjellige populasjoner av celletyper (ISCS og EBS), men også at de to toppene av GFP-positive celler bli tydelig atskilt under aldring. Denne observasjonen er svært relevant og verdifull for forskere som er interessert i å studere stamceller eller stamceller i løpet av aldring. Isolering av ISCS fra gamle midguts har vært hemmet av at det ikke er noen molekylær markør kombinasjon for å identifisere ISCS i en alderen tarmen. Den eneste markør som unambiguously identifiserer ISCS i en gammel midgut er fosfor-histone3 (PH3), siden ISCS er de bare dele celler i midgut 12,13. Imidlertid er PH3 en uegnet markør for å isolere ISCS fordi antall delende stamceller på ethvert gitt tidspunkt er for lav for å oppnå en grei mengde ISCS for etterfølgende analyser. Snøret ESG -Gal4, UAS-GFP er den vanligste fluesnøre som brukes av forskere som studerer ISC funksjon, vedlikehold og differensiering. Vår nåværende kunnskap om molekylær regulering av ISCS homeostase er basert på studier i hvilke spesifikke molekyler og signalveier er blitt manipulert (anmeldt i 7). Derfor har vi fortsatt mangler kunnskap om de endogene molekylære endringer som skjer i løpet av aldring. Den heri beskrevne fremgangsmåte lukker dette gap og er basert på det faktum at ISCS kan bli isolert basert på deres størrelse, granularitet og GFP intensitet fra voksne midguts som helst tidspunkt under aldring.
Mensetablere og optimalisere denne metoden vi har funnet følgende trinn for å være kritisk for en pålitelig resultat. Omtrent 200 guts må dissekert for å få en god mengde ISCS for FAC sortering. Hastigheten til disseksjon er avgjørende og avhenger av den enkelte praksis. En trenet person kan dissekere 40 guts innen 20-30 min. Siden GFP kommer også til uttrykk i de Malpighian tubuli i ESG -Gal4, UAS-GFP fluesnøre, er det viktig å fjerne de Malpighian tubuli fra midgut. De dissekerte midguts må holdes på et kjølig miljø for å unngå vev degradering og redusere RNAse aktivitet i vevet. Derfor må de dissekerte midguts overføres fra dissekere fatet i mikrosentrifugerør inneholdende kald 1 x PBS / 1% BSA-oppløsning etter at et maksimum på 20-30 min, og holdt på is. Imidlertid bør de dissekerte midguts ikke stå på is i mer enn 2 timer før du starter vev dissosiasjon med trypsin. Den mest efficient tilnærming er å dissekere så mange grupper av fluer som mulig innenfor disse 2 timer, deretter starte trypsin fordøye for disse partiene. Hvis flere midguts er nødvendig, kan de bli dissekert under inkuberingen tider av trypsin digest.
Selv trypsin er en meget potent enzym og kan ha skadelige effekter på celler, vi likevel fått nok levende, friske celler for påfølgende FAC sortering. Nøkkeltrinnet i vår fremgangsmåte som gjør det mulig for isolering av intakte celler er at de dissosierte cellene blir fjernet fra trypsinoppløsning hvert 30 min. Hvis de dissekerte midguts inkuberes i 2? T i en trypsin-inneholdende oppløsning ved romtemperatur, ble det observert en 20-30% økning i død, Sytox-positive celler. Det bør påpekes at trypsinoppløsning vi bruker inneholder EDTA. Tilstedeværelsen av EDTA letter sannsynligvis nedbrytning av vev chelatere kalsium- og magnesiumioner som er nødvendig for riktig funksjon av ekstracellulære matriks-molekyler. De mest avgjørende skritt for å lykkes slags ISCS fra unge og gamle guts er de riktige innledende innstillinger av FACS og port parametere med de beskrevne kontrollene og etter en bestemt sortering hierarki. Vi utførte FAC sortering på en ARIA II Flowcytometer (FACSDiva programvare). Det er viktig at apparatet er slått på minst en time før sortering for å varme opp lasere. Av notatet, når FAC sortering av ISCS blir fremført for første gang, parametrene for sortering og om erstatning må være satt opp ved hjelp av de nevnte kontrollene: (1) dissosiert celler fra villtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts uten tillegg av Sytox - sette denne parameteren (Trinn 4.4.1) hindrer sortering celler basert på deres autofluorescence; (2) dissosiert celler fra villtype (f.eks w 1118) Drosophila midguts med Sytox lagt til - å sette denne parameteren(Trinn 4.4.2) kan skille død fra levende celler (døde celler har en høy autofluorescence og kan forurense sortert GFP-positive celler); (3) dissosiert celler fra midguts av ESG -Gal4, UAS-GFP fluesnøre uten Sytox - sikrer sette denne parameteren (trinn 4.4.3) at alle GFP-positive celler er plottet i spredningsdiagram. Hvis disse parametrene ikke er satt riktig, vil den sorterte cellepopulasjon mest sannsynlig inneholde døde celler og rusk (Figur 5B, C), mange GFP-positive celler vil bli savnet (Figur 5D) og de to tydelige topper for GFP-positive celler som sett i histogrammet tomten (Figur 2E og Figur 3E) vil ikke bli oppdaget. Når FACS og port parametere er satt, er instrumentet kalibrert og klar til å sortere celler fra ESG -GAL4, UAS-GFP fluesnøre. Siden disse parametrene kan lagres, all fremtid sortering økter for ISCS og EBS fra ESG -GAL4, UAS-GFP fluesnøre kan starte fra trinn 4.5. Selv om å velge den "renhet" modus, og å utføre en toveis renhet sorter reduserer antall celler sortert, gir det mulighet for en høyere sorteringsstringens (trinn 4.6 og figur 4B, C). Av notatet, fordelen med å bruke Sytox istedenfor propidiumjodid å merke døde celler er at det er bare en lav ringvirkninger inn i FITC (GFP) kanal, noe som gjør det enkelt å kompensere for smitte.
Vår fremgangsmåte for å anrike for ISCS og EBS, henholdsvis, er basert på sortering av cellene i henhold til forskjellige GFP ekspresjonsnivåer. Det kan være at under aldring av misdifferentiated EBS også uttrykke GFP på et lavere nivå, og kan forveksles som ISCS. Men siden sorterte cellene også variere i størrelse og detaljnivå, mener vi at vår sortering strategi er den mest egnet til denne datoen for å berike for ISCS og EBS. Dessuten er det kjent at cellene i et aldrings midgut feste ISC identitet har en liten kjerne 15. For å få mer klarhet om identiteten til de sorterte celler, kan man sortere celler fra en transgen fluesnøre som bærer ESG -GAL4, UAS-GFP og en Notch signale reporter transgenet. Siden Notch har vist seg å være aktiv bare i EBS 12,13, ISCS isolert fra en ung midgut ville være negativt for Notch reporter, mens EBS ville være positivt for Notch reporter. Men under aldring Notch signale blir avvikende i midgut vev. Derfor må det testes om denne eksperimentelle satt opp er faktisk mer pålitelig å skille mellom ISCS og EBS isolert fra en gammel midgut.
Vi har allerede ansatt denne tilnærmingen for komparativ transkriptom analyse av ISCS fra unge og gamle midguts og identifisert en rekke faktorer som er ulikt regulert under aldring (upub. Observ.). I tillegg gir denne metoden for å analysere forskjeller i genuttrykk mellom ISCS og EBS. Slike undersøkelsers vil gi innsikt i de første molekylære endringer som oppstår som en celle entrer differensiering prosessen. Dessuten vil isolering av EBS under aldring og påfølgende analyser belyse de molekylære endringer av alder-indusert misdifferentiation. Videre kan denne fremgangsmåte kan kombineres med andre genetiske verktøy som brukes i Drosophila å studere genfunksjon. Oppsummert denne metoden gir en objektiv tilnærming til å undersøke molekylære egenskaper og endringer av ISCS og EBS under aldring. Dette er et verdifullt verktøy som vil legge til rette for utforskning av aldringsmekanismer i voksen stilk og stamceller.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps: Dumont, Inox Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| SefarNitex 03-150um/38 (35 µm nylon mesh) | Sefar | 3A03-0150-102-00 | |
| Falcon 5 ml Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| Polymax 1040 | Heidolph | 543-42210-00 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma | A4503-50G | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | Trypsin obtained from a different company most likely has a different activity and the duration of the trypsin digest has to be adjusted accordingly. |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain for flow cytometry | Life Technologies | S34857 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7023 | Other solutions, e.g., Trizol can be used for subsequent RNA isolation |
| FACSAria II cell sorter | Becton Dickinson | Turn on one hour prior to sorting |
References
- Jones, D. L., Rando, T. A. Emerging models and paradigms for stem cells ageing. Nat. Cell Biol. 13 (5), 506-512 (2011).
- Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Signer, R. A., Morrison, S. J. Mechanisms that regulate stem cell aging and life span. Cell Stem Cell. 12 (2), 152-165 (2013).
- Iliadi, K. G., Knight, D., Boulianne, G. L. Healthy Aging – Insights from Drosophila. Front. Physiol. 3, 106 (2012).
- Biteau, B., Jasper, H. EGF signaling regulates the proliferation of intestinal stem cells in Drosophila. Development. 138 (6), 1045-1055 (2011).
- Jasper, H., Jones, D. L. Metabolic regulation of stem cell behavior and implications for aging. Cell Metab. 12 (6), 561-565 (2010).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. Maintaining tissue homeostasis: dynamic control of somatic stem cell activity. Cell Stem Cell. 9 (5), 402-411 (2011).
- Wang, L., Jones, D. L. The effects of aging on stem cell behavior in Drosophila. Exp. Gerontol. 46 (5), 340-344 (2011).
- Lucchetta, E. M., Ohlstein, B. The Drosophila midgut: a model for stem cell driven tissue regeneration. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1 (5), 781-788 (2012).
- Ayyaz, A., Jasper, H. Intestinal inflammation and stem cell homeostasis in aging Drosophila melanogaster. Front. Cell Infect. Microbiol. 3 (98), (2013).
- Jiang, H., Patel, P. H., Kohlmaier, A., Grenley, M. O., McEwen, D. G., Edgar, B. A. Cytokine/Jak/Stat Signaling Mediates Regeneration and Homeostasis in the Drosophila Midgut. Cell. 137 (7), 1343-1355 (2009).
- Ohlstein, B., Spradling, A. The adult Drosophila posterior midgut is maintained by pluripotent stem cells. Nature. 439, 470-474 (2006).
- Micchelli, C. A., Perrimon, N. Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. Nature. 439, 475-479 (2006).
- Ohlstein, B., Spradling, A. Multipotent Drosophila intestinal stem cells specify daughter cell fates by differential notch signaling. Science. 315 (5814), 988-992 (2007).
- Biteau, B., Hochmuth, C. E., Jasper, H. JNK Activity in Somatic Stem Cells Causes Loss of Tissue Homeostasis in the Aging Drosophila Gut. Cell Stem Cell. 3 (4), 442-455 (2008).
- Choi, N. H., Kim, J. G., Yang, D. J., Kim, Y. S., Yoo, M. A. Age-related changes in Drosophila midgut are associated with PVF2, a PDGF/VEGF-like growth factor. Aging Cell. 7, 318-334 (2008).
- Park, J. S., Kim, Y. S., Yoo, M. A. The role of p38b MAPK in age-related modulation of intestinal stem cell proliferation and differentiation in Drosophila. AGING. 1 (7), 637-651 (2009).
- Berger, C., Harzer, H., Burkard, T. R., Steinmann, J., vander Horst, S., Laurenson, A. S., Novatchkova, M., Reichert, H., Knoblich, J. A. FACS purification and transcriptome analysis of Drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Rep. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nat. Protoc. 8 (6), 1088-1099 (2013).
- Yagi, Y., Hayashi, S. Role of the Drosophila EGF receptor in determination of the dorsoventral domains of escargot expression during primary neurogenesis. Genes Cells. 2 (1), 41-53 (1997).
- Amcheslavsky, A., Ito, N., Jiang, J., Ip, Y. T. Tuberous sclerosis complex and Myc coordinate the growth and division of Drosophila intestinal stem cells. J. Cell Biol. 193 (4), 695-710 (2011).
- Dutta, D., Xiang, J., Edgar, B. A. RNA expression profiling from FACS-isolated cells of the Drosophila intestine. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 13 (27), (2013).
