В пробирке функциональные характеристики мыши колоректального афферентных окончаний
Summary
This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Abstract
Это видео демонстрирует подробно об одноволоконного электрофизиологические протокол записи в пробирке с использованием препарата мыши colorectum нерва. Подход позволяет объективную идентификацию функциональная характеристика отдельных колоректального афферентов. Внеклеточные записи, распространяющихся потенциалов действия (AP), которые происходят из одного или нескольких афферентных (то есть, один-волокно) рецептивные поля (RFS) в colorectum изготавливаются из дразнили пучков нервных волокон. Colorectum удаляется либо малого таза (PN) или поясничного висцеральный (LSN) нерва прилагается и открыл в продольном направлении. Ткань помещают в камеру записи, закреплен плоский и перфузию кислородом раствором Кребса. Фокусное электрическая стимуляция используется для поиска колоректального афферентные окончания, которые затем были три различных механических раздражителей (тупой зондирования, поглаживание слизистой оболочки и окружающей Stretch) функционально классифицировать афферентные волокна на пять mechanosensiтивные занятия. Окончания отвечая ни на один из этих механических раздражителей классифицируются как механически, нечувствительных афферентов (ММАС). И механочувствительных и пропавших без вести может быть оценена для сенсибилизации (т.е. увеличенная реакция, снижение порога, и / или приобретения механоре-) локализованной воздействия ФР химических веществ (например, воспалительные суп (IS), капсаицин, аденозинтрифосфата (АТФ)). Мы описываем оборудование и colorectum нерва подготовку записи, урожай colorectum с прикрепленным PN или LSN, выявление ФР в colorectum, записи одноволоконного от нервных пучков, а также локализованных применение химических препаратов в РФ. Кроме того, также обсуждаются проблемы, связанные с подготовкой и применением стандартного механического раздражения.
Introduction
Боль и гиперчувствительность являются преобладающими жалобы больных, страдающих от функциональных желудочно-кишечных расстройств, в том числе синдром раздраженного кишечника (IBS), которые существуют в отсутствие видимых pathobiological причины или повреждение ткани. Например, пациенты с СРК проявляют гиперчувствительность, в том числе повышенная ответов на прямой воздушный шар живота и повышенной чувствительности при нормальной функции кишечника, а также гиперчувствительность соматической направления (т.е., болезненность при пальпации брюшной области) 1. Потому что таргетинг колоректального афференты уже доказали свою эффективность в борьбе с болью и повышенной чувствительности у пациентов с СРК (например, внутри прямой кишки введение местных анестетиков 2,3; перорального приема в гуанилатциклазы-C агониста linaclotide 4-6), улучшение понимания афферентные иннервации colorectum важно.
Visceral афференты, в том числе колоректального афферентов, Способны реагировать с химическими / питательными веществами и тепловых условий (например, 7-9). Тем не менее, висцеральные афферентные отвечая на механических раздражителей (то есть, механочувствительных афферентов) были наиболее тщательно изучены, поскольку механические раздражители (например, просвета живота, растяжки) являются те, которые обычно приводят к сознательным ощущений, в том числе дискомфорта и боли 10-16. Кроме того, внутренние органы также иннервируются механически нечувствительных афферентов (ММАС), обычно называют молчание или спящих ноцицепторов 17. В нормальных физиологических условиях, без вести пропавших не реагируют на механическое раздражение или очень высокий отклик пороги 18, но может стать активным и приобрести механоре- в патофизиологических условиях и способствовать гиперчувствительности.
Использование препарата в пробирке и описанные здесь протокол, мы разработали и использовали электрический стратегию стимулирования к морю RCH для восприимчивых окончаний, позволяющих объективную идентификацию как механочувствительных и МВД окончаний в colorectum 19. Колоректальный иннервации происходит от поясничного Висцеральные (LSN) и органов малого таза нерва (PN) путей, и включает в себя колоректального афференты, которые могут быть разделены на пять механочувствительных классов (серозный, слизистой, мышечной, опорно-слизистой оболочки, брыжейки) и одной МВД класса 20. Использование этого препарата в пробирке, мы обнаружили, что колоректальный пропавшим без вести приобрел механоре- (информирования) после кратковременного воздействия их рецептивных полей воспалительной суп (IS), которая сенсибилизированной 71% пропавших без вести в пути PN и 23% пропавших без вести в пути LSN 19. Мы также документально долговременной сенситизации (до 28 дней) пропавших без вести в контексте длительной поведенческой висцеральной гиперчувствительности (т.е., у мышей, получавших внутритолстокишечным лечения зимозаном 21 или 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (TNBS) 22) ,
jove_content "> Среди механочувствительных афферентов, мышечной и опорно-слизистых афферентов являются единственными классы, которые монотонно кодируют по окружности участке colorectum (то есть, являются стретч-чувствительный) и subserve кодировку вредных колоректального растяжения 23,24. Использование компьютерным управлением сила привода, мы применили стандартный однородную и воспроизводимые увеличили напряжение в окружном направлении уплощенной колоректального ткани и далее подразделяются стретч-чувствительный афферентов как низкий порог и высокое пороговое значение 23. Кроме того, временной ход сенсибилизации участке чувствительными к афференты после внутритолстокишечным зимозан 21 или TNBS 22 обработки соответствует началу, настойчивость и / или восстановления поведенческой висцеральной гиперчувствительности, что указывает на роль стретч-чувствительный колоректального афферентов в висцеральной боли и повышенной чувствительности.Protocol
Representative Results
Discussion
Пробирке подготовка colorectum нерва в описанной здесь оказался мощным подход к изучению нейронных функции кодирования отдельных колоректального афферентов, которые прекрасно дополняет другие нефункциональные подходы (например, клеточном, молекулярном и гистологические ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |
References
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
- Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
- Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
- Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
- Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
- Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
- Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
- Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
- McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
- Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig’s ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
- Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
- Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
- Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
- Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
- Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
- Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
- Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
- Jolliffe, I. T. . Principal component analysis. , (2002).
- La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
- Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
- Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
- Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
- Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
- Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).
