Abstract
Bu video ayrıntılı olarak, bir fare kolorektum sinir preparatı kullanılarak bir in vitro tek lif elektrofizyolojik kayıt protokolünü gösterir. yaklaşımı tarafsız kimlik ve bireysel kolorektal afferentlerin fonksiyonel karakterizasyonu sağlar. Bir veya birkaç afferent kaynaklanan yayılan aksiyon potansiyeli (AP) dışı kayıtları (yani, tek-lif) kolorektumda alıcı alanlar (RFS) alay sinir lifi fasiküller yapılır. kolorektum pelvis (PN) veya bel splanknik (LSN) sinir bağlı ve boylamasına açılmıştır ya çıkarılır. Doku düz tutturulmuş ve oksijene edilmiş Krebs çözeltisi ile perfüze, bir kayıt bölümü içinde yer almaktadır. Odak elektriksel stimülasyon işlevsel beş mechanosensi içine afferentler kategorize (sondalama mukozal okşayarak ve çevresel streç künt) ayrıca üç farklı mekanik uyaranlarla test edilmektedir kolorektal afferent sonlar, bulmak için kullanılırtive sınıflar. Bu mekanik uyaranlara hiçbiri yanıt sonlar mekanik duyarsız afferentleri (MIAS) olarak kategorize edilir. Kimyasallara RFS lokalize maruz mechanosensitive ve MIAS sensitizasyon (yani, gelişmiş yanıt, azaltılmış eşik, ve / veya mechanosensitivity edinimi) için değerlendirilebilir Hem (örneğin, iltihabi çorba (IS), kapsaisin, adenozin trifosfat (ATP)). Biz ekipman ve kolorektum-sinir kayıt hazırlık, ekli PN veya LSN, sinir liflerinin gelen kolorektum, tek-lif kayıt RFS belirlenmesi ile kolorektumun hasat ve RF kimyasalların lokalize uygulamasını açıklar. Buna ek olarak, hazırlık ve standart mekanik uyarım uygulama zorlukları da tartışılmıştır.
Introduction
Ağrı ve aşırı duyarlılık belirgin biyopatolojik neden veya doku hasarının olmaması durumunda, irritabl bağırsak sendromu (IBS) gibi mide-bağırsak işlev bozuklukları, mustarip hastalarda baskın şikayetleri bulunmaktadır. Örneğin, IBS hastaları (karın alan palpasyonla yani, hassasiyet) normal bağırsak fonksiyonu sırasında rektal balon şişkinlik ve artan duyarlılığı artan tepkiler de dahil olmak üzere aşırı duyarlılık, yanı sıra somatik sevk aşırı duyarlılık gösterirler 1. Arasında, daha iyi anlaşılması, kolorektal ileticileri hedefleme IBS hastalarında (guanilat siklaza Cı agonisti linaclotide 4-6 oral yoldan, örneğin, lokal anestezik 2,3 intra-rektal instilasyon) ağrı ve aşırı duyarlılık azaltmada etkili olduğu kanıtlanmıştır çünkü kolorektumun afferent innervasyon önemlidir.
Kolorektal afferentlerin dahil viseral afferentleri,/ Kimyasal besleyici- ve termal modaliteleri (örneğin, 7-9) yanıt yeteneğine sahiptir. Ancak, mekanik uyaranlara (yani, mechanosensitive afferentleri) yanıt visseral afferentlerin olmuştur mekanik uyaranlara (örn, lümen distansiyonu, streç), genellikle rahatsızlık ve ağrı 10-16 olmak üzere bilinçli duyumlar, yol olanlardır çünkü çoğu iyice okudu. Buna ek olarak, organlar da yaygın, mekanik duyarsız afferentleri (MIAS) tarafından innerve sessiz ya da uyku nosiseptörleri 17 adlandırılır. Normal fizyolojik şartlar altında, MIAS mekanik uyarıya yanıt ya da çok yüksek bir tepki 18 eşikleri, ancak aktif hale gelir ve patofizyolojik koşullarda mechanosensitivity kazanmak ve aşırı duyarlılık katkıda bulunabilir yoktur.
Burada tarif edilen in vitro hazırlık ve protokolü kullanarak, biz geliştirdik ve denize bir elektrik uyaran stratejisi istihdam kolorektal 19 hem mechanosensitive ve MIA sonlar tarafsız kimlik izin alıcı sonlar için rch. kolorektal innervasyon lomber splanknik (SSN) ve pelvik sinir (PN) yollar türetilen ve beş mechanosensitive sınıflar (serozal, mukozal, kas, kas-mukozal, mezenterik) ve bir MIA sınıfına 20 olarak kategorize edilebilir kolorektal afferentler içerir. Bu in vitro hazırlanmasını kullanarak, kolorektal MIAS elde edilen mechanosensitivity LSN yolunun PN yolunda MIAS% 71 ve MIAS% 23 duyarlı enflamatuar bir çorba (IS), kendi açık alanları arasında kısa maruz kaldıktan sonra (duyarlı) bulundu 19. Ayrıca, uzun süreli davranış viseral aşırı duyarlılık bağlamında MIAS uzun süreli hassasiyet (en fazla 28 gün) belgelenmiştir (zimosan 21 ya da 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit içinin tedavi uygulanan farelerde, örneğin, (TNBS) 22) .
mechanosensitive afferentlerin, kas ve kas-mukozal afferentleri arasında jove_content "> (yani, streç duyarlı) ve zararlı kolorektal distansiyon 23,24 kodlamasını işine yaramak tonik kolorektumun çevresel streç kodlamak tek sınıflardır. Bir bilgisayar-kontrollü kullanma Zorlamalı tahrik düzeni, biz düzleştirilmiş kolorektal doku çevresel yönde bir standart, homojen ve yeniden üretilebilir bir rampalı streç uygulanan ve streç duyarlı ileticilerin, düşük eşik değeri ve yüksek eşik 23 kategorize. Buna ek olarak, germe sensitizasyon zaman sürecini intrakolonik zimosan 21 veya TNBS 22 tedavisinden sonra -duyarlı afferentleri visseral ağrı ve aşırı duyarlılık streç duyarlı kolorektal aferentlerin bir rolü olduğunu düşündürmektedir, davranışsal visseral aşırı duyarlılık başlangıcı, sebat ve / veya kurtarma karşılık gelir.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu protokol gözden ve Pittsburgh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Modifiye Krebs Çözüm ve Test İlaç Alikot 1. Hazırlık
- 117,9 NaCl, 4,7 KCİ, 25 NaHCO 3, 1.3, NaH 2 PO 4, MgSO 4 1.2, 2.5 CaCl2, 11.1, D-glukoz, 2 sodyum bütirat, 20 sodyum asetat (mM olarak) içeren değiştirilmiş bir Krebs çözeltisi içinde 6 L yapmak 0.004 nifedipin (spontan kas kasılmaları bloke etmek için), ve 0.003 indometasin (endojen prostaglandin sentezini bloke etmek için). Sırasıyla doku diseksiyonu ve tek lif kayıt için buz-soğuk ve sıcak Krebs çözümleri kullanın.
- Herhangi bir kimyasal çözümleri hazırlayın (örn, IS, kapsaisin, ATP) istenen konsantrasyonlarda alikotlarda.
Kolorektumun-sinir Doku 2. Diseksiyon
- Uyutmak ve erkek fareler euthanize (6 - 8 haftalık, 20-30 g)10 yerine geçen bir akış oranında bir CO2 odası - farelerde kadar dakika başına bölme hacminin% 30 göğüs hareketinin olmaması ile gösterildiği gibi tamamen nefes durdurun.
- Hemen sonra, torasik bölme kesmenin sağ atriyum delme ve buz soğukluğunda Krebs geniş bir hacmi (~ 500 mi) fare karkas içine daldırarak ötenazi, asıl bulbus olfaktoryusları aşağıdaki gibidir (4 ° C) bir karbojen (% 95 O2 ile kabarcıklar halinde % 5 CO2).
- Dikkatle tüm iç organları ama kolon ve pelvik organları çıkarın. Biraz göğüs diyafram üzerinde T12 spinal segment boyunca yarısında fare transect ve buz soğuk içeren bir diseksiyon odasına kuyruk yarısını aktarmak, Krebs solüsyonu kabarmış.
- Steromikroskopla, üretraya kavşaklarda transecting ile mesane ve üreme organları kaldırmak ve ortak iliak arterlere üzere iki kola ayrılır kadar inen / abdominal aorta çıkarın. PN veya surroundin gelen LSN Freeg künt diseksiyon ile dokular ve L6 ve S1 vertebra (PN için) sütun veya T13 ve (LSN) L1 vertebra sütuna ventral giriş noktasına kadar iliak dışından sinir izleyin.
- Pubis eklemi ve sağ ve sol asetabuler eklemleri kesin ve iliyak kemiği kaldırmak. Sinir vertebra sütun girdiği yere kadar kolorektal yakın ekli kas ve bağ dokusundan ya PN veya LSN dikkatlice ücretsiz.
- Dikkatle uzak kolorektal maruz iliak kemik rezeksiyonu. Sürekliliğinde bağlı PN veya LSN distal kolorektal parçalara ayır.
- Doku odasının banyo bölmesine bağlı sinir kolorektal aktarın. Daha fazla diseksiyon ile aşırı bağ dokusu çıkarın, ve anti-mezenterik sınırı boyunca uzunlamasına kolorektal açın.
- Yukarı bakacak şekilde mukozal tarafı, Chambe silikon üssü haline kayıt bölmesine bitişik kolorektumun mezenterik kenarını pinR ve bir zorlamalı tahrik düzenine bağlı kanca kesintiye kolorektal antimezenterik uzunluğu bağlamak (Şekil 1 'de gösterilen ve Şekil 2A'da fotoğraflandı).
- Bir fare deliği ve kapısı banyo bölmesi bağlanır kayıt bölmesine, içine PN veya LSN uzatın. Yavaşça sinir uymak için bir hidrofil yüzey sağlar kayıt bölmesi, bir küçük cam ayna üzerine sinir gövde yatıyordu. Sıcak ile banyo bölmesini Superfuse (30-32 ° C), Krebs solüsyonu oksijenli ve mineral yağ ile kayıt bölmesini doldurun.
3. Tek-lif Kayıt ve Alıcı Field lokalizasyonu
- Dikkatle yüksek büyütme (- 60X 50) de stereomicroscope altında PN veya LSN'den epinöriyuma (sinir kılıfı) geri soyma. ~ 100 mikron kalınlığında 8 sinir demetleri - ince forseps kullanarak, 5 içine sinir gövde alay.
- Platin-iridyum başvuru yerleştirindoku bölmesi içinde Krebs çözeltisi ile temas halindeki elektrot. Sıralı aynı malzemeden yapılmış kayıt elektrot üzerine bireysel sinir demetleri yerleştirin.
- Yavaşça yukarı okşayarak tarafından ve kolorektal yüzeye aşağı kolorektal afferentleri gelen AP uyandırmak için yumuşak bir boya fırçası kullanın. Saptanabilir AP (aksiyon potansiyeli) kayıtları ile kolon innerve sinir demeti (ler) bulun.
NOT: PN ve SSN da idrar kesesi ve diğer pelvik organlar innerve. - Ayrıca 10 mikron kalınlığında ~ ince fasikül filamentler içine sinir demeti bölmek ve kayıt elektrot üzerine bireysel bir filamanın yerleştirmek için 30 G iğne uçları bir çift kullanın.
- Elektriksel akım yayılması ~ 2 mm çapındaki üreten suprathreshold uyaran yoğunluğu (10 mA büyüklüğü, 0,3 Hz @ 0,5 msn süre), en afferent sonlar heyecanlandırmak için mukozal yüzeye dik yuvarlak uçlu eş elektrot yerleştirin. Sistematik (~ 1.5 mm adımlarını elektrot Taşı) Düzleşmiş kolorektumun uzunluğu ve genişliği boyunca açık sonlar yerelleştirilmesine.
- Bir afferent biten heyecanlı olduğunda, asgari uyaran yoğunluğunu (uyaran eşik) gerektirir aktivasyon (açık alan, RF) siteyi kesin olarak belirlemek için elektrot konumunu ayarlamak. > 3 mA 19 bir uyarıcı eşik sonlar atın.
- Uyaran parazit ve aksiyon potansiyeli başlangıcı arasındaki iletim hızı 1 (CV)) alıcı alan (RF) en uyarıcı elektrot ve kayıt sitesi ve 2) iletim gecikmesi (örneğin, Şekil 2B arasındaki mesafe) hesaplayın .
Özgeçmiş (m / sn) = uzaklık (mm) / iletim gecikmesi (msn).
Mechanosensitive Kolorektal afferentlerin 4. Fonksiyonel Sınıflandırılması
- Elektriksel stimülasyon ile bir RF bulduktan sonra, RF aşağıdaki üç mekanik uyaranlara geçerlidir:
- Bir Calibra ucu basarak tarama uyaran Davranışted von Frey gibi naylon monofilament (0.4 ve 1 gr gücü) dik düzleştirilmiş kolorektumun üzerinde RF doğru.
- Yavaşça RF küçük bir yüzey kayma gerilmesi oluşturmak için ince bir naylon iplik telinin (10 mg kuvveti) ile kolorektal mukozayı okşayarak tarafından okşayarak uyaran Davranış.
- Rampalı bir germe kuvveti sağlayan bir bilgisayar kontrollü kuvvet aktüatörü kullanılarak çevresel streç Davranış - aşama 2.8 'de tarif edilen kanca tırmık ile kolorektal anti-mezenterik kenarı boyunca çevresel yönde (0 5 mN / sn 170 mN) .
- Serozal olarak, mukozal (sondalama künt sadece cevap) afferentler sınıflandırır kas (çevresel streç cevap ve sondalama künt) kas / mukozal (çevresel streç, mukozal okşayarak cevap ve sondalama künt), ya da, (okşayarak mukoza ve sondalama künt cevap) MIA (üç mekanik uyarıcılara herhangi birine yanıt yok).
- Sadece (mezenterik afferentleri içinZor LSN innervasyon), elektrik stimülasyonu ile seçici aktive mezenter sondalama / mekanik okşayarak kendi alıcı sonlar bulmak için.
- Streç duyarlı afferentleri (kas ve kas-mukozal) için, rampalı streç sırasında ilk AP çağrıştırıyor kuvvet olarak tanımlanan tepki eşiğini belirlemek.
- Serozal afferentlerin için, bilgisayar kontrollü kuvvet aktüatör tarafından yönlendirilen açık alan tarama punktat düzeylerini artan onların yanıtlarını kaydedin.
Alıcı Endings 5. Kimyasal Uygulama / Modülasyon
- Mekanik uyarana bir temel yanıtı kaydedin (yani, rampalı streç, sondalama punktat veya mukozal okşayarak yanıt).
- Coat alt boru (10 mm yüksekliğinde ve 4 x 4 mm 2 kare veya 4 pirinç veya paslanmaz çelikten, - 5 mm çapında) bir parçasının kenar vazelin ve kolorektal üzerinde açık alana üzerine yerleştirin.
- KaldırKimyasal (lar), test edilecek içeren çözeltinin 5 dakika 170 ul - Krebs boru içine çözeltisi ve 3 için açık bir son maruz kalmaktadır.
- Kimyasal uygulama sırasında aferentinin yanıtı Monitör (bazı afferentler kemosensitif vardır).
- Kimyasal işlem sona erdirmek için kimyasal çözeltisi ve boru çıkarın. 4 içinde - 6 dakika, bazal yanıt aynı mekanik uyarana afferent cevabı test.
- Yıkama-out yeterli bir süre (> 15 dk) sonra yeniden mekanik uyaran yeniden uygulayın.
6. Kayıt ve Ayırıcı AP sivri
- 20 kHz akson kaydedilen elektrik sinyallerini dijital ortama aktarmak ve bir bilgisayara verileri kaydetmek. Bir ses monitör ile on-line sinyali izleyin.
- Off-line AP ani analiz ve bireysel başak dalga formları 25 temel bileşen analizi dayalı tek birimleri ayırt.
NOT: Bir rekor inci artık içermelidirbir, iki, kolayca discriminable aktif birimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kurulum, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Bu, bir silikon-kaplı banyo bölmesi ve bitişik bir mineral yağ ile doldurulmuş bölmesine bağlı sinir kolorektal barındıran bir ölçüye doku odasını kapsamaktadır. İki bölmeli odası CNC makinesi ile akrilik plastik bir katı blok işlenmiş edildi; Her iki bölmelerin alt sonradan kolorektal doku aşağı kolay pimini izin firma silikon ile kaplı. Alay sinir liflerinin hücre dışı AP yüksek ortak mod reddetme oranı (CMRR ~ 60 dB) ile düşük-gürültü, pille çalışan diferansiyel amplifikatör kullanarak kaydedilir. yükselticinin kazancı 0,3-10 kHz x10,000 ve bant filtresi aralığına ayarlanır. Kolorektal elektriksel stimülasyonu kolorektal mukozası ile temas halinde olan bir eş elektrot aracılığıyla sabit akım modunda optik bağlanmış stimülatör ile teslim edilir. Mekanik stimülasyonu (kolorektal streç ve sondalama noktasal) ac tarafından teslim edilirkuvvet aktüatörü omputer kontrollü. Bir AD çevirici ve uygun yazılım, mekanik ve elektrik uyaranlar yanı sıra kayıt başlatmak için gerilim komut çıktılarını gönderme ve diferansiyel amplifikatör dışı AP sinyallerini sayısallaştırma hem uyarma ve kayıt işlemlerini denetleyecek. Mekanik ve elektriksel gürültü kaynaklarından izole etmek için, doku odası, mikroskop ve diferansiyel amplifikatör bir pnömatik hava masaya monte edilmiş bir Faraday kafesi içine yerleştirilir.
Şekil 2A'da gösterildiği gibi, bağlı sinir kolorektum, bir fareden dışarı çıkarılır, anti-mezenterik kenarı boyunca kesilerek açılır ve silikon kaplı doku bölmesi içinde düz tutturulmuş; Sinir bitişik kayıt odasında bir cam ayna üzerine yerleştirilir. Eşikte RF elektriksel uyarılara yanıt olarak aksiyon potansiyelinin (AP) bir temsili kayıt Şekil 2B'de olduğu gösterilir. Bu kayıt AP uyaran sanat gerisindeifact (•), iyi bir miyeline olmayan C = fiber aralığında, 0.43 m / saniye olan bir hesaplanmış iletim hızında elde edilen bir kayıt elektrotu RF den iletim gecikme nedeniyle 49 msn, tarafından. (Von Frey gibi tekli lifler, 1 g, ve RF ince mukozal strok 10 mg ile RF tarama) elle verilen uyaranlara ileticisinin tipik tepkileri Şekil 2C olarak gösterilir. Bu rekor, iki kolayca discriminable afferentler içerir; sadece büyük genlik afferent okşayarak tepki verir. Şekil 2D'de gösterildiği gibi, tarama afferent tepkileri ayrıca kolorektal üzerinde aynı bölge için tam zamanlı ve yeniden üretilebilir bir mekanik kuvvetlerin (5, 10, 20, 40 ve 80 mN bir dizi sağlayan bilgisayar kontrollü bir kuvvet çalıştırıcı tarafından değerlendirildi, 5 sn süre). Benzer şekilde, kolorektumun çevresel streç (0 - 5 mN / sn 170 mN) Şekil 2E görüntülenen bir temsilci tepki ile aynı aktüatör tarafından teslim edilir
Şekil 3 'de gösterildiği üzere, kolorektal sinirler, işlevsel olarak üç farklı mekanik uyarıcılara (yukarıdaki adım 4.2) ile tepki profillerine dayanarak, altı sınıfa olarak kategorize edilebilir. Mezenterik afferentlerin dışındaki tüm afferent sonlar elektriksel stimülasyon ile bulunduğu (e-stim, en sol sütunundaki, oklar uyaran artifakı gösterir). Mekanik duyarsız afferentler (MIAS) üç mekanik uyaranlara herhangi yanıt vermez. (- 1.4 g 0.4) tersine, tüm mechanosensitive uçlarının tarama yanıt. Bunların arasında, kas ve kas-mukozal sonlar da çevresel bir streç tarafından aktive edilir (0-170 mN), ve böylece streç duyarlı afferentler denir; kas-mukozal sonlar da (10 mg) okşayarak tarafından aktive edilir. Mukozal sonlar da (10 mg) okşayarak aktive ama germek değil ve serozal sonlar ya streç veya okşayarak tarafından aktif değildir vardır. Mezenterik sonlar mekanik b tarafından tanımlanırmezentere acele.
Şekil 4A görüntülenen 5 dakika ayırarak üç ardışık çevresel uzanıyor tarafından uyarılmış bir streç duyarlı ileticisinden temsilcisi tepkilerdir. başak numaraları eşit üç bidonları içine binned ve hem yanıt büyüklüğü (başak sayısı) ve tepki eşiği yüksek tekrarlanabilirlik açığa Şekil 4B uyaran-tepki fonksiyonları olarak gösterilir.
Bu in vitro kolorektum-sinir hazırlık da alıcı sonlar afferent kimyasalların yerel uygulama izin verir. kimyasallara maruz kalma, fiziksel kolorektumun geri kalanından RF izole etmek kolorektal mukozada tepesinde pirinç veya paslanmaz çelik boru yerleştirerek afferent RF etrafında bölgelere sınırlıdır. Kimyasal uygulaması aşağıdaki tipik sonuçlar şunlardır: asit hipertonik solüsyon başvurusu üzerine afferentleri (AHS 26; Şekil 5A) doğrudan aktivasyonu, hayır inflamatuar çorba uygulamasından sonra MIA tarafından aktivasyon, ancak mechanosensitivity edinimi (19 IS; Şekil 5B), IS uygulaması (Şekil 5C) sonra mekanik streç artan tepki (yani, duyarlılık), ve uygulamadan sonra mekanik streç indirgenmiş tepki cGMP (Şekil 5D).
Deney düzeneği Şekil 1. şematik gösterimi. Kolorektum-sinir iki bölmeli doku odasına yerleştirilen ve bir Faraday kafesi ile diğer elektronik cihazların diferansiyel amplifikatör kafa sahnede birlikte izole edilir. Her afferent RF üç mekanik uyaranlarla kolorektumun elektrik stimülasyonu (e-stim) tarafından tanımlanan ve test edilir: naylon monofilament sondalama, mukozal okşayarak, ve çevresel streç. ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52310/52310fig1highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 2. bağlı pelvik sinirin (A) disseke kolorektumun stereo aracılığıyla bir görüntü B -. E temsilcisi kayıtları gösterir. (B) bir eylem potansiyeli (AP) elektriksel stimülasyon ile uyarılmış (uyaran artifakı, •). (C) Tipik tepkiler monofilament sondalama ve mukozal okşayarak tutulan, el için. (D, E) sondalama ve bilgisayar kontrollü kuvvet aktüatör tarafından teslim çevresel streç Cevapları, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kolorektal afferent sınıfların Şekil 3. Fonksiyonel karakterizasyonu. Afferentleri elektrik stimülasyonu (e-stim, ↑) kolorektumun bulunan ve beş mechanosensitive sınıflara kategorize ve bir mekanik-duyarsız afferent (MIA) sınıfı üç kendi cevap profillerine dayanmaktadır mekanik uyaranlara:. sondalama, okşayarak, ve streç bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Tekrarlanabilir, bilgisayar kontrollü mekanik stimülasyonu Şekil 4. Afferent yanıtları. (A) kas-mukozal a Cevapları(-; 5 dk arası uyaran aralığı 5 mN / sn 170 mN 0) ardışık üç fferent uzanır rampalı. (B) Cevapları (aksiyon potansiyeli sivri) eşit üç kutuları (- 57, 57-113, ve 113 - 0 170 mN) içine binned ve uyarıcı-tepki fonksiyonları olarak görüntülenen; tepki eşiği içerlek görüntülenir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Uçları dururlar lokalize kimyasal uygulamaya Şekil 5. afferent tepkilerine neden olur. (A), asidik hipertonik çözelti (AHS) ının uygulanmasından önce bir serozal ileticisinin duyarlılığında bir örnek. Biten bir MIA (B) mechanosensitivity (sensitizasyon) edinimi bir örnek. Bu MIA doğrudan yanıt vermediinflamatuvar çorbası (IS), ancak daha sonra sondalama 1.4 gr monofilament yanıt verdi. (C) Hassasiyet (tepki büyüklüğü ve tepki eşiği azalma artış) onun IS biten maruz kaldıktan sonra bir kas aferentinin germek için. Cevap (D) Zayıflama siklik guanozin monofosfat (cGMP) olan biten maruz kaldıktan sonra bir kas-mukozal afferent ile uzatılacak. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen in vitro kolorektum-sinir hazırlık güzel visseral duyusal nöronlar diğer fonksiyonel olmayan yaklaşımlar (örn, hücresel, moleküler ve histolojik çalışmalar) tamamlar bireysel kolorektal aferentlerin, nöral kodlama işlevlerini (çalışmak için güçlü bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır ) Detaylar için gözden 27. bkz. Nosisepsiyon ve uzun vadeli kolorektal aşırı duyarlılık katkıda Nöronal mekanizmalar ortaya konmuştur ve farmakolojik manipülasyonlar visseral ağrı hafifletmek olabilir ortaya hedefleri olduğunu yapılmıştır. Bu hazırlık başarılı bir şekilde uygulanması ile ilgili aşağıdaki önemli noktalar aşağıda ele alınmıştır: elektriksel gürültü 1) azalma, sinyal tespiti 2) artış ve afferent kodlama değişiklikleri değerlendirmek için bir standart uyaran 3) seçimi. Buna ek olarak, bu tekniğin bazı sınırlamalar tartışılmıştır.
Aksiyon potansiyelleri (AP) propagati130 mV - ng hücre sinir boyunca aksonlar genellikle 100 bir zar potansiyeline sahip. Ancak, akson zarında küçük spesifik kapasitansı, bu nispeten büyük depolarizasyon sadece kolay bir elektrik empedans oldukça düşük olan (çevreleyen hücre dışı doku / interstisyel sıvıya dağıtmak hücre zarından küçük bir elektrik yükü deplasman, neden lipid membranı daha az). Sinir filamentler / aksonlardan dışı kayıt için, elektrik sinyali Başarılı kayıt için noise azaltma öncelik render, tipik bir biyoelektrik kayıt kurulumu ile ilgili termal / beyaz gürültü büyüklüğüne yakın mikrovolt, aralığında genellikle. En etkili ortam elektriksel gürültü izole etmek, doku odası, kayıt ve topraklama elektrotları, diferansiyel amplifikatör (DC akü ile çalışan) ve bir Faraday kafesi içinde Stereomikroskopta yerleştirmek için yardımcı olabilir. Eğer hareket artefakts mekanik titreşim yararlı kırmak için bir pnömatik hava masaya Faraday kafesi yerleştirerek, ortaya çıkar. İdeal olarak, "+" ve butonu kayıt ve referans elektrotlar "-" diferansiyel amplifikatör limanlarını, sırasıyla, onların ortak bir zemin karşılaştırılabilir empedans göreceli olmalı ve birbirine yakın yer. Böylece, herhangi bir dış gürültü her iki elektrot tarafından eşit hakkında kaydedilen ve diferansiyel amplifikatör ile sıkı ortak mod ret tabi olacaktır.
Kayıt elektrot önemli empedans ince bir sinir filament ile temas içinde iken, bizim kurulum (Şekil 2A) 'de, referans elektrotu doku bölmesi Krebs perfüzyon çözeltisi içine daldırılmaktadır. Nontrivial empedans uyumsuzluğu ile bu tek elektrot yapılandırma gürültü azaltımı için genellikle ideal değildir. Ancak, bu yapılandırma sadece bir elektrikli üzerine ince sinir filamanın yerleştirerek kolaylık sunuyor(- 15 mm 10) sınırlı uzunlukta fare kolorektal sinir filamentlerinden kayıt yaparken özellikle çekici kaside. Tepe-tepe arka plan gürültü kayıtlarında 20 uV altında olduğunda bizim deneyim dayanarak, tek elektrot konfigürasyonu kabul edilebilir. Aksi takdirde, daha gürültü azaltma ince sinir lif birbirine paralel yerleştirilen hem kayıt ve referans elektrot ile temas halinde olması sahip olduğu iki elektrot kayıt yapılandırmasını talep ediyorum. Faraday kafesi içindeki tüm büyük metal parçaları tek bir ortak zemin, bizim kurulumunda bir bakır bloğu bir yıldız gibi bir şekilde topraklı olması gerekir. Bakım zemin döngüler oluşumunu önlemek için alınacak vardır.
AP dışı algılama sağlamak için, ilk adım kolorektum-sinir dokusunun başarılı diseksiyon olduğunu. Tutma veya geri dönüşümsüz sinir hasar ve AP iletimini etkiler, hangi diseksiyonu sırasında sinir kaçınılmalıdır çekerek. disseke sinir kök ayrıca t ihtiyacıo bozuk ve depolarizasyon sinir iletimini bloke zaman potasyum sızdırıyor herhangi bir bağlı kas dokusu, özgür olmak. Bu diseksiyon beceri genellikle aylar haftalar boyunca gayretli uygulama yoluyla edinilen ve taşıma ve cerrahi aletler kullanarak el-göz koordinasyonu ve el becerisi yüksek düzeyde talep edilir. Buna ek olarak, kolorektal dokuya zarar görmesini önlemek için, elektrik arama stratejisi künt, yuvarlatılmış uçlu ve göreceli olarak büyük bir çapa (dış Φ0.55 mm, iç Φ0.125 mm) ve bir mikromanipülatör bağlı olan eş merkezli bir elektrot kullanır mütevazı bir mekanik kuvvet sonuçlanan bir uyumlu köprü, mukoza yüzeyi (~ 100 mg) uygulanır. Kayıt izlemesinde büyük bir sinyal elde etmek için, AP-kaynaklı transmembran akımı kanalize edilmesi gereken ve sinir akson (ler) ve elektrot yüzeyi arasında küçük bir empedans köprü oluşturarak elektrot üzerinde "tuzak". Izole Böylece, epinöriyuma ve perinevreSinir 10 um kalınlığında ~ ince filamanlar halinde sinir bölme işlemi sırasında serbest kesilmiştir gerekir. AP-bağlı zar akımı akson zarının kısa bir mesafede önemli ölçüde dağılır için, ince bir sinir lif genellikle, elektrot yüzeyine akson daha yakın için daha iyi bir sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanır. Mineral yağ odasında, sinir, genellikle üzerine yerleştirilmiş olan ayna, Krebs çözeltisi (cam yüzeyi hidrofilik olduğu) ince bir tabaka çekmektedir. Bu kayıt elektrot ve sinir lif çekimi sırasında ayna yüzeyi ile temas halinde olmadığı ve böylece gereklidir. Elektrot ve ayna yüzeyi arasında düşük empedanslı köprü sağlamak Krebs çözeltisi herhangi bir kalıntı damlacıkları, (yani, şant) anlamlı kayıtlarında sinyal genliği azaltacaktır.
Açığa sonra bu kolorektum-sinir hazırlık afferentlerin fonksiyonel değişikliklerin çalışma izinKimyasal aracılar ve in vitro olarak bir sıvının çeşitli hem de uzun dönem Patofizyolojik koşullar bağlamında RFS (örneğin, önceden muamele edilmiş farelerden alınan colorectums). Yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik ve 2) sağlam ve tekrarlanabilir afferent yanıtları 1) standardize uyarıcının: afferentlerin fonksiyonel değişikliklerin objektif bir ölçüsü aşağıdaki bağlıdır. RF uyaranlara sondalama ve okşayarak kolorektumun uygulanan üç mekanik uyaranlara, genellikle el von Frey gibi monofilamanlann tarafından teslim edilir. Sondalama için, monofilament genellikle eğilme zaman tekrarlanabilir dik kuvvet teslim kalibre edilir. Kolorektal yüzey (124.8 kPa 0.4 g ve dik olarak uygulanmış, ancak, bir von Frey benzeri monofilamanlar (0.4 ve 1 g), yüksek Nominal strese neden olan küçük ve farklı enine kesit çapı (0.2 ve 0.3 mm, sırasıyla) sahiptir 1 g için 138.7 kPa), yoğun, noktasal mekanik uyaran beyonNormal fizyolojik aralığı d. Ayrıca, filamanın keskin kenar muhtemelen anma stres (stres konsantrasyonu) önemli ölçüde daha yüksek odak zirve stres gerilmelerin dağılımı dengesiz olur. Tipik bir RF boyutu (1 ila 2 mm) bir monofilin kesitinin ve yeniden üretilebilir bir el monofilament ile aynı siteyi uyarma yetersizlik önemli ölçüde daha büyük olduğu göz önüne alınırsa, bu farklı tekrar uyarılara tepkiler dikkate yaygındır önemli ölçüde AP sıklığı ve süresi. Bir örnek olarak, muhtemelen bir yetersizlik ile katkıda bulunur önemli ölçüde değişebilir, aynı el monofilament (1 gr) ile Şekil 2C'de gösterildiği sondalama yanıtlar yeniden üretilebilir ardışık uyaran arasındaki özdeş sitesi ve değişken süresi ve aralığını araştırmak için. Mukoza, elde tutulan bir filament tarafından teslim okşayarak Benzer zordur ve aynı ileticisinden değişken yanıtı ortaya eğilimindedir. Uyaran uyarlık olabilirsondalama hassas (ve streç) güçleri sunmak için bilgisayar kontrollü kuvvet çalıştırıcıyı kullanarak geliştirilebilir. Tarama için, daha büyük bir çapı olan bir tekli lif kullanılması (örneğin, # 6.45, 1 mm) daha tam bir şekilde, tipik bir içeri götüren RF 24,28 kapsamaktadır. Bilgisayar kontrollü çevresel gerilmeli, RF yönelik diğer doku germe yaklaşımın aksine, mümkün kılar, kolorektal uzunluğu boyunca homojen deformasyon sağlar benzer çember boyunca mekanik strese (yani, 0 dayalı orijinal silindirik bir düzenleme kolorektal gerilmenin ile korelasyon - 45 mm Hg intraluminal basıncı 23) - 170 mN streç 0 eşdeğerdir. Streç gücü, anti-mezenterik kenarında eşit uygulanır yana, doğrudan RF, afferent RF uyarılmış yerel mekanik stres streç ardışık uygulamalar arasında tekrarlanabilir. Ek olarak, L tipi Ca2 + kanal blokaj maddesinin nifedipin i banyoya ilavenhibit spontan düz kas kasılması, rampalı streç testleri 23 arasında kolorektal uyum bakım katkıda bulunmaktadır. Son olarak, Rampalı streç protokolü afferent yanıtları uyaran-tepki fonksiyonu ve tepki eşiği hem küçük değişkenlik tekrarlanabilir olduğu kanıtlanmıştır (örn, Şekil 4). Bu durumda, eğimli bir esneme afferent tepkileri geniş çapta bir iç organ ağrısı ve aşırı duyarlılık (ör 19-22,24,26,28-31) nöronal mekanizmalar üzerinde çalışmaya içeri götüren fonksiyonunun değişikliklerin amacı, değerlendirme olarak kullanılmıştır.
kolorektum-sinir hazırlık kolorektal visseral afferent çalışma için güçlü bir araçtır. Ancak, aynı zamanda bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, sırt kök gangliyonu sensor nöronları hücre gövdeleri aksonları moleküler bu hücre gövdeleri kimlikleri (örneğin, tek bir hücre için RT-PCR veya tr çalışma engelleyen, hazırlanmasında nakledilmiş olankolorektal aferentlerin farklı sınıflar) anscriptome analizi. İkincisi, tek-lif kayıt düşük sinyal-gürültü oranı önemli ölçüde diğer laboratuvarlarda bu protokolün geniş uygulama sınırlayıcı, optimal cerrahi diseksiyon / sinir bölme beceri ve düşük gürültü kayıt gerektirir. Üçüncü olarak, bu in vitro hazırlık böyle otonom sinir sistemi, hormonlar ve sitokinler, bağırsak Mikrobiyota dolaşan ve merkezi sinir sisteminden modülasyonu inen olarak visseral hissi modüle sistemik faktörlerin soruşturma için geçerli olmayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Forceps with fine tips |
References
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
- Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
- Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
- Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
- Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
- Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
- Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
- Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
- McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
- Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
- Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
- Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
- Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
- Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
- Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
- Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
- Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
- Jolliffe, I. T. Principal component analysis. , 2nd, Springer. New York, NY. (2002).
- La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
- Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
- Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
- Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
- Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
- Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).
